免疫組織化学プロトコルを使用して異常なプリオンタンパク質を免疫標識するには、特定のサンプルおよび抗PrP抗体調製方法が必要です。本プロトコルは、適切なPrP免疫標識を確保し、非特異的バックグラウンド染色を最小限に抑えるためのエピトープデマスキングの重要なステップを説明しています。また、このアプローチは、プリオン感染組織を用いて免疫組織化学研究を行う際のバイオセーフティ対策を考慮する。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
異常プリオンタンパク質(PrPSc)は、細胞プリオンタンパク質の疾患関連アイソフォームであり、伝染性海綿状脳症(TSE)の診断マーカーです。これらの神経変性疾患は、ヒトおよびいくつかの動物種に影響を及ぼし、スクレイピー、人獣共通感染症のウシ海綿状脳症(BSE)、子宮頸部の慢性消耗性疾患(CWD)、および新たに特定されたラクダプリオン病(CPD)が含まれます。TSEの診断は、脳組織、すなわち脳幹(obexレベル)に対する免疫組織化学(IHC)およびウェスタンイムノブロット法(WB)の両方の適用によるPrPSc の免疫検出に依存しています。IHCは、組織切片の細胞における目的の抗原に対する一次抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)を使用する広く使用されている方法です。抗体-抗原結合は、抗体が標的となった組織または細胞の領域に局在したままの呈色反応によって視覚化することができる。このように、プリオン病では、他の研究分野と同様に、免疫組織化学技術は診断目的だけでなく、病因研究にも使用されます。このような研究は、新しいプリオン株を同定するために、前述のものからPrPSc パターンおよびタイプを検出することを含む。BSEはヒトに感染する可能性があるため、東証サーベイランスに含まれる牛、小型反芻動物、および子宮頸管サンプルの取り扱いには、バイオセーフティ研究所レベル3(BSL-3)の施設および/または診療所を使用することが推奨されます。さらに、汚染を制限するために、可能な限り封じ込めおよびプリオン専用装置が推奨されます。PrPSc IHC手順は、この技術で使用されるホルマリン固定およびパラフィン包埋組織が感染性のままであるため、プリオン不活化手段としても機能するギ酸エピトープデマスキングステップで構成されています。結果を解釈する際には、非特異的免疫標識と標的標識を区別するように注意する必要があります。この目的のために、既知のTSE陰性対照動物において得られた免疫標識のアーティファクトを認識し、それらを特定のPrPSc 免疫標識タイプから区別することが重要であり、これはTSE株、宿主種、および prnp 遺伝子型の間で異なり得る。
概要
プリオン仮説によれば、異常なアイソフォーム(PrPSc)は、伝染性海綿状脳症(TSE)における感染因子の主要な、または唯一の成分です。TSEの診断の確認は、脳組織の免疫組織化学(IHC)プロトコルおよび/またはウェスタンイムノブロット法(WB)の適用によるPrPSc の免疫検出に依存しています1。
IHCは、組織切片の細胞にある目的の特異的標的抗原の免疫染色の最初のステップとして、モノクローナル抗体または場合によってはポリクローナル抗体(一次抗体として)を使用する方法です。次に、一次抗体に特異的な二次抗体を使用して、有効な一次抗体-抗原結合を視覚化します。これらの二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)やアルカリホスファターゼ(AP)などの酵素に結合しています。次に、これらの酵素に基質を添加し、一次抗体が標的抗原に結合している領域に局在する不溶性カラー生成物を生成することによって、視覚化が達成されます。改善された可視化は、対比染色によって達成することができ、ここで、色素は、免疫標識組織と非免疫標識組織との間のコントラストを作り出すために使用される2。
ホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPE)を用いたIHCでは、ホルマリン固定は、ホルムアルデヒドによる架橋やパラフィン包埋時....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
ここに記載されているIHC手順は、研究プロジェクトFAIRJ-CT98-7021「反芻動物TSEの監視のためのヨーロッパネットワークの確立、および疑わしい症例を特定するためのプロセスと基準の標準化と調和」の構成要素です。これは、世界獣疫事務局、WOAH(以前は国際版動物事務局、OIE)1および動物TSEの欧州参照研究所8,11によって定義された診断基準に従います。記載されているIHC手順は、17025年以来、NPISOIEC2008(試験および校正機関の能力に関する一般要件)に従って認定されています。このような認定は、標準的な操作手順、有資格者、正確に校正された機器、データと試薬の厳格な管理、ラボ間の習熟度アッセイへの参加、不適合作業、およびリスク評価を組み込んだ高品質の管理システムを意味します管理システムの有効性を高め、結果を改善し、実験室の危険を防ぎます。BSE、古典的スクレイピー、非定型スクレイピー、およびCWDによるプリオン感染組織コントロールは、さまざまなソースから収集されました(ホルマリン固定、パラフィン包埋、FFPE)。ウシとヒツジのセクションは、動物のTSEサーベイランスプログラムの下で診断された症例からのものです。CWDセクションは、2003年にStefanie Czub教授(カナダ食品検査庁、国立動物病センター)から提供された対照サンプルと、TSE....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
非特異的標的免疫標識が可能であることを考えると、既知のTSE陰性対照動物における非特異的免疫標識のレベルを確認することが重要です。これは、特異的なPrPSc 免疫標識7 (図2)を適切に解釈するための重要なステップである。 抗PrP抗体による非標的標識は、離散的な神経内微粒子染色(舌下核および副核でより顕著)、ニューロパイルの不規則な細線状染色糸(STN、V、オリバリー核、副クネエート核、外側筋膜核、オリバリー核背側の網状形成、および領域ポストレマ)として発生することが指摘されています12。、いくつかの灰白質および白質領域におけるびまん性非粒子標識、およびニューロン13 のびまん性細胞質標識(図3)。
いくつかの研究に基づいて、特異的で標的化されたPrPSc 免.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
TSEは潜在的な人獣共通感染症です。1986年に英国でBSEが出現した後、ポルトガルはこの病気の発生率が高い欧州連合加盟国の1つになりました14,15。この病気を制御するために、出現した他のTSE(古典的および非定型のスクレイピー、BSEバリアント、および現在は子宮頸管の慢性消耗性疾患のサーベイランス)、食品獣医総局(DGAV)および国立農業獣医研究所、IP(INIAV)によってサーベイランスメカニズムが開発されました。このラボは、TSEサーベイランスに関連する牛、小型反芻動物、および子宮頸管からの組織の潜在的なプリオン感染サンプルを管理する際に、推奨されるバイオセーフティBSL-3施設および実践6に従います。脳およびリンパ組織の免疫組織化学(IHC)および/またはウェスタンイムノブロット法(WB)によるPrPScの免疫検出は、TSE1の診断を確認するための参照方法です。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この記事は、FCT(Fundação para a Ciência e a Tecnologia)-FEDER -Balcão2020の支援を受けたプロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-029947「ポルトガルにおける慢性消耗性疾患リスク評価」によって資金提供されました。また、研究ユニットCECAVの著者は、プロジェクトUIDB/CVT/0772/2020の下でFCTから資金提供を受けました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 無水エタノール | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| 蒸留水で90%、70%、50%を希釈 | |||
| アビジン-ビオチン複合体とペルオキシダーゼ ベクタステインエリートABCキット ペルオキシダーゼ | ベクターラボラトリーズ | PK-6100 | キットの指示に従って、使用の30分前に調製し、穏やかに混合します。立ったまま混ぜないでください。 |
| ビオチン化二次抗体(ウマ抗マウスIgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | TBSで1/200に希釈し、10%馬の正常血清で希釈します。セクション数に応じて必要なボリュームを準備します。 |
| クロモゲンジアミノベンジジン-DAB、基質キット、ペルオキシダーゼ | ベクターラボラトリ | ーズSK-4100 | の指示に従って使用前に準備します. 400µを使用します。セクションあたりの溶液のL。 |
| DakoCytomation Pascal 圧力チャンバー | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich's ヘマトキシリン: | |||
| ヘマトキシリン | メルク | 115938 | ヘマトキシリン2gを無水エタノール100mLに溶解する。蒸留水100mL、氷酢酸10mL、カリウムミョウバン15gを絶えず攪拌しながら加えます。グリセリン100mLを加えます。自然酸化プロセスは、使用前に2か月かかります。 |
| 無水エタノール | Labchem | LB0507-9010 | |
| 氷酢酸 | メルク | 101830 | |
| カリウムミョウバン | メルク | 1.01047.1000 | |
| グリセリン | メルク | 1.04091.1000 | |
| 内因性ペルオキシダーゼ ブロック溶液 (3% 濃度 H2O2): | 40 mL 過酸化水素 (30% w/w) 360 mL メタノール. 使用前に準備 | ||
| 過酸化水素 (30% w/w) | シャルラウ | HI0136 | |
| メタノール | シグマアルドリッチ | 322415-2L | |
| ギ酸98% | メルク | 1.00264.1000 | 原液 |
| クロトーム | シャンドン-AS325 | ミクロトーム | シャンドン-AS325 |
| 埋込媒体 Entellan | Merck | 107960 | すぐに使用できます。 |
| TBS中の正常血清(20%)ブロック溶液: Horse normal serum | Gibco | 16050-122 | アッセイのセクション数に応じて最終容量を準備します (200 µセクションあたりの溶液のL)。 |
| 一次抗体抗PrPマウスMAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 非定型のスクレイピー、子宮頸部、ネコ科のヒツジを含む。bovine. アッセイのセクション数(200 µL of solution per section) と抗体希釈、TBS で最終容量を調製し、二次抗体が産生された種からの正常血清の 10% を添加した (馬の正常血清) 通常の抗体希釈: MAb 2G11 1/100 しかし、作業希釈は、最も低いバックグラウンドで最強の標識を与えるための濃度を得るために、すべての新しいバッチで確立する必要があります。保管するには、最低10 &muのアリコート量を凍結します。滅菌マイクロチューブにLを入れます。解凍して、一度に1つのアリコートを使用してください。 |
| 一次抗体 抗PrP マウス MAb 12F10 | ケイマン 化学会社 | 189710 | PrP142-160 ウシ、ovine には適していません 通常の抗体希釈:1/200ですが、作業希釈も確立する必要があります。MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTMチャンバー | Thermo Scientific | ||
| シャンドン・セクエンツァ®免疫染色センター | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza®免疫染色スライドラック | Thermo Scientific | 73310017 | |
| 溶液クエン酸緩衝液(10 mM pH 6.1): | 2.55 g クエン酸三ナトリウム二水和物 および 0.255 g クエン酸 1 リットルの精製水に 10 mM クエン酸溶液 (500 mL 精製水に 1.05 g クエン酸) を使用して、作業溶液の pH を 6.1 に調整します。 アッセイ当日に調製します。 | ||
| クエン酸三ナトリウム二水和物 | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| クエン酸 | シグマ アルドリッチ | C0759 | |
| 染色ジャーとバスケット | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus 顕微鏡スライド | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline Solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (ストック溶液 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g および NaCl 80 g in 800 mL 精製水.塩酸37%を使用してストック溶液のpHを調整し、精製水で最終容量を1リットルに調整します(5± 3°C 2ヶ月まで) TBS原液をアッセイ日に1/10希釈します。 | ||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW 試薬 | 251769 | 原液 |
参考文献
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and met....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
