Method Article

3D細胞培養のための微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御(英語)

DOI:

10.3791/64554

⸱

October 28th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Departments of Biomedical Engineering, Neurology, and Dermatology, Duke University

In This Article

Summary

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粒状足場内の粒子画分のばらつきを最小限に抑えることで、再現性のある実験が容易になります。この研究では、 in vitro 組織工学アプリケーション向けに、制御された粒子画分を使用して粒状足場を生成する方法について説明します。

Abstract

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ミクロゲルは、微多孔性アニール粒子(MAP)足場の構成要素であり、in vitro 細胞培養と in vivo 組織修復の両方のプラットフォームとして機能します。これらの顆粒状足場では、ミクロゲル間の空隙空間によって生成される生来の多孔性により、細胞の浸潤と遊走が可能になります。空隙率は細胞の生理活性の手がかりであるため、空隙率と粒子画分を制御することはMAP足場の設計にとって重要です。球状ミクロゲルは、制御されたサイズおよび形状のためにマイクロ流体デバイス上で生成し、続いてポリマーネットワークの破砕を防止する方法を用いて凍結乾燥することができる。再水和すると、凍結乾燥されたミクロゲルはMAP足場に制御された粒子画分をもたらす。ミクロゲル凍結乾燥のためのこれらの方法の実施は、高分子拡散および細胞拡散に対する粒子画分の効果を示す再現性のある研究につながった。次のプロトコルは、MAP足場内の粒子画分を制御するためのミクロゲルの製造、凍結乾燥、および再水和、およびin vitroでの3D細胞培養のためのバイオ直交架橋によるミクロゲルのアニーリングをカバーします。

Introduction

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微多孔性アニール粒子(MAP)足場は、ミクロゲル(μgel)ビルディングブロックが相互結合してバルクの多孔質足場を形成する粒状材料のサブクラスです。これらの顆粒状スキャフォールドのユニークなマイクロアーキテクチャにより、連結された球状ミクロゲル間の空隙空間によって生成される生来の多孔性は、加速された細胞浸潤と遊走をサポートします1。MAP足場のミクロゲルビルディングブロックは、化学修飾された合成ポリマーと天然ポリマーの両方から製造できます2。ここで説明する方法は、官能性ノルボルネン(NB)ハンドルで修飾されたヒアルロン酸(HA)骨格からなるミクロゲルの使用を特に強調している。HAポリマーのNB機能ハンドルは、ミクロゲルを形成し、それらを結合してMAP足場を生成するためのクリック化学反応をサポートします3,4。ミクロゲルを一緒に連結(すなわち、アニーリング)するために、酵素1、光ベースの5,6、および無添加クリックケミストリー3,7反応などの多数のスキームが採用され....

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Protocol

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1. マイクロ流体デバイスの作製

  1. ソフトリソグラフィ
    注:このプロトコルは、de Wilsonらによるフローフォーカシングマイクロ流体デバイス設計のデバイス製造について説明しています9。ただし、このプロトコルは、SU-8ウェーハ上の任意のデバイス設計で使用できます。ウェーハはペトリ皿にテープで留めることができ、次いで、PDMSのウェーハ特徴15への付着を防ぐためにシラン化する必要がある。
    1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマーベースと硬化剤( 材料表を参照)を10:1の比率で混合します。ウェーハを~5mmのPDMSで覆うために約100gを準備します。PDMS混合物をウェーハに注ぎ、デシケーターで約30分間脱気します。すべての気泡がなくなったら、60°Cのオーブンに少なくとも2時間入れてPDMSを硬化させます。
    2. ナイフを使用して、ウェーハにひびが入ることなくデバイスのパラメーターの周りをそっとトレースします。次に、PDMSをウェーハから慎重に剥がします。1 mmの生検パンチ( 材料表を参照)を使用して、入口と出口のチャネルを作成します。
      注意: マイクロ流体デバイスを打ち抜くときは優しくしてください。入口または出口チャネルの周りの裂け目または裂け目は、ミクロゲル製....

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Results

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このプロトコルの目的は、生体直交架橋スキームを使用した微多孔性アニーリング粒子(MAP)スキャフォールドの調製と、3D細胞培養用の制御された粒子画分を実証することです。まず、HAをノルボルネンペンダント基で修飾し、ミクロゲル形成とインターリンクの両方を使用してMAP足場を形成しました。これらの方法を使用して、HAリピートユニットの約31%がノルボルネン官能的ハンドルで首尾よく修飾されました(図1A)。フローフォーカシング領域(図1B)を持つマイクロ流体デバイスは、直径~50 μmまたは~100 μmのHA-NBμgelを生成することが示されました(図1C、D)。この作業の残りの部分で使用されたμgelの平均直径は92 μm(Q1 = 79 μm、Q3 = 103 μm)でした(図1E)。

粒子画分を制御するために.......

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Discussion

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HA−NBミクロゲルのマイクロ流体生産は、エマルジョンバッチ生産よりも狭い範囲のサイズ分布を有するミクロゲルを生成することが示されている3、9。このプロトコルに記載されているミクロゲルは、材料分解をサポートするためにMMP切断可能な架橋剤(Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)を使用して処方されました。しかしながら、HA−NBミクロゲルは、非分解性であるジチオスレイトール(DTT)などの代替ジチオールリンカーを用いて架橋することもできる。同様に、イルガキュア2959 2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンなどの他の光開始剤を、チオール−エン架橋を促進するためにLAPの代わりにHA−NB前駆体中で使用することができる10。これらのミクロゲルは、3.5重量%の前駆体溶液の粘度がマイクロ流体プラットフォーム上の液滴に挟み込むのに適していることを実証した以前の研究に基.......

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Disclosures

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ARAとTSは、この技術に関する仮特許を申請しています。

Acknowledgements

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著者らは、国立衛生研究所、国立神経障害および脳卒中研究所(1R01NS112940、1R01NS079691、R01NS094599)、および国立アレルギー感染症研究所(1R01AI152568)に感謝の意を表したい。この作業の一部は、全米ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ(NNCI)の一部として国立科学財団(賞番号ECCS-2025064)によってサポートされているノースカロライナリサーチトライアングルナノテクノロジーネットワーク(RTNN)のメンバーであるデューク大学共有材料計装施設(SMIF)で実施されました。著者らは、細胞培養実験用の3Dプリントデバイスの生成を支援してくれたラボの元ポスドクであるルーカスシルマー博士とイーサンニックロウに感謝したいと思います。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-Lokシリンジ滅菌済み、単回使用、ポリカーボネートBD309628
5 mL Luer-Lokシリンジ滅菌済み、単回使用、ポリカーボネートBD309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimideInvitrogenA10254蛍光標識テトラジンの合成用
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogenA22287細胞培養サンプルの染色用
アルミホイルVWR89107-726
プランジャー付き生検パンチ、1.0 mmIntegra Miltex69031-01
検パンチ、4 mmIntegra Miltex33-34
鈍針、23 G 0.5 インチ、非滅菌、キャップ付きSAI Infusion TechnologiesB23-50
ボトルトップ真空フィルター、0.22 μmCorningCLS430521
塩化カルシウムVWR1B1110マイクロゲル洗浄バッファー用
容積式ピペット用キャピラリーピストンアセンブリ、1000 μL 最大容量レイニン17008609
容積式ピペット用キャピラリーピストンアセンブリ、25 μL 最大容量レイニン17008605
容積式ピペット用キャピラリーピストンアッセンブリー, 250 μL 最大容量レイニン17008608
Countess セルカウンティングチャンバースライドInvitrogenC10228
Countess II FL Automated Cell CounterInvitrogenAMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mLCELLTREAT667015B
Centrifuge tube, 50 mLCELLTREAT229421
Chloroform, ACS grade, ガラス瓶Stellar ScientificCP-C7304蛍光標識テトラジンの合成
用 コロナプラズマガン、BD-10A 高周波発生器ETP11011
クライオチューブバイアル、ポリプロピレン、スクリューキャップ付きめねじNunc368632
D1マウス間葉系細胞ATCCCRL-12424MAPゲルでの培養のための細胞株の例
DAPIでSigma-AldrichD9542細胞培養サンプルの染色用
酸化重水素、99.9 atom% DSigma-Aldrich151882NMR分光法用
透析チューブ、再生セルロース膜、12-14 kDa分子量カットオフSpectra/Por132703HA-NBおよびHA-Tet
ジエチルエーテルの精製用 VWRBDH1121-4LPC蛍光標識テトラジンの合成用
ジメチルホルムアミドSigma-Aldrich277056蛍光標識テトラジン
4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド(DMTMM)の合成用 TCI-ChemicalsD2919HA
ジチオスレイトール(DTT)Thermo ScientificR0861非分解性ジチオールリンカー(MMP切断ペプチドの代替品)
ダルベッコの修飾イーグルス培地(DMEM)、高グルコース、w / 4500 mg / Lグルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および重炭酸ナトリウム、液体、滅菌ろ過、細胞培養に適していますSigma-AldrichD6429-500MLD1用細胞培養
EMS パラホルムアルデヒド、顆粒VWR100504-1624% PFA
エタノール絶対 (200 プルーフ)KOPTEC89234-850
ウシ胎児血清 (FBS)ATCC30-2020D1 細胞培養用
加熱プレートKopf InstrumentsHP-4M
血球計算盤 カバーガラス付きダイガーサイエンティフィック
2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸(HEPES)Sigma-AldrichH3375
アルロン酸ナトリウム、平均分子量79 kDa、細菌Streptococcus zooepidemicus、医薬品グレード、微生物汚染で産生 <100 CFU/g、細菌性エンドトキシン ContiproN/A79 kDaの平均分子量を使用しましたが、これらの方法は他の分子量にも適用できます。
IMARIS Essentials ソフトウェアパッケージオックスフォード・インスツルメンツN/A顕微鏡画像解析ソフトウェア
輸液ポンプ、デュアルシリンジChemyxN/A
KimwipeKimberly-Clark34120
サポートラボ用スタンド ラボ用クランプGeyer212100
液体窒素エアガスNI 180LT22
リチウムフェニル(2,4,6-トリメチルベンゾイル)ホスフィン酸TCI-ChemicalsL0290
凍結乾燥機LabconcoN / ALabconco FreeZone 6 plusは製造中止になりましたが、このプロトコルには他のラボグレードのコンソール凍結乾燥機を使用することができます。
メチルテトラジン-PEG4-マレイミドケラファストFCC210蛍光標識テトラジン
2-(4-モルフォリノ)エタンスルホン酸 (MES)ッシャーサイエンティフィックBP300-100HA
マイクロカバーガラス、24 x 60 mm No. 1VWR48393-106
マイクロ流体デバイス SU8 マスターウェーハFlowJemカスタムデザイン 社内でクリーンルームまたはアウトソーシング
鉱物油、重いSigma-Aldrich330760
MMP切断可能なジチオール架橋剤ペプチド (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)GenScriptN/A
5-Norbornene-2-methylamineTCI-Chemicals95-10-3HA-NB synthesis
パッキングテープスコッチ3M 1426
パラフィルムBemisPM996
PEG(チオール)2JenKem Technology USAA4001-1蛍光標識テトラジン
ペニシリン-ストレプトマイシンの合成用、10,000 units/mLサーモフィッシャーサイエンティフィック15140122D1細胞培養用
ペトリ皿、ポリスチレン、使い捨て、直径 x H=150 x 15 mmコーニング351058
プルロニック F-127Sigma-AldrichP2443HMPの洗浄用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 1xGibco10010023
RainX 撥水ガラス処理グレインジャー465D20マイクロ流体デバイス治療用合成疎水性処理溶液
RGDペプチド (Ac-RGDSPGERCG-NH2)GenScriptN/A
ゴムバンドステープルズ112417
塩化ナトリウムChem-Impex30070透析用
Span 80 合成用Sigma-Aldrich1338-43-8
Sylgard 184 シリコーンエラストマー電子顕微鏡 科学4019862ポリジメチルシロキサン (PDMS) エラストマー マイクロ流体デバイスおよび組織培養デバイスを作るための
シリンジフィルター, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES、直径13 mmCytvia09-928-066
Tetraview LCDデジタル顕微鏡Celestron44347
テトラジンアミンHCl塩Chem-Impex35098HA-Tet合成用
トリエチルアミンSigma-Aldrich471283蛍光標識テトラジンの合成用
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)ミリポアシグマ51805-45-9
Triton X-100VWR97063-864
トリパン ブルー 溶液、0.4%サーモ フィッシャー サイエンティフィ15250061
トリプシン EDTA (0.25%)、フェノール レッドフィッシャー サイエンティフィ25-200-056接着細胞を MAP ゲルのシードに持ち上げ
タイゴン ND-100-80 非 DEHP 医療用チューブ、ニードル ゲージ = 23、壁の厚さ = 0.020 インチ、内径 = 0.020、外側直径= 0.060 ThomasScientific1204G82
UV硬化システムコントローラー、LX500 LED オムニキュア010-00369R
UV硬化ヘッド、LEDスポットUVオムニキュアN/A
紫外線露出計、トレーサブルVWR61161-386
真空デシケーターBel-Art08-594-15C
X-Acto Z シリーズ 精密ユーティリティナイフエルマーズXZ3601W
生を修飾するためEF16034Fヒ の合成用フィック ック るため

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A.

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