方法論記事

リ ケッチア 属菌を蛍光タンパク質発現シャトルベクターでダニ細胞株に形質転換するエレクトロポレーション法

DOI：

10.3791/64562

⸱

2022年10月11日

 ,  ,  , 
1Department of Entomology, University of Minnesota

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エレクトロポレーションは、外因性DNAを リケッチア属に導入するための迅速で広く採用されている方法です。このプロトコルは、 リケッチア属における偏性細胞内細菌の形質転換のための有用なエレクトロポレーション法を提供する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リケッチア症は、感染した節足動物ベクターの咬傷を介して脊椎動物の宿主に伝染する可能性のある リケッチア 属に属する広範囲の偏性細胞内細菌によって引き起こされます。今日まで、新興または再出現の流行性リケッチアは、診断方法が限られており、標準化されておらず、普遍的にアクセスできないため、診断が困難なため、公衆衛生上のリスクのままです。徴候や症状の認識の欠如に起因する誤診は、抗生物質治療の遅れや健康状態の悪化につながる可能性があります。 リケッチア の特徴を包括的に理解することで、最終的には臨床診断、評価、および治療が改善され、病気の制御と予防が改善されます。

リケッチア遺伝子の機能的研究は、病因におけるリケッチア遺伝子の役割を理解するために重要です。本論文では、シャトルベクターpRAM18dSFAを用いたリケ ッチア・パーケリ 株Tate's Hellのエレクトロポレーションの手順と、抗生物質(スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン)によるダニ細胞培養における形質転換 R. parkeri の選択について説明します。共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いてダニ細胞における形質転換 R.パーケリ の局在化のための方法も記載されており、ベクター細胞株における形質転換を確認するための有用な技術である。同様のアプローチは、他のリケッチアの形質転換にも適しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リケッチア症は、リケッチア属(リケッチア科、リケッチア目)に属する広範囲の偏性細胞内細菌によって引き起こされます。リケッチア属は、系統学的特徴に基づいて4つの主要なグループに分類されます1,2:最も重篤で致命的なダニ媒介性リケッチアを引き起こすリケッチアを含む斑点熱グループ(SFG)、チフスグループ(TG、例えば、流行性発疹チフスの病原体であるリケッチアプロワゼキイ)、 移行群(TRG、例えば、ノミ媒介性紅斑熱の原因物質であるリケッチア・フェリス)、および祖先群(AG、例えば、リケッチア・ベリイ)。

最も古い既知のベクター媒介性疾患の中で、リケッチア症は主に、ダニ、ノミ、シラミ、ダニなどの感染した節足動物ベクターの咬傷を介した病原体の伝染に続いて獲得されます3,4。効果的な抗菌薬の発見は治療成績を改善しましたが、新興および再出現の流行性リケッチア症は、従来の予防および管理戦略に挑戦し続けています。したがって、リケッチア/宿主/ベクター相互作用の包括的な理解は、最終的にこれらの古代の病気を予防および治療するための新しいアプローチを開発するための強力な基盤を確立するでしょう。

自然界では、細菌の遺伝子水平伝播(HGT)は、結合、形質導入、および形質転換によって発生します5。インビトロ細菌形質転換はこれらのHGTの概念を利用しますが、リケッチアの細胞内性質にはいくつかの課題があります。異なる種のリケッチアにおける成長条件の制限とよく理解されていない抱合および形質導入システムは、リケッチアにおける接合および形質導入法の適用を妨げている6,7,8。他の偏性細胞内細菌属(クラミジア、コクシエラ、アナプラズマ、エールリキアなど)と比較して、リケッチア属は細胞質内の成長および複製戦略に関して異なり、その独特のライフスタイルの特徴のためにリケッチアの遺伝子組み換えに特定の課題を課します9。

リケッチアの遺伝子組み換えを試みる際に克服すべき最初のハードルは、形質転換を成功させることです。したがって、高い形質転換効率で実現可能なアプローチを設計することは、リケッチアの遺伝子ツールを開発する上で非常に価値があります。ここでは、リケッチア・プロワゼキイ、リケッチア・チフス、リケッチア・コノリイ、リケッチア・パーケリ、リケッチア・モンタネンシス、リケッチア・ベリー、リケッチア・ピーコッキイ、リケッチア・ブフネリなど、いくつかの種のリケッチアに外因性DNAをうまく導入するために使用されている広く認識されている形質転換法であるエレクトロポレーションに焦点を当てます10,11,12 、13,14,15,16。

本論文では、遠赤色蛍光タンパク質であるmKATEとスペクチノマイシン耐性を付与するように設計されたaaR/SCプラスミドpRAM18に由来するシャトルベクターpRAM18dSFAを用いて、R.パーケリ株Tate's Hell(アクセッション:GCA_000965145.1)のエレクトロポレーションの手順について説明します13,15,20。形質転換されたR.パーケリは、ダニ細胞株における抗生物質選択下で生存および安定に維持される。さらに、共焦点顕微鏡による生きたダニ細胞における形質転換R. parkeriの局在化が、ベクター細胞株の形質転換率の質を評価するために使用できることを示しています。

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プロトコル

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1. ダニ細胞培養からの R. parkeri の増殖と精製

注:すべての細胞培養手順は、クラスIIバイオセーフティキャビネットで実行されます。

  1. 準備 R. parkeri-感染したダニ細胞
    1. ISE6細胞を、5%ウシ胎児血清(FBS)、5%トリプトースリン酸ブロス(TPB)、および0.1%リポタンパク質濃縮物(LPC)を添加したL15C300培地17中の34°Cの25cm2細胞培養フラスコ中で増殖させる。
      注:ISE6(Ixodes scapularis胚由来細胞株)は、多くの研究室で広く使用されているダニ細胞株であり、したがって、ダニと病原体の相互作用を研究するために不可欠なモデルです17,18,19。ISE6細胞の増殖速度は哺乳類細胞の増殖速度よりも遅く、集団倍加時間は≥72時間です。たとえば、100%コンフルエントな培養から1:5の比率で昇温したISE6細胞は、100%のコンフルエントさを取り戻すまでに3〜4週間かかります。健康なISE6細胞は、一般に、多数の付着フィラメント17で丸みを帯びるであろう。
    2. 光学顕微鏡下で血球計算盤でISE6細胞をカウントします。~106 細胞/mL(100%コンフルエント)の濃度で使用します。
      1. フラスコから細胞を培地で穏やかに洗い流し、ピペッティングによって細胞を分散させて、均質な細胞懸濁液を生成します。血球計算盤とカバーガラスの間に20 μLの細胞懸濁液を加え、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
    3. 宿主無細胞野生型R. parkeri 20(平均数:5 × 10 7-10 ×10 7)を25cm2細胞培養フラスコ内のISE6細胞培養物に加える。感染したR. parkeri細胞培養物を、L15C300培地、10%FBS、5%TPB、0.1%LPC、0.25%重炭酸ナトリウム(NaHCO3)、および25 mM HEPESからなる5 mLの完全培地中で34°Cで、細胞の90%〜100%が感染するまでインキュベートします。
      注:ISE6細胞における R.パーケリ の感染率はギムザ染色によって決定され、90%〜100%感染に達するまでの潜伏時間は平均して5日から7日の範囲です。
    4. ギムザ染色による感染率を決定します。
      1. バイオセーフティキャビネットで、感染した細胞培養物を再懸濁し、50 μLの懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。
      2. 懸濁液を完全培地(1:5希釈)で希釈し、113 × g の遠心分離機を使用して100 μLをガラス顕微鏡スライド上に5分間遠心分離します。生きた R.パーケリ を封じ込めておくには、遠心分離機から取り外すように設計された密閉ローターを備えた遠心分離機を使用してください。これにより、密閉されたローターをフードに出し入れすることができます。
        注: R.パー ケリは遠心分離前にまだ生きているので、リケッチアが殺されるまでサンプルを封じ込める必要があります。したがって、 R. parkeri 培養物をスライド上に回転させるために使用される遠心分離機は、遠心分離機から持ち上げられるように設計された密閉されたローターを備えている必要があります。ローターを層流フードに入れた状態で、サンプルを漏斗顕微鏡スライドアセンブリにロードし、ローターを再シールして、密閉されたローターを遠心分離機に戻します。次に、遠心分離機の電源を入れると、サンプルが顕微鏡スライドに堆積されます。実行が終了したら、密閉されたローターを遠心分離機から取り外し、層流フードに入れます。そこで、ローターの蓋を開け、フード内の漏斗顕微鏡スライドアセンブリを降ろします。乾いたら、顕微鏡スライドガラスを無水メタノールに浸すと、すべての病原体が死滅します。漏斗と金属キャリアは希釈されたDMQに沈められ、 R. parkeriを殺します。
      3. スライドを風乾し、室温(RT)で5分間無水メタノールに固定します。
      4. スライドをギムザ染色剤(ソーレンソン緩衝液中4%、pH 6.6)で37°Cで30分間染色し、水で5秒間リンスします。
      5. 光学顕微鏡で感染率(リケッチアに感染した細胞数/100細胞)を決定します。
        注: 図1 は、典型的なギムザ染色の結果を示しています。
  2. 無細胞R.パーケリの調製
    注:培養中の細胞の90%〜100%が感染している場合は、リケッチアをISE6細胞から分離し、エレクトロポレーションを実行する必要があります。
    1. 滅菌済みの60-90炭化ケイ素グリットを滅菌済みの2 mLマイクロ遠心チューブに約0.2 mLの容量まで加えます。
    2. 100% R. parkeri感染培養物から2 mLの培地を除去し(ステップ1.1.3)、残りの3 mLの培地に細胞を再懸濁します。
    3. この懸濁液の等量をステップ1.2.1で準備したチューブに移します。
    4. 各チューブを高速で30秒間ボルテックスしてから、チューブを氷の上に置きます。重力によって数秒以内に砂利を落ち着かせます。
    5. クラスIIバイオセーフティキャビネットでは、プランジャーを伸ばし、プランジャーの端を15 mLコニカルチューブ用のポリスチレンベースに固定した滅菌5 mLルアーロックシリンジを用意します。
    6. 適切なピペッターに取り付けられた滅菌済みの1 mLバリアピペットチップを使用して、グリットを吸引しないように注意しながら、ボルテックスされた細胞ライセートの上清をチューブから取り除きます。ピペットチップをシリンジハブ開口部に挿入し、穏やかな圧力で内容物をシリンジに排出します。あるいは、ゴム球で操作する滅菌バリア2 mLパスツールピペットを使用してください。
    7. 滅菌した2 μmの孔径フィルターをシリンジハブに取り付け、ステップ1.2.6の R.パーケリ培養液を滅菌1.5 mLチューブにろ過します。
    8. 13,600 × g、4°C、5分間遠心分離によりR. parkeriを回収し、上清を廃棄する。
    9. ペレットを1.2 mLの氷冷300 mMショ糖に再懸濁し、13,600 × g で4°Cで5分間遠心分離します。再懸濁と遠心分離を繰り返して、合計2回のショ糖洗浄を行います。
    10. R. parkeri ペレットを、形質転換ごとに 50 μL の氷冷 300 mM スクロース中の 1 本の冷やした滅菌済み 1.5 mL マイクロ遠心チューブに混ぜ合わせます。R. parkeriの1つの25 cm 2フラスコは、2〜3回の形質転換に十分なリケッチアを提供するので、100〜150 μLの300 mMコールドスクロースを加えます。
      注:必要に応じて、リケッチアの数はペトロフハウザー計数チャンバーを使用して計算できます。5 × 107 -10 ×10 7 無細胞 R.パーケリの初期接種を使用する場合、90%〜100%の感染に達するまでに平均5〜7日かかり、約5 ×10 7-10 ×10 10 無細胞 R.パーケリが得られます。
    11. ペレットが完全に分散するまでピペッティングでペレットを静かに再懸濁します。サンプルを冷却した滅菌済み 1.5 mL マイクロ遠心チューブで 50 μL に分けます。
      注:所望により、リケッチアの生存率は、蛍光色素 21による染色後のフローサイトメトリーによって評価され得る。

2. pRAM18dSFAプラスミドによる R.パーケリ の形質転換

  1. 氷上で、50 μLのR. parkeri懸濁液を含む各チューブに3 μgのエンドトキシンフリーpRAM18dSFAプラスミドDNA13,15,20を加え、ピペットチップで混合物を穏やかに、しかし徹底的に攪拌します。
    注:プラスミドDNAを調製する場合は、エンドトキシン除去ステップを含む精製キットを使用して、エンドトキシンフリーのプラスミドDNA23を生成します。R . parkeri 懸濁液50 μLあたり1 μgから3 μgの範囲のプラスミド濃度が形質転換に成功し、プラスミドの量を10 μgに増やすと形質転換が阻害されることが分かった。
  2. 上記のDNAと R.パーケリ の混合物を冷やした滅菌済みの0.1 cmギャップエレクトロポレーションキュベットに移し(混合物が均等に分散するまでキュベットを静かにたたきます)、氷の上に10〜30分間置きます。
  3. ISE6細胞の100%コンフルエント培養から培地を除去し、NaHCO 3およびHEPESバッファーを含む1.5 mLの新しい培地に細胞層を再懸濁します(上記のステップ1.1.3で説明)。変換ごとにコンフルエントな細胞のフラスコを1つ使用します。
  4. 再懸濁した細胞を滅菌2mLマイクロ遠心チューブ(ISE6細胞の25cm2フラスコあたり1本のチューブ)に移す。
  5. エレクトロポレーターを使用して、 R.パーケリ/pRAM18dSFA混合物を1.8 KV、200オーム、25 μFでエレクトロポレーションします。
  6. 滅菌済みの拡張チップトランスファーピペットを使用して、少量のISE6細胞懸濁液をキュベットに移し(ステップ2.4)、液体をゆっくりと上下に引っ張ってキュベットを洗い流します。残りのISE6細胞懸濁液を含む2 mLマイクロ遠心チューブに混合物を移し、形質転換混合物を細胞と穏やかに混合します。
  7. 形質転換したサンプルをRTで700 × g で2分間遠心分離し、次にRTでさらに1分間遠心分離速度を13,600 × g に上げます。
    注:2つの遠心分離速度は、細胞とのリケッチアル結合と細胞への侵入を促進します:ISE6細胞をプルダウンするために700 × g を使用し、リケッチアをプルダウンするために13,600 × g を使用します。
  8. サンプルをRTまたは34°Cで15分から1時間放置します。
  9. ピペッターに取り付けられた滅菌2 mLバリアピペットチップを使用して、ISE6細胞中の形質転換体(2つまたは3つ)を再懸濁し、NaHCO 3およびHEPESバッファーを含む3.5 mLの新しい培地を含む2つまたは3つの25 cm2細胞培養フラスコに移します。あるいは、ゴム球で操作する滅菌バリア2 mLパスツールピペットを使用してください。
  10. フラスコを揺り動かして混合物を均一に広げ、34°Cでインキュベートします。
  11. 16〜24時間後、ステップ2.10で各フラスコに10 μLのスペクチノマイシン(50 mg / mL)と10 μLのストレプトマイシン(50 mg / mL)を追加します。

3. 形質転換したR. パーケリの観察

注:ローダミン/ TRITCフィルターを備えた落射蛍光顕微鏡を使用して、ステップ2.11で準備したフラスコを3〜7日後に観察します。培養物(5〜14日)においてプラークが明らかになると、形質転換 R. parkeri はpRAM18dSFAプラスミド上にコードされる赤色蛍光タンパク質mKATEを発現していることがわかる。

  1. 共焦点顕微鏡
    1. ステップ2.11フラスコから細胞培養を再懸濁し、これらの細胞培養液100 μLを5 μLのHoechst 33342溶液と暗所でRTで10〜30分間混合します。
      注:Hoechst 33342は、生きたダニ細胞のDNAに結合し、青色蛍光を発する細胞透過性の核対比染色です。
    2. 50 μLの混合物を5 × g の遠心分離機を使用してガラス顕微鏡スライド上に3分間遠心分離します。
    3. スライド上に堆積した細胞のスポットに3 μLの1x PBSを加え、カバースリップでオーバーレイし、共焦点顕微鏡(対物レンズ60倍)で観察します。蛍光イメージングには、以下の励起および発光パラメータを使用します:4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)の場合、350 nmでの励起、470 nmでの発光。テトラメチルローダミン(TRITC)の場合、557 nmでの励起、576 nmでの発光。

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結果

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ギムザ染色後の光学顕微鏡下でのISE6細胞におけるR. parkeriの形態を図1に示す。図2において、ISE6細胞において赤色蛍光タンパク質を発現する形質転換R. parkeriが共焦点顕微鏡を用いて示されている。(A)インキュベーションの7日目から(B)10日目にかけて、ISE6細胞(青色、核に相当)における形質転換R.パーケリ(赤色)の感染率の実質的な増加がある。

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ディスカッション

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ここでは、シャトルプラスミドpRAM18dSFAにコードされた外因性DNAをエレクトロポレーションを用いてリケッチアに導入する方法を実証する。この手順では、無細胞リケッチアを宿主細胞から精製し、リケッチアシャトルベクターで形質転換し、感染のためにダニ細胞上に放出した。また、ダニ細胞における赤色蛍光タンパク質発現 R.パーケリ を検出するための共焦点免疫蛍光手順も記載される。同様の方法は、他の リケッチア 種にも適用可能であり、さらなる修飾により、プラスミドを維持することができる他の偏性細胞内細菌に適応できる可能性がある。

このプロトコルにおける形質転換を成功させるには、外因性DNA、リケッチア属細菌、および適切なタイプの宿主細胞22の3つの要素が必要である。特定の研究目標に応じて、これらのコンポーネントを変更できます。まず、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシン選択マーカーを含み、mKATE(遠赤色蛍光タンパク質)を発現するpRAM18dSFAプラスミド

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利益相反は宣言されていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ティモシー・J・クルッティとベンジャミン・カルの洞察に満ちた議論と提案に感謝します。この研究は、NIHからのU.G.M.への助成金(2R01AI049424)とミネソタ農業試験場からのU.G.M.への助成金(MIN-17-078)によって財政的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.1 cm ギャップ遺伝子パルサーエレクトロポレーションキュベットBio-Rad1652083
2 μm細孔径フィルター GE Healthcare Life Sciences Whatman6783-2520
5 mL ルアーロックシリンジ BD309646
60-90 炭化ケイ素グリット 株式会社LORTONE 591-056
絶対メタノール フィッシャーサイエンティフィックA457-4
バクトトリプトースリン酸ブロス BD260300
Cytospin遠心分離機 Cytospin4Thermo Fisher ScientificA78300003ローターは取り外し可能なので、ローター全体をフードに入れて感染性サンプルをロードできます
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)QIAGEN12362エンドトキシンフリーのpRAM18dSFAプラスミド
拡張ファインチップトランスファーピペット パーフェクターサイエンティフィTP03-5301
シ胎児血清 Gemini Bio900-108FBSバッチは、ISE6細胞がその中で良好に増殖することを確認するためにテストする必要があります。
Gene Pulser II エレクトロポレーター パルスコントローラー PLUSBio-Rad165-2105 & 165-2110
血球計算盤サーモフィッシャーサイエンティフィック267110
HEPESMillipore-SigmaH4034
ImageJ フィジー国立衛生研究所生画像編集
KaryoMAX Giemsa 染色 ギブコ 2021-10-30
LeibovitzのL-15中型Gibco41300039
リポタンパク質濃縮物 MP Biomedicals191476
Nikon Diaphotニコン落射蛍光顕微鏡
NucBlue Live ReadyProbes 試薬 サーモフィッシャーサイエンティフィックR37605
オリンパス ディスクスキャニングユニット(DSU)共焦点顕微鏡 オリンパス
Petroff-Hausser 計数室Hausser Scientific チャンバー3900
重炭酸ナトリウムミリポアシグマS5761
ボルテックスフィッシャーボルテックスジーニー212-812
ックウ

参考文献

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