坐骨神経部分結紮術:新規治療法の抗侵害受容効果を研究するための慢性神経因性疼痛のマウスモデル

慢性疼痛は世界中で重要な医療問題であり、米国で最も費用のかかる健康問題の1つです。慢性疼痛は、薬理学的モダリティと非薬理学的モダリティの両方が学際的な方法で利用されている場合、より適切に管理されます¹。慢性疼痛の管理は困難であり、場合によっては、疼痛を適切に治療しない²。したがって、慢性疼痛管理を改善するには新しい補完的な方法が必要であり、革新的な治療法を研究するには動物モデルが不可欠です。

慢性神経因性疼痛は、糖尿病、感染症、神経圧迫、自己免疫疾患など、体性感覚系の病変や疾患に起因し^ます3。神経因性疼痛は、末梢および中枢の両方の感作メカニズムに依存しており、神経の病変に由来します。この痛みは、触覚および熱誘発痛覚過敏および異痛症の両方、進行中の痛み、および患肢の温度の変化によって特徴付けることができます⁴。メカニズムをよりよく理解し、新しい治療法を進歩させるために、神経因性疼痛の症状と原因を模倣するためにげっ歯類でいくつかのモデルが開発されました⁵。例えば、神経因性疼痛は、化学療法剤注射、脊髄神経結紮術(SNL)、坐骨神経の慢性狭窄損傷(CCI)、pSNL、温存神経損傷、坐骨神経切断、および坐骨神経三分割⁶で誘発することができる。特に、坐骨神経の結紮は、機械的および熱的過敏症、または複合性局所疼痛症候群(CRPS)に特徴的な患肢の温度変化など、ヒトで観察される神経因性疼痛の複数の特徴を再現します⁷。したがって、このモデルは、慢性神経因性疼痛を誘発するCRPSまたはその他の神経損傷の影響の研究に適しています。このモデルは、1990年にセルツァーによって最初に開発され⁸、新規鎮痛化合物を調査したり、慢性疼痛の認知効果を評価したりするための疼痛研究で広く使用されています9,10,11,12,13。このモデルは高い再現性を示し、部分結紮は末梢刺激に対する行動応答を保存する⁶。

現在使用されているモデルの多くには、pSNLでは観察されない欠点があります。CCIモデルは、収縮器のぴったり性に応じて各動物間の損傷の変動性がはるかに高く、解剖術は後足の指を変化させ、モデルを行動分析に適さないものにします⁶。SNLモデルは、はるかに複雑で長い手術であり、高度な技術スキルを必要とするだけでなく、重度の運動障害のリスクも高くなります³。これらの欠点は、pSNL モデルでは見られません。再現性の容易さ、手術期間の短さ、および術後に見られる運動障害のリスクの低下により、このモデルは末梢神経障害性疼痛の研究に価値があります^8,14。それにもかかわらず、部分結紮手順自体は実験者間でばらつきがあり、その結果、結紮された神経線維の数の一貫性が低下します。したがって、手術の詳細を提示することは、研究間の再現性を高めるために重要です。

慢性神経障害を誘発するために、9-0非吸収性ナイロン縫合糸を使用して、坐骨神経の幅の3分の1を結紮します。手術後、熱的および機械的刺激に対する反応は誇張されており、術後1日目から始まり、50日以上続きます⁸。ここでは、ハーグリーブス、ホットプレート、およびフォンフライフィラメントテストを使用して、熱感度と機械的感度の両方を28日間にわたって評価しました。すべての行動アッセイは、長期にわたる過敏症の一貫性を示しました。このモデルは、モルヒネとイブプロフェンの両方の用量依存的な効果があることが示されており、前臨床疼痛研究に適していることが確認されています。特に、この記事では、「神経ガラスフック」と呼ばれるユニークな手作りのガラスツールの説明について説明します。このツールは、鉗子の代わりに神経を操作し、手術中の意図しない追加の神経損傷を防ぐために使用されます。

すべての手順は、アリゾナ大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認され、国立衛生研究所の実験動物の使用に関するガイドライン(NIH出版物第80-23号、1966年)に準拠しています。病原体のない成体C57Bl6 / Jマウス(試験時の体重:22〜28 g)は、気候制御された部屋の標準的なビバリウムマウスケージ(ケージあたり5匹)に12時間の明暗サイクルで収容され、食物と水を 自由に利用できました。すべての行動実験は、治療条件を知らされていない実験者によって行われました。

1.ベースライン:機械的感度の尺度

1. マウスが到着したら、動物施設に1週間慣れさせます。その後、動物を実験者の取り扱いに≥7日間慣れさせる。
2. マウスを試験室と同じ部屋で、金網上の透明なプレキシグラス箱に入れることにより、試験前に1時間フォンフライ試験装置にマウスを慣れさせる。
3. 3.61(3.9 mN)フィラメントから始めて、補足表S1に記載されているフォンフレイフィラメントを使用した「上下」法を介してベースライン足の離脱閾値を確立します。
   1. 一連の較正された微細(von Frey)モノフィラメントで足底中央後足をプロービングすることに対する離脱反応を測定します。各フィラメントを、吊り下げられた金網ケージに保持されている動物のpSNL同側後足の足底表面に1回垂直に適用する。「上下」法¹⁵を使用して機械的感度を評価する:フィラメントのサイズに対応する刺激強度を順次増減させることによって離脱閾値を決定する。各フィラメントを1回ずつ順次塗布する。
      注:実験者は、動物間で一貫した結果を得るために、フットパッドの刺激を避ける必要があります。
   2. たとえば、動物が3.61フィラメントに反応しない場合は、より太い4.08フィラメント(9.8 mN)を使用します(反応は、影響を受けた足の離脱、震え、またはなめとして視覚的に記録されます)。動物が初めて反応した場合は、より細い3.22(1.6 mN)フィラメントを使用してください。動物がその後の反応が正または負であったかどうかに応じて、減少するフィラメントまたはますます太いフィラメントを使用し続けます。 補足表S1に示されているデータシートで否定的および肯定的な応答を報告してください。最初の陽性反応に続いて、異なるフィラメントで同じ足を4倍テストします。

2.ベースライン:ハーグリーブステストを使用した熱感度の測定

1. マウスが到着したら、動物施設に1週間慣れさせます。その後、動物を実験者の取り扱いに≥7日間慣れさせる。
2. マウスをハーグリーブス試験装置に1時間慣れさせる前に、マウスを試験室と同じ部屋で、できれば実験者が慣れている部屋に置いた透明なプレキシグラスボックスに入れます。
   注意: ハーグリーブステストでは、動物が数秒間静止している必要があります。マウスでは、慣れが実験を成功させるための鍵です。したがって、マウスが1時間の慣れ後も非常に活動的なままである場合は、必要に応じてより長く順応させます。
   1. ハーグリーブスら¹⁶で説明されているように、足の離脱潜時を決定します。プレキシグラスの囲いの中でマウスを透明なプレキシガラスプレートに順応させます。
   2. 放射熱源(高輝度プロジェクターランプ)をpSNLと同側の後足の足底面に集中させます。熱源の強度を調整して、足の離脱潜伏時間のベースラインを約10秒にします。次に、実験の残りの部分で強度を一定に保ちます。
   3. モーションディテクターが自動的に刺激を停止し、足が引っ込められたときにタイマーを立てるのを待ちます。組織の損傷を防ぐために、33.5秒の最大カットオフを使用してください。
      注:カットオフは、追加の皮膚損傷を避けるために、以前の実験と記事に基づいて決定されます¹¹、^17、18。この研究で使用された強度では、33.5がカットオフであり、ハーグリーブス装置を使用した30(50 W)の刺激強度に対応します。観察された行動は反射行動であり、自発的な行動ではありません。
   4. ハーグリーブス装置を使用し、pSNL同側後足の足底表面を狙って、ベースライン足の離脱潜時を確立します。熱刺激を開始し、離脱潜時を記録します。熱刺激の温度に影響を与えないように、試験中に尿をきれいにしてください。

3.ベースライン:ホットプレートテストを使用した熱感度の尺度

1. 試験前に動物を試験室に1時間慣れさせます。
   注意: 室温は重要であり、ホットプレートテストへの応答に影響を与える可能性があるため、慣れ期間中およびテスト期間中、部屋の温度が一貫して約22°Cであることを確認してください。
2. ホットプレートを52°Cに設定し、この温度は理想的には嫌悪熱応答を引き出すことが示されています¹⁹。
3. 動物を試験室に入れ、クロノメーターを始動します。
4. 侵害行動(すなわち、足の撤退、舐め、震え)を観察します。pSNL手術は後肢に影響を与えるため、前肢で観察される行動(特に前肢舐め)は無視してください。
5. 侵害行動が観察されたらすぐにクロノメーターを停止します。
6. チャンバーから動物を取り出し、この行動の潜伏時間を記録します。
   注意: 組織の損傷を防ぐために、最大30秒後に動物をチャンバーから取り出します。さらに、観察された行動は反射行動であり、自発的な行動ではないことに注意することが重要です。
7. 動物間の70%エタノールで試験室を洗浄して、臭いの行動への影響を減らします。熱刺激の温度に影響を与えないように、試験した各動物間の尿を装置から清掃してください。
8. 結果を確認するには、動物がテストされた後のレビューのために、テスト中にホットプレートチャンバー内の動物のビデオを録画します。
   注:ビデオレビューを使用してレイテンシを定量化することにより、実験者はテストを繰り返し観察し、リアルタイム観察中に見逃された可能性のある侵害行動を綿密に分析できます。

4.術前の準備

注意: 手術後にマウスを回復するために、清潔なケージが利用可能であることを確認してください。手術部位を70%エタノールで清掃し、70%エタノールで手を消毒し、滅菌手袋を使用し、適切な個人用保護具(PPE)(白衣、ヘアネット、靴カバー)を着用し、手術中は滅菌技術を練習します。

1. 手術で使用する道具(補足図S1)と追加のリソース(ガーゼ)を事前にオートクレーブ滅菌して準備します。
2. 揮発性イソフルランを使用して麻酔を誘発し、必要に応じて調整して手術面を維持します。酸素が適切な流量であることを確認してください。
3. 動物が麻酔されていることを確認するには、ピンセットで後ろ足のつま先をつまんで足の反射がないことを確認し、潤滑眼科用軟膏を塗布する前に角膜まばたき反射を確認します。
   注:鎮痛薬は、分析することを目的とした疼痛経路を変更したり、疼痛研究目標^20,21,22に従って測定されている行動を中和および無効にしたりする可能性があるため、この研究では提供できません。
4. 手術を行う側を選択したら(左はここで示されています)、動物の後ろ足を太ももの周り、膝蓋骨に向かって下向き、股関節に向かって上向き、大腿骨の上を剃ります。温かい滅菌生理食塩水と交互に、3つの別々のガーゼで一方向にクロルヘキシジンで3回拭きます。
   注:今後は、一貫性を維持するために、すべての動物が同じ側で手術を行うようにしてください。
5. 10 cm x 10 cmの滅菌ドレープで作られたスリットに脚を滑り込ませて、選択した脚の周りに滅菌フィールドを作成します。

5.外科的処置

1. 細かい外科用ハサミ(補足図S1F)を使用して、太ももの外側の正中線に皮膚の小さな2mmのカットを作成します。はさみを円を描くように皮膚の下にスライドさせて筋膜を突破し、隙間を作り、切開スペースを拡大します。
2. 結束鉗子(補足図S1H)を使用して、大腿部の筋肉に90°の角度で垂直に1 cmの深さの鋭い切開を作成します。
3. 細い小さなハサミ(補足図S1G)を同じ切開部に90°の角度で挿入し、そっと広げて筋肉を分離します。坐骨神経が視覚化されるまでこれを続けます。
4. 股関節から膝の方向に、垂直太ももと平行に走っている光沢があり細く見える坐骨神経を見つけます。先に進む前に、はさみと結束鉗子を体から取り外してください。
5. 極細鉗子(補足図S1D)と神経ガラスフック(補足図S1E)を使用して、神経を下から隔離します。股関節に最も近く、膝から最も遠い大腿骨の転子近くの部位で、周囲の結合組織から神経を慎重に解放します。
6. 神経をガラス棒の上に置き、棒の端が神経が転がり落ちるのを防ぐようにします。
7. 9-0ナイロン縫合糸を使用して坐骨神経の幅の1/3を結ぶ外科用結び目を置き、その後、総腓骨神経、脛骨神経、腓腹神経^枝3に分割します。
   注:分岐は、坐骨神経が股関節から離れて膝を下るときに発生します。神経のこれら3つの枝には3つの異なる神経支配があるため、すべての動物手術で同じ神経欠損を確実にするために、分岐の前に外科的結び目を配置することが不可欠です。
8. 神経がガラス棒から滑り落ちないように、またそれ以上の伸張傷害を避けるために、過度の力で神経を引っ張らないように、糸をしっかりと引っ張るときは、糸を結び目の近くに保持するように注意してください。
9. 結び目が完了したら、神経をガラス棒から慎重に滑り落ち、分離した筋肉の下のレベルで元の場所に戻します。
10. 吸収性ポリグリコール5-0縫合糸を使用して筋肉切開を縫合します。別途、非吸収性ポリプロピレン6-0縫合糸を用いて皮膚を縫合する。
11. 手術と麻酔の停止時間を記録します。マウスを回復ケージで一人でウェイクアップさせてから、新しい清潔なケージに戻します。
    注:手術中は、動物のつま先をつまんで麻酔の適切な維持を確認し、呼吸と身体灌流(赤、ピンク、淡い)を監視します。呼吸が大幅に減少したり、動物が青白く見える場合は、麻酔の流れを減らすか、酸素の流れを増やし、生理食塩水で満たされた注射器を皮下注射して動物に水分補給する準備をすることを検討します。動物の暖かさを維持するために、動物は常にその下に熱源を配置する必要があります。

6.対照動物に対する偽手術の手順

1. 外科的処置のステップ5.1-5.11に従ってください。手順 5.4-5.9 を除外します。

7.術後行動検査

注意: 実験者が治療を知らされていないことを確認してください。慢性神経因性疼痛は術後2週間で発症し、その後、目的の化合物の投与後に行動試験を実施できます。

1. フォンフレイ、ハーグリーブス、またはホットプレートテストを使用して、熱的および機械的過敏症とその潜在的な逆転の両方を評価します。
2. 施設の動物管理および使用委員会によって説明されているエンドポイント基準を満たしている場合は、研究から動物を削除します。
3. 行動試験の最後に施設動物管理および使用委員会によって説明された手順に従って、動物を安楽死させます。

8.データ分析

1. フォン・フレイ:
   1. Chaplanら²³によって記述されているように、Dixonのノンパラメトリック法を使用してデータを分析し、データを平均離脱閾値として表現します。
      1. 参照先のソフトウェアのメインページ(「 材料表」を参照)で、スタディに使用されたすべてのフィラメント(2.44、2.83、3.22、3.61、4.08、4.31、および4.56)を選択します。 グループ パネルで、最後のシミュレーションに対応するフィラメントを選択します。 空白 のボックスに、 肯定的 (X ) 応答と 否定的応答 (o) を報告します。観察された応答パターンの左側のボックスに報告されたしきい値を書き留めます。
         注:パターンと定量化の例を 補足図S2に示します。
2. ハーグリーブスとホットプレート:
   1. 詳細な統計分析のために、スプレッドシートで待機時間を報告します。
   2. 時間を関数として感度(しきい値または遅延)の平均として結果をプロットします。

9.神経ガラスフックの作り方の説明

注意: このプロセス全体を通して火災安全を実践してください。必要に応じて、耐熱手袋やアイウェアなどの適切な保護具を着用してください。

1. ブンゼンバーナーをオンにします。
2. ガラス棒(A)の一方の端を片手で火にかざします。このガラス棒が溶けたら、もう一方の手で別のガラス棒(B)を使用して、棒Aの溶けているガラスをガイドして引っ張ります。 ガラス棒Aを火から外し、溶けた部分の端を自然に内側に転がして小さなボールの形にします。ガラス棒Bを使用して、この形状をガイドします。

慢性神経因性疼痛は、C57Bl6/J雄マウスの坐骨神経の部分結紮によって誘発されました(図1A)。機械的感度は、フォンフレイフィラメントと「上下」法を使用して評価されました。熱に対する熱感受性は、ハーグリーブスおよびホットプレートテストを使用して評価されました。すべてのデータは、ガイサー温室補正を伴う反復測定二元配置分散分析で分析され、偽の動物に対するpSNL手術の効果を経時的に比較するか、異なる用量のモルヒネとイブプロフェンの効果を比較しました。

pSNL手術を受けたマウスは、28日間にわたって偽の動物と比較して、機械的刺激に対する閾値が低いことを示しました(図1B)。熱過敏症評価でも同様の結果が得られました。pSNL動物では放射熱刺激にさらされた後の足の離脱潜時が増加し(図1C)、動物を52°Cのプレートに置いた場合の離脱潜時も増加しました(図1D)。

慢性神経因性疼痛の確立後、手術の14日後に、異なる用量のモルヒネまたはイブプロフェンの抗侵害受容効果を評価しました。マウスに生理食塩水または2つの異なる用量のモルヒネ(1および5 mg / kg)を腹腔内注射しました。.モルヒネを注射した両群とも、pSNL誘発性過敏症の逆転を示し、1時間(1 mg/kg)から2時間(5 mg/kg)まで持続しました(図2A)。機械的過敏症は、モルヒネの注射後4時間でベースラインに戻った。2つの異なる用量のイブプロフェン(10および30 mg / kg)をマウスに腹腔内投与した場合、結果は生理食塩水を注射したマウスと比較して機械的過敏症の減少を示しました(図2B)。イブプロフェンの抗侵害受容効果は最大2時間続いた。全体として、結果は、pSNL手術が長期にわたる慢性神経因性疼痛を誘発することを示しました。さらに、このモデルがさまざまな用量の鎮痛薬に敏感であることを実証することができました。

図1:坐骨神経の部分結紮によるマウスの長期にわたる熱的および機械的過敏症。 熱に対する熱感受性(ハーグリーブスおよびホットプレートテスト)およびフォンフレイフィラメントに対する機械的感受性を評価して、慢性神経因性疼痛(pSNL)のモデルにおける過敏症の誘導と持続性を調べました。ベースライン値は坐骨神経の結紮前に測定され、過敏症は手術後28日間にわたって評価されました。(A)図は坐骨神経の部分結紮を表しています。(B)機械的離脱閾値を、各時点で偽マウスとpSNLマウスの間で比較した。ガイサー温室効果補正を用いた二元配置分散分析の反復測定では、pSNLの有意な効果が明らかになった(条件あたりF(1, 10) = 222.3, p < 0.0001, n = 5-7)。Sidakの多重比較テストでは、1日目から28日目の間に過敏症の有意な増加が示されました(p < 0.05)。(C)ハーグリーブス検定によって測定された熱離脱潜時を、偽マウスとpSNLマウスの間で比較した。ガイサー温室補正を用いた二元配置分散分析の反復測定により、pSNLの有意な効果が明らかになりました(F(1, 8) = 113.8; p < 0.0001, n = 4-6 条件あたり)。Sidakの多重比較テストでは、2日目と14日目に過敏症の有意な増加が示されました(p < 0.05)。(D)ホットプレート試験により測定した熱離脱潜時を、偽マウスとpSNLマウスとの間で比較した。通常の二元配置分散分析では、pSNLの有意な効果が明らかになりました(条件ごとにF(1, 32) = 19.10, p = 0.0001, n = 4-6)。Sidakの多重比較試験では、pSNL手術後4週間で熱に対する感受性が有意に増加したことが示されました(p = 0.0026)。データは、S.E.M.±平均値として提示されます。 略語:pSNL =坐骨神経の部分結紮;BL = ベースライン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:モルヒネまたはイブプロフェンの腹腔内注射によるpSNL誘発機械的過敏症の用量依存的逆転。機械的過敏症(フォンフレイフィラメントを使用)を評価して、pSNLのマウスモデルにおけるモルヒネまたはイブプロフェンの潜在的な侵害受容効果を調べました。ベースライン値(pre-pSNL)は、坐骨神経結紮前に取得されました。慢性神経因性疼痛の確立に続いて、14日目に、pSNL誘発過敏症(ポストpSNL)を確実にするために、動物を2回目のベースラインにした。次に、モルヒネ(1 / 5 mg / kg)またはイブプロフェン(10 / 30 mg / kg)のいずれかを腹腔内注射しました。機械的過敏症の潜在的な逆転は、注射後4時間にわたって評価されました。.(A)生理食塩水とモルヒネの2回の投与の間で機械的離脱閾値を比較した。ガイサー温室補正を用いた二元配置分散分析の反復測定では、1 mg/kgモルヒネの有意な効果(F(1, 11) = 11.16, p = 0.0066, n = 6-7)と5 mg/kgモルヒネの有意な効果(条件あたりF(1, 10) = 21.78, p = 0.0009, n = 6)が明らかになった。Sidakの多重比較試験では、両方の用量で注射後1時間の機械的過敏症の有意な減少が示されましたが、2時間後の5 mg / kgの状態に対してのみ有意な効果がありました(*p < 0.05)。(B)機械的離脱閾値を生理食塩水とイブプロフェンの2回投与の間で比較した。ガイサー温室補正による二元配置分散分析の反復測定では、10 mg / kgのイブロフェンの有意な効果(F(1, 11)= 7.788、p = 0.0176、条件あたりn = 6-7)および30 mg / kgのイブプロフェンの有意な効果が明らかになりました(条件ごとにF(1, 10)= 18.79、p = 0.0015、n = 6)。 Sidakの多重比較試験では、両方の用量で注射後1時間と2時間後に機械的過敏症の有意な減少が示されました(*p < 0.05)。データは、S.E.M.±平均値として提示されます。 略語:pSNL =坐骨神経の部分結紮;IP =腹腔内。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:手術器具。 2つの写真は、手術に使用されるさまざまなツールを示しています。(A)ファインカストロビエホニードルホルダー。(B)カストロビエホ針ホルダー;(C)マイクロアドソン鉗子;(D)極細グレーフ鉗子;(e)神経ガラスフック;(f)細かいはさみ(11.5センチメートル);(g)細かいハサミ(9cm);(h)鉗子を結ぶこと;(I)虹彩鉗子。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:フォンフライフィラメントテストによって測定された足の離脱反応の代表的なパターン。 この試験では、マウスは最初の3つの刺激に反応しませんでしたが、4.56フィラメントで4番目の刺激で足を引っ込めました。陽性応答(x)に続いて、より細いフィラメントを使用し(4.31)、マウスが別のフィラメントに応答しなくなるまで小さいサイズのフィラメントを使用した(この場合は4.08)。実験者は、応答がなくなるまでフィラメントのサイズを1つずつ小さくする必要があります(o)。応答がない場合、実験者は、肯定的な応答が得られるまでより太いフィラメントを使用し、肯定的な応答(ここでは4.31フィラメントで得られた)に従ってサイズを縮小しました。最初の陽性反応に続いて4つの刺激が行われた。各刺激の時系列パターンは、パネル Aに赤い数字で注釈が付けられています。この場合、フィラメント2.44〜3.22は、動物が3.61フィラメントで陽性反応を示さなかったため、決して使用されなかった。(B)次に、応答のパターンをAllodyniaソフトウェアに記入し、フィラメントが適用されたのと同じ順序(000xx0x0)で、白で強調表示されたボックスに報告されました。結果のしきい値は、ソフトウェアによって計算されました(2.60839)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:フォンフライテストのデータ収集シート。 この表により、実験者はフォン・フレイフィラメントを使用したときの応答のパターンを記入できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は報告する利益相反はありません。原稿の著者の誰も、他の方法で報酬、払い戻し、または謝礼を受け取っていませんでした。著者らは、この研究に関連するベンダーや製薬会社とは提携していません。