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方法論記事

坐骨神経部分結紮術:新規治療法の抗侵害受容効果を研究するための慢性神経因性疼痛のマウスモデル

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DOI:

10.3791/64555

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2022年10月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, College of Medicine, The University of Arizona, Tucson, 2Department of Anesthesiology, College of Medicine, The University of Arizona, Tucson, 3Neuroscience Graduate Interdisciplinary Program, College of Medicine, The University of Arizona, Tucson, 4Comprehensive Pain and Addiction Center, The University of Arizona, Tucson, 5Department of Anesthesiology and Pain Management, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

部分的な坐骨神経結紮は、熱的および機械的刺激に対する誇張された反応を特徴とする、長期にわたる慢性神経因性疼痛を誘発する。神経因性疼痛のこのマウスモデルは、疼痛管理のための革新的な治療法を研究するために一般的に使用されています。この記事では、標準化と再現性を向上させるための外科的手順について詳しく説明します。

要約

慢性疼痛の管理は今日まで困難であり、現在の治療法は耐性や依存症などの副作用に関連しています。慢性神経因性疼痛は、体性感覚系の病変または疾患に起因します。副作用の少ない潜在的な治療法を調査するために、動物疼痛モデルは前臨床試験のゴールドスタンダードです。したがって、十分に特徴付けられ、よく記述されたモデルは、革新的な治療法の開発と検証に不可欠です。

坐骨神経の部分結紮(pSNL)は、マウスに慢性神経因性疼痛を誘発する手順であり、機械的および熱過敏症、継続的な痛み、および四肢の温度の変化を特徴とするため、このモデルは神経因性疼痛を前臨床的に研究するのに最適です。pSNLは、神経因性疼痛を有するヒトに観察される多くの症状を再現するため、神経因性疼痛を研究するための有利なモデルである。さらに、外科的処置は比較的速く、簡単に実行できます。片肢の片側pSNLは、同側足と対側足の比較、および中枢感作の評価を可能にします。

慢性神経因性過敏症を誘発するために、9-0非吸収性ナイロン糸を使用して坐骨神経の背側3分の1を結紮します。この記事では、外科的処置について説明し、一般的に使用される複数の行動検査を通じて慢性神経因性疼痛の発症を特徴付けます。慢性疼痛を治療するために多くの革新的な治療法が現在研究されているため、この記事では、標準化のための重要な概念と、神経因性疼痛を誘発するために必要な手術の正確な説明を提供します。

概要

慢性疼痛は世界中で重要な医療問題であり、米国で最も費用のかかる健康問題の1つです。慢性疼痛は、薬理学的モダリティと非薬理学的モダリティの両方が学際的な方法で利用されている場合、より適切に管理されます1。慢性疼痛の管理は困難であり、場合によっては、疼痛を適切に治療しない2。したがって、慢性疼痛管理を改善するには新しい補完的な方法が必要であり、革新的な治療法を研究するには動物モデルが不可欠です。

慢性神経因性疼痛は、糖尿病、感染症、神経圧迫、自己免疫疾患など、体性感覚系の病変や疾患に起因します3。神経因性疼痛は、末梢および中枢の両方の感作メカニズムに依存しており、神経の病変に由来します。この痛みは、触覚および熱誘発痛覚過敏および異痛症の両方、進行中の痛み、および患肢の温度の変化によって特徴付けることができます4。メカニズムをよりよく理解し、新しい治療法を進歩させるために、神経因性疼痛の症状と原因を模倣するためにげっ歯類でいくつかのモデルが開発されました5。例えば、神経因性疼痛は、化学療法剤注射、脊髄神経結紮術(SNL)、坐骨神経の慢性狭窄損傷(CCI)、pSNL、温存神経損傷、坐骨神経切断、および坐骨神経三分割6で誘発することができる。特に、坐骨神経の結紮は、機械的および熱的過敏症、または複合性局所疼痛症候群(CRPS)に特徴的な患肢の温度変化など、ヒトで観察される神経因性疼痛の複数の特徴を再現します7。したがって、このモデルは、慢性神経因性疼痛を誘発するCRPSまたはその他の神経損傷の影響の研究に適しています。このモデルは、1990年にセルツァーによって最初に開発され8、新規鎮痛化合物を調査したり、慢性疼痛の認知効果を評価したりするための疼痛研究で広く使用されています9,10,11,12,13。このモデルは高い再現性を示し、部分結紮は末梢刺激に対する行動応答を保存する6。

現在使用されているモデルの多くには、pSNLでは観察されない欠点があります。CCIモデルは、収縮器のぴったり性に応じて各動物間の損傷の変動性がはるかに高く、解剖術は後足の指を変化させ、モデルを行動分析に適さないものにします6。SNLモデルは、はるかに複雑で長い手術であり、高度な技術スキルを必要とするだけでなく、重度の運動障害のリスクも高くなります3。これらの欠点は、pSNL モデルでは見られません。再現性の容易さ、手術期間の短さ、および術後に見られる運動障害のリスクの低下により、このモデルは末梢神経障害性疼痛の研究に価値があります8,14。それにもかかわらず、部分結紮手順自体は実験者間でばらつきがあり、その結果、結紮された神経線維の数の一貫性が低下します。したがって、手術の詳細を提示することは、研究間の再現性を高めるために重要です。

慢性神経障害を誘発するために、9-0非吸収性ナイロン縫合糸を使用して、坐骨神経の幅の3分の1を結紮します。手術後、熱的および機械的刺激に対する反応は誇張されており、術後1日目から始まり、50日以上続きます8。ここでは、ハーグリーブス、ホットプレート、およびフォンフライフィラメントテストを使用して、熱感度と機械的感度の両方を28日間にわたって評価しました。すべての行動アッセイは、長期にわたる過敏症の一貫性を示しました。このモデルは、モルヒネとイブプロフェンの両方の用量依存的な効果があることが示されており、前臨床疼痛研究に適していることが確認されています。特に、この記事では、「神経ガラスフック」と呼ばれるユニークな手作りのガラスツールの説明について説明します。このツールは、鉗子の代わりに神経を操作し、手術中の意図しない追加の神経損傷を防ぐために使用されます。

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プロトコル

すべての手順は、アリゾナ大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認され、国立衛生研究所の実験動物の使用に関するガイドライン(NIH出版物第80-23号、1966年)に準拠しています。病原体のない成体C57Bl6 / Jマウス(試験時の体重:22〜28 g)は、気候制御された部屋の標準的なビバリウムマウスケージ(ケージあたり5匹)に12時間の明暗サイクルで収容され、食物と水を 自由に利用できました。すべての行動実験は、治療条件を知らされていない実験者によって行われました。

1.ベースライン:機械的感度の尺度

  1. マウスが到着したら、動物施設に1週間慣れさせます。その後、動物を実験者の取り扱いに≥7日間慣れさせる。
  2. マウスを試験室と同じ部屋で、金網上の透明なプレキシグラス箱に入れることにより、試験前に1時間フォンフライ試験装置にマウスを慣れさせる。
  3. 3.61(3.9 mN)フィラメントから始めて、補足表S1に記載されているフォンフレイフィラメントを使用した「上下」法を介してベースライン足の離脱閾値を確立します。
    1. 一連の較正された微細(von Frey)モノフィラメントで足底中央後足をプロービングすることに対する離脱反応を測定します。各フィラメントを、吊り下げられた金網ケージに保持されている動物のpSNL同側後足の足底表面に1回垂直に適用する。「上下」法15を使用して機械的感度を評価する:フィラメントのサイズに対応する刺激強度を順次増減させることによって離脱閾値を決定する。各フィラメントを1回ずつ順次塗布する。
      注:実験者は、動物間で一貫した結果を得るために、フットパッドの刺激を避ける必要があります。
    2. たとえば、動物が3.61フィラメントに反応しない場合は、より太い4.08フィラメント(9.8 mN)を使用します(反応は、影響を受けた足の離脱、震え、またはなめとして視覚的に記録されます)。動物が初めて反応した場合は、より細い3.22(1.6 mN)フィラメントを使用してください。動物がその後の反応が正または負であったかどうかに応じて、減少するフィラメントまたはますます太いフィラメントを使用し続けます。 補足表S1に示されているデータシートで否定的および肯定的な応答を報告してください。最初の陽性反応に続いて、異なるフィラメントで同じ足を4倍テストします。

2.ベースライン:ハーグリーブステストを使用した熱感度の測定

  1. マウスが到着したら、動物施設に1週間慣れさせます。その後、動物を実験者の取り扱いに≥7日間慣れさせる。
  2. マウスをハーグリーブス試験装置に1時間慣れさせる前に、マウスを試験室と同じ部屋で、できれば実験者が慣れている部屋に置いた透明なプレキシグラスボックスに入れます。
    注意: ハーグリーブステストでは、動物が数秒間静止している必要があります。マウスでは、慣れが実験を成功させるための鍵です。したがって、マウスが1時間の慣れ後も非常に活動的なままである場合は、必要に応じてより長く順応させます。
    1. ハーグリーブスら16で説明されているように、足の離脱潜時を決定します。プレキシグラスの囲いの中でマウスを透明なプレキシガラスプレートに順応させます。
    2. 放射熱源(高輝度プロジェクターランプ)をpSNLと同側の後足の足底面に集中させます。熱源の強度を調整して、足の離脱潜伏時間のベースラインを約10秒にします。次に、実験の残りの部分で強度を一定に保ちます。
    3. モーションディテクターが自動的に刺激を停止し、足が引っ込められたときにタイマーを立てるのを待ちます。組織の損傷を防ぐために、33.5秒の最大カットオフを使用してください。
      注:カットオフは、追加の皮膚損傷を避けるために、以前の実験と記事に基づいて決定されます11、17、18。この研究で使用された強度では、33.5がカットオフであり、ハーグリーブス装置を使用した30(50 W)の刺激強度に対応します。観察された行動は反射行動であり、自発的な行動ではありません。
    4. ハーグリーブス装置を使用し、pSNL同側後足の足底表面を狙って、ベースライン足の離脱潜時を確立します。熱刺激を開始し、離脱潜時を記録します。熱刺激の温度に影響を与えないように、試験中に尿をきれいにしてください。

3.ベースライン:ホットプレートテストを使用した熱感度の尺度

  1. 試験前に動物を試験室に1時間慣れさせます。
    注意: 室温は重要であり、ホットプレートテストへの応答に影響を与える可能性があるため、慣れ期間中およびテスト期間中、部屋の温度が一貫して約22°Cであることを確認してください。
  2. ホットプレートを52°Cに設定し、この温度は理想的には嫌悪熱応答を引き出すことが示されています19。
  3. 動物を試験室に入れ、クロノメーターを始動します。
  4. 侵害行動(すなわち、足の撤退、舐め、震え)を観察します。pSNL手術は後肢に影響を与えるため、前肢で観察される行動(特に前肢舐め)は無視してください。
  5. 侵害行動が観察されたらすぐにクロノメーターを停止します。
  6. チャンバーから動物を取り出し、この行動の潜伏時間を記録します。
    注意: 組織の損傷を防ぐために、最大30秒後に動物をチャンバーから取り出します。さらに、観察された行動は反射行動であり、自発的な行動ではないことに注意することが重要です。
  7. 動物間の70%エタノールで試験室を洗浄して、臭いの行動への影響を減らします。熱刺激の温度に影響を与えないように、試験した各動物間の尿を装置から清掃してください。
  8. 結果を確認するには、動物がテストされた後のレビューのために、テスト中にホットプレートチャンバー内の動物のビデオを録画します。
    注:ビデオレビューを使用してレイテンシを定量化することにより、実験者はテストを繰り返し観察し、リアルタイム観察中に見逃された可能性のある侵害行動を綿密に分析できます。

4.術前の準備

注意: 手術後にマウスを回復するために、清潔なケージが利用可能であることを確認してください。手術部位を70%エタノールで清掃し、70%エタノールで手を消毒し、滅菌手袋を使用し、適切な個人用保護具(PPE)(白衣、ヘアネット、靴カバー)を着用し、手術中は滅菌技術を練習します。

  1. 手術で使用する道具(補足図S1)と追加のリソース(ガーゼ)を事前にオートクレーブ滅菌して準備します。
  2. 揮発性イソフルランを使用して麻酔を誘発し、必要に応じて調整して手術面を維持します。酸素が適切な流量であることを確認してください。
  3. 動物が麻酔されていることを確認するには、ピンセットで後ろ足のつま先をつまんで足の反射がないことを確認し、潤滑眼科用軟膏を塗布する前に角膜まばたき反射を確認します。
    注:鎮痛薬は、分析することを目的とした疼痛経路を変更したり、疼痛研究目標20,21,22に従って測定されている行動を中和および無効にしたりする可能性があるため、この研究では提供できません。
  4. 手術を行う側を選択したら(左はここで示されています)、動物の後ろ足を太ももの周り、膝蓋骨に向かって下向き、股関節に向かって上向き、大腿骨の上を剃ります。温かい滅菌生理食塩水と交互に、3つの別々のガーゼで一方向にクロルヘキシジンで3回拭きます。
    注:今後は、一貫性を維持するために、すべての動物が同じ側で手術を行うようにしてください。
  5. 10 cm x 10 cmの滅菌ドレープで作られたスリットに脚を滑り込ませて、選択した脚の周りに滅菌フィールドを作成します。

5.外科的処置

  1. 細かい外科用ハサミ(補足図S1F)を使用して、太ももの外側の正中線に皮膚の小さな2mmのカットを作成します。はさみを円を描くように皮膚の下にスライドさせて筋膜を突破し、隙間を作り、切開スペースを拡大します。
  2. 結束鉗子(補足図S1H)を使用して、大腿部の筋肉に90°の角度で垂直に1 cmの深さの鋭い切開を作成します。
  3. 細い小さなハサミ(補足図S1G)を同じ切開部に90°の角度で挿入し、そっと広げて筋肉を分離します。坐骨神経が視覚化されるまでこれを続けます。
  4. 股関節から膝の方向に、垂直太ももと平行に走っている光沢があり細く見える坐骨神経を見つけます。先に進む前に、はさみと結束鉗子を体から取り外してください。
  5. 極細鉗子(補足図S1D)と神経ガラスフック(補足図S1E)を使用して、神経を下から隔離します。股関節に最も近く、膝から最も遠い大腿骨の転子近くの部位で、周囲の結合組織から神経を慎重に解放します。
  6. 神経をガラス棒の上に置き、棒の端が神経が転がり落ちるのを防ぐようにします。
  7. 9-0ナイロン縫合糸を使用して坐骨神経の幅の1/3を結ぶ外科用結び目を置き、その後、総腓骨神経、脛骨神経、腓腹神経枝3に分割します。
    注:分岐は、坐骨神経が股関節から離れて膝を下るときに発生します。神経のこれら3つの枝には3つの異なる神経支配があるため、すべての動物手術で同じ神経欠損を確実にするために、分岐の前に外科的結び目を配置することが不可欠です。
  8. 神経がガラス棒から滑り落ちないように、またそれ以上の伸張傷害を避けるために、過度の力で神経を引っ張らないように、糸をしっかりと引っ張るときは、糸を結び目の近くに保持するように注意してください。
  9. 結び目が完了したら、神経をガラス棒から慎重に滑り落ち、分離した筋肉の下のレベルで元の場所に戻します。
  10. 吸収性ポリグリコール5-0縫合糸を使用して筋肉切開を縫合します。別途、非吸収性ポリプロピレン6-0縫合糸を用いて皮膚を縫合する。
  11. 手術と麻酔の停止時間を記録します。マウスを回復ケージで一人でウェイクアップさせてから、新しい清潔なケージに戻します。
    注:手術中は、動物のつま先をつまんで麻酔の適切な維持を確認し、呼吸と身体灌流(赤、ピンク、淡い)を監視します。呼吸が大幅に減少したり、動物が青白く見える場合は、麻酔の流れを減らすか、酸素の流れを増やし、生理食塩水で満たされた注射器を皮下注射して動物に水分補給する準備をすることを検討します。動物の暖かさを維持するために、動物は常にその下に熱源を配置する必要があります。

6.対照動物に対する偽手術の手順

  1. 外科的処置のステップ5.1-5.11に従ってください。手順 5.4-5.9 を除外します。

7.術後行動検査

注意: 実験者が治療を知らされていないことを確認してください。慢性神経因性疼痛は術後2週間で発症し、その後、目的の化合物の投与後に行動試験を実施できます。

  1. フォンフレイ、ハーグリーブス、またはホットプレートテストを使用して、熱的および機械的過敏症とその潜在的な逆転の両方を評価します。
  2. 施設の動物管理および使用委員会によって説明されているエンドポイント基準を満たしている場合は、研究から動物を削除します。
  3. 行動試験の最後に施設動物管理および使用委員会によって説明された手順に従って、動物を安楽死させます。

8.データ分析

  1. フォン・フレイ:
    1. Chaplanら23によって記述されているように、Dixonのノンパラメトリック法を使用してデータを分析し、データを平均離脱閾値として表現します。
      1. 参照先のソフトウェアのメインページ(「 材料表」を参照)で、スタディに使用されたすべてのフィラメント(2.44、2.83、3.22、3.61、4.08、4.31、および4.56)を選択します。 グループ パネルで、最後のシミュレーションに対応するフィラメントを選択します。 空白 のボックスに、 肯定的 (X ) 応答と 否定的応答 (o) を報告します。観察された応答パターンの左側のボックスに報告されたしきい値を書き留めます。
        注:パターンと定量化の例を 補足図S2に示します。
  2. ハーグリーブスとホットプレート:
    1. 詳細な統計分析のために、スプレッドシートで待機時間を報告します。
    2. 時間を関数として感度(しきい値または遅延)の平均として結果をプロットします。

9.神経ガラスフックの作り方の説明

注意: このプロセス全体を通して火災安全を実践してください。必要に応じて、耐熱手袋やアイウェアなどの適切な保護具を着用してください。

  1. ブンゼンバーナーをオンにします。
  2. ガラス棒(A)の一方の端を片手で火にかざします。このガラス棒が溶けたら、もう一方の手で別のガラス棒(B)を使用して、棒Aの溶けているガラスをガイドして引っ張ります。 ガラス棒Aを火から外し、溶けた部分の端を自然に内側に転がして小さなボールの形にします。ガラス棒Bを使用して、この形状をガイドします。

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結果

慢性神経因性疼痛は、C57Bl6/J雄マウスの坐骨神経の部分結紮によって誘発されました(図1A)。機械的感度は、フォンフレイフィラメントと「上下」法を使用して評価されました。熱に対する熱感受性は、ハーグリーブスおよびホットプレートテストを使用して評価されました。すべてのデータは、ガイサー温室補正を伴う反復測定二元配置分散分析で分析され、偽の動物に対するpSNL手術の効果を経時的に比較するか、異なる用量のモルヒネとイブプロフェンの効果を比較しました。

pSNL手術を受けたマウスは、28日間にわたって偽の動物と比較して、機械的刺激に対する閾値が低いことを示しました(図1B)。熱過敏症評価でも同様の結果が得られました。pSNL動物では放射熱刺激にさらされた後の足の離脱潜時が増加し(図1C)、動物を52°Cのプレートに置いた場合の離脱潜時も増加しました(図1D)。

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ディスカッション

慢性疼痛治療はしばしば長期投薬を必要とし、疼痛管理を困難にします。したがって、前臨床モデルは、薬理学的または非薬理学的アプローチに依存する革新的な治療法の潜在的な利益を評価するための不可欠なツールです。慢性神経因性疼痛の多数のモデルは、異なる研究者間の手術技術のばらつきの増加による課題をもたらし、再現性の低下につながります。したがって、十分に特徴付けられ標準化された複数のモデルにおける新しい治療法の潜在的な侵害受容効果を特徴付けることが不可欠です。

この報告は、坐骨神経の部分結紮が、比較的安価な方法を使用してマウスに長期にわたる慢性神経因性疼痛の発症をもたらすことを示しています。pSNLは熱的および機械的刺激に対する応答を誇張し、モデルは用量依存的に一般的に使用される鎮痛薬の投与に応答します。したがって、pSNLモデルは、新薬の潜在的な利益を評価するための便利で感度の高いモデルであるように思われます。神経因性疼痛の主な特徴は、痛覚過敏および異痛症である。この報告は、機械的異痛症と熱痛覚過敏がどのように影響を受けるかを示しています。しかしながら、機械的痛覚過敏は測定されなかった。異痛...

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開示事項

著者は報告する利益相反はありません。原稿の著者の誰も、他の方法で報酬、払い戻し、または謝礼を受け取っていませんでした。著者らは、この研究に関連するベンダーや製薬会社とは提携していません。

謝辞

この研究は、国立補完統合健康センター[R01AT009716、2017](M.M.I)、アリゾナ大学総合慢性疼痛依存症センター(M.M.I)、およびアリゾナ大学医学部ツーソン校の医学者トレーニングプログラム(MSTP)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5/0、FS-2、30 "未染色PGA編組ポリグリコール酸合成吸収性縫合CPメディカル421A
https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/ 6/0、P-1、18 "ブルーポリプロピレンモノフィラメント非吸収性縫合CPメディカル8697P
https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/ 9/0(0.3メートル法)ナイロンブラックモノフィラメント縫合クレストポイント眼科MANI 1407https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html
Allodynia Software National Instruments, LabView 2015Quantification of mean withdrawal thresholds (Von Frey data)
C57Bl6/J マウス ジャクソン研究所、バーハーバー、メイン州000664https://www.jax.org/strain/000664
Castroviejo ニードルホルダーファイン サイエンス ツール12565-14https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14
コールド ホット プレート テストBiosebBIO-CHPhttps://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html
BiosebBIO-STD2-EVFhttps://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html
用高架金属メッシュ スタンドhttps://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110
ファイン カストロビエホ ニードルホルダーSimovision/Geuder17565https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf
ファインハサミ (11.5 cm)Fine Science Tools14558-11https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11
ファインハサミ(9cm)ファインサイエンスツール14558-09https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09
アイリス鉗子ファインサイエンスツール11064-07https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07
マイクロ Adson 鉗子Fine Science Tools392487
https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps ラットとマウス用のモジュラーホルダーケージBiosebBIO-PVFhttps://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html
モレッティ/エフェトル #240 ライト コバルト ブルー ガラス棒 4 mmEbayN/Ahttps://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS
w9CtfnIVJ&amdata=enc
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糸糸糸フォン・フレイ 極細グレーフ鉗子ファイン サイエンス ツール 11152-10

参考文献

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