ヒドロゲル中でのオルガノイドおよびスフェロイド全体の培養、凍結、加工、イメージング

細胞研究と治療の未来は、3D細胞培養にあります^1,2,3。オルガノイドモデルとスフェロイドモデルは、人体の発達、生理学、および疾患を模倣するより良いモデルを作成することにより、in vitro実験と動物モデルの間のギャップを埋めます4,5,6,7,8,9。ただし、これらのモデルの再現性と再現性は依然として困難です。さらに、現在の技術でこれらの構造を取り扱い、収穫、移送、および遠心分離すると、多くの条件でオルガノイドとスフェロイドが失われたり損傷したりし、結果に大きな影響を与えます。

組織学的染色、免疫組織化学染色、免疫蛍光標識、および凍結保存のための多くのプロトコルにもかかわらず、実験条件の標準化、取り扱い、およびこれらの繊細な構造を紛失または損傷することなく処理することに関連する普遍的なアプローチはありません。現在のプロトコルはまた、信じられないほど長く、数日から数週間に交互に、様々な試薬^10、11、12、^13、14を用いた複雑な手順を含む。さらに、細胞培養容器とクライオバイアルの間で3D成長構造を採取、ピペッティング、遠心分離、および移すと、構造の位置と機械的な力が変化し、最終的にはオルガノイドとスフェロイドの分化と成熟に影響を与えます。組織トポロジー、細胞の位置、および機械的な力が細胞の分化と成熟に大きな影響を与えることが報告されています⁶、^15、16、17。

そのため、現在の従来技術を改良して、安定した品質のオルガノイドやスフェロイドを作製することが望ましい。遠心分離および上記の他のステップをスキップし、複数のプロセスの最初から最後まで単一の安全な環境で材料を提供する方法/デバイスは、最も一貫性のある信頼性の高いデータに到達するために有益です。さらに、これにより、時間、労力、およびコストの制約が軽減されます。

ここで説明する多目的デバイス(MD)は、オルガノイドとスフェロイドの複数のプロセスに対して単一の安全な環境を提供します(補足図 1)。このデバイスと補完プロトコルにより、収穫、ピペッティング、移送、遠心分離のステップが不要になります。オルガノイドとスフェロイドは、連続プロセスの間、 in vitro 環境にとどまります。この環境は、主に、市販のヒドロゲルのような天然または合成の細胞外マトリックス成分を含む。言い換えれば、ここで説明する方法では、オルガノイド/スフェロイドのホールマウントサンプルを、ヒドロゲルドロップ中に処理、検査、および凍結することができます。

この生体適合性デバイスは、60°Cから-160°Cの温度に耐性があるため、-160°Cの液体窒素タンクでオルガノイド/ステロイドを復元したり、60°Cで電子顕微鏡用の樹脂ブロックを調製したりすることができます。 デバイスのニッチは、以前の研究に基づいて、3D成長構造のための限られたスペースを定義し、スフェロイドまたはオルガノイドの形成を刺激するように設計されています¹⁸、¹⁹、^20、21、^22、23。デバイスのその部分は透明で、高い光学品質を提供する特定のプラスチックが含まれています(屈折率:1.43、アッベ値:58、厚さ:7.8ミル[0.0078インチまたは198μm])。ニッチと周囲の「側面」部分の両方が自家蛍光を引き起こします。中央の透明なニッチは80 mm 2の面積を持ち、側面部分は600 mm²です。容器の深さは15 mm、厚さは1.5 mmです。これらの特長に加え、装置の大きさやデザイン性などにより、各種ハイテク顕微鏡での観察や電子顕微鏡検査用の試料作製が可能です(図2)。装置の閉鎖システムは2つの位置を提供し、1つは冷凍庫に密封され、もう1つはインキュベーター内のガスの流れを可能にする。CCK8増殖および細胞毒性アッセイは、従来の細胞培養皿と比較して細胞に対して同様の効果を示します(補足図2)。トリパンブルー排除試験は、MDでの細胞培養中に高い細胞生存率(94%)を示します(図3)。

単一の装置で1つのサンプルに対して行うことができるプロセスは、(1)培養、(2)組織学的染色、(3)免疫組織化学的および免疫蛍光標識を含む免疫染色、(4)凍結、(5)融解、(6)明視野、暗視野、蛍光、共焦点、および超解像顕微鏡などの光学顕微鏡下での検査、(7)コーティングおよび走査型電子顕微鏡下での直接検査、または(8)透過型電子顕微鏡の準備(図2)。

組織学的染色、免疫組織化学的標識、または蛍光標識オルガノイドおよびスフェロイドには異なる方法論が存在する¹⁰、^11、12、¹³、¹⁴、^24、25。ヒドロゲルからそれらを収穫することは、現在の技術の最初のそして主要なステップです。このステップの後、いくつかの方法では、ホールマウント免疫標識が可能になります。採取されたオルガノイドはパラフィンに包埋され、切片化され、他のオルガノイドの染色および免疫染色のために標識されます。ただし、セクションはサンプル全体を提示せず、構造の3Dアーキテクチャに関連する限られたデータのみを提供する場合があります。さらに、これらの3D構造の損傷と抗原性の喪失は、これらの技術のよく知られた副作用です。

この記事の顕微鏡検査のための補完的な新しいプロトコルにより、まだヒドロゲル中のマウントサンプル全体の分析が可能になります。ここで説明するプロトコルには、免疫組織化学用溶液(S-IHC)と免疫蛍光標識用溶液(S-IF)の2つの新しく開発された製剤が含まれています。これらのソリューションを使用した方法により、遠心分離、ピペッティング、繊細な構造の移送などの従来のワークフローの有害な影響がないため、研究者はより正確なデータを得ることができます。ここで説明するプロトコルはまた、採取、ブロッキング、クリアリング、および抗原賦活化のステップの必要性を排除し、手順全体を6〜8時間に短縮します。さらに、この方法論では、同じS-IFに1〜3個の抗体を同時に追加することができます。したがって、複数の標識実験の後でも同じ日に結果を得ることが可能であり、これはここで説明するプロトコルの別の利点です。従来のホールマウント免疫蛍光標識プロトコルは、通常、3日から数週間かかります^10、11、^12、13、14。

抗原性を低下させる別の有害なステップであるパラフィン包埋も省略されています。3D構造は、顕微鏡検査の最初から最後までin vitro環境にとどまります。3D構造は成長条件のままであるため、タンパク質の発現および局在データはin vivo条件をよりよく模倣します。この方法論は、サンプルの抗原発現に影響を与えるステップを排除するため、より正確な結果が期待されます。表1と表2は、これらの新しいプロトコルが、従来のワークフローと比較して、ステップを排除し、ラボでの時間と労力を節約し、コストと廃棄物を削減する方法を示しています。

上記の重要なステップに加えて、別の問題は、より高い細胞生存率でサンプルの3D構造を保存するための凍結保存培地および方法を提供することである²⁶、^27、28、²⁹、^30、31。凍結保存は、安定したモデルシステムを作成し、オルガノイドとスフェロイドのバイオバンキングを可能にするために不可欠です^32,33。元の3D構造全体をバイオバンキングすることで、健康状態や病気の自然な状態をより忠実に再現できます。重要な考慮事項は、凍結保存とオルガノイド/スフェロイドの解凍の利便性と信頼性です。 融解後のオルガノイド回収率は、現在のほとんどの技術では非常に低く、多くの場合50%未満です。しかし、最近の研究では、生存率が改善された有望な結果が示されています^26,27,28,29。Leeらは、15%DMSO 28を含むウィスコンシン大学の溶液を使用した場合、スフェロイド細胞の⁷⁸%が凍結保存後に生存することを実証した。細胞生存率は、新井らの研究で83%に増加した²⁹。ただし、3D構造は同じ特性と品質を維持できないため、凍結保存後の結果は大きく影響を受けます。さらに、無血清試薬は、製薬および診断現場での適正製造基準に必要です。 従来のワークフローでは、ウシ胎児血清(FBS)とジメチルスルホキシド(DMSO)を含む培地を緩慢凍結法に使用していましたが、どちらもハンディキャップに関連しています。FBSは動物由来の製品であり、バッチバリエーションがあります。DMSOは非常に成功した凍結保護剤ですが、特に解凍中の長期暴露は細胞毒性作用を引き起こす可能性があります^30,31。

この記事では、ヒドロゲル中のオルガノイド全体またはスフェロイド全体の凍結/解凍方法についても説明します。この研究では、オルガノイドとスフェロイドを凍結するための2つの処方が使用されます:(1)従来の凍結溶液(FS)を含む10%DMSOと、(2)血清およびDMSOを含まない凍結保存培地。この凍結保存培地には、現在の処方とは異なる細胞外マトリックス成分が含まれています。細胞外マトリックスは、プロテオグリカンと繊維状タンパク質の2つの主要なクラスの高分子で構成されており、これらは細胞構成成分の物理的な足場に不可欠ですが、組織の形態形成、分化、および恒常性に必要なプロセスも開始します34,35,36,37,38,39,40.コラーゲンは引張強度を提供し、細胞接着を調節し、走化性と遊走性をサポートし、組織発達を直接します³⁷。さらに、エラスチン繊維は、繰り返し伸張を受ける組織に反跳を与える³⁸。第3の繊維状タンパク質であるフィブロネクチンは、間質性細胞外マトリックスの組織化を指示し、細胞接着を媒介する上で重要な役割を果たし、細胞外メカノレギュレータ^ー39として機能する。Duらは、天然アクトミオシンモデル系⁴¹に対するニワトリコラーゲン加水分解物の凍結保護効果を実証した。彼らの結果は、コラーゲン加水分解物が氷結晶成長を阻害し、市販の凍結保護剤と同様にタンパク質の凍結変性と酸化を減らし、凍結融解サイクル後により良いゲル構造を提供できることを示唆しています。 したがって、凍結保存培地に細胞外マトリックス成分を添加すると、サンプルにとってより安全で保護的な環境が提供され、凍結融解後に生体構造が治癒するのをサポートします。

さらに、本研究では、生きたオルガノイドとスフェロイドの細胞質膜と核を、それらがまだヒドロゲル内にある間に標識するための簡単なプロトコルについて説明します。

1. オルガノイドとスフェロイドの培養

1. ヒドロゲルを氷の上に一晩(冷蔵庫または冷蔵室で)置き、解凍します。
2. 市販の多目的装置(MD; 材料表参照)を実験の1日前のインキュベーター(37°C、5%_CO2)に入れて加温する。
3. 滅菌済みのワイドエンドピペットチップを4°Cの冷蔵庫に入れます。
   注意: 手順1.1〜1.3は0日目に実行され、手順1.4〜1.11は1日目に実行されます。
4. ヒドロゲルを層流フード内の氷上に15分間置きます。
   1. オプション:メーカーの推奨に従って、ヒドロゲルを冷たい細胞培養培地で希釈します。
5. HepG2細胞(市販の肝細胞癌細胞株; 材料の表を参照)のペレットを含むチューブを氷上に置きます。
6. 予熱した装置のニッチ内に30〜35μLの100%ヒドロゲルをプレートして、ゲルドロップを作成します。
7. 各ヒドロゲルドロップの上部の中央に10,000個のHepG2細胞を置き(図2)、37°Cで15分間インキュベートします。
8. ヒドロゲルドロップを200 μLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と10%ウシ胎児血清で覆います。
9. MDの蓋を正しい位置に覆い、ガスの流れを可能にし、デバイスをインキュベーターに入れます。
10. 1日おきに10%FBSを含む200 μLのDMEMを細胞に供給します。
11. 倒立顕微鏡でスフェロイドの成長を確認します(図3)。回転楕円体形成は^{3日目以降} に始まります。 ビデオ1 は、ヒドロゲルドーム内のさまざまなレベルでのスフェロイドの位置を示しています。
    注:ヒドロゲルの滴の損傷を防ぐために、ヒドロゲルの周囲の液体を穏やかに吸引し、新しい液体をゆっくりと環境に加えることを強くお勧めします。

2. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドのヘマトキシリンおよびエオシン染色

1. 固定剤(4%パラホルムアルデヒド;PFA)、PBS、およびヘマトキシリン( 材料の表を参照)を37°Cにする。
2. ヒドロゲルドロップを囲む培地をピペットで吸引し、固定するために4%PFAを100〜200 μL加え、37°Cで15〜20分間インキュベートします。
3. 4%PFAを吸引し、200 μLのPBSを加えて、37°Cでそれぞれ5分間3回洗浄します。 次に、PBSを吸引し、200 μLのヘマトキシリン溶液と37°Cで15〜20分間インキュベートします。
4. ヘマトキシリンを吸引し、200 μLのdH₂Oを加えて、37°Cでそれぞれ10分間3回洗浄します。 dH₂Oを吸引し、200 μLのエタノールと37°Cで5〜10分間インキュベートします。
5. エタノールを吸引し、200 μLのエオシン( 材料表を参照)とともに37°Cで10分間インキュベートします。 エオシンを吸引し、200μLの_dH2Oを加えて室温(RT)で5分間洗浄します。
6. dH₂Oを吸引し、100 μLのグリセロールを加えて、封入媒体としてヒドロゲルドロップを覆います。
7. オプション:カバーガラスでニッチを取り付けます。このステップは、かなりの大きさのオルガノイド/スフェロイドを圧搾することを避けるために省略することができます。
8. MDの蓋をしっかり閉めて、検査まで乾燥しないようにしてください。サンプルは少なくとも6ヶ月間検査のために安定しています。

3. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの免疫組織化学

1. 市販の免疫組織化学用溶液(S-IHC; 材料の表を参照)を37°Cに温めます。
2. ヒドロゲル中のオルガノイドまたはスフェロイドを、3%過酸化水素(H 2 O 2)中の200 μLのdH₂Oと共に37°Cで5分間インキュベートします。
3. 過酸化水素水を吸引し、_dH2O中で37°Cで5分間洗浄する。 _dH2Oを吸引し、100 μLのS-IHCと37°Cでそれぞれ10分間インキュベートします。
4. S-IHCを吸引し、S-IHCで希釈した100 μLの一次抗体( 材料の表を参照)とともに37°Cで1〜2時間インキュベートします(作業希釈に関するメーカーの推奨事項に従います)。
5. 一次抗体溶液を吸引し、100 μLのS-IHC 3xと共に37°Cでそれぞれ5分間インキュベートします。
6. 100 μLのS-IHCを吸引し、ビオチン化二次抗体( 材料の表を参照)とともに37°Cで10分間インキュベートします。
7. 二次抗体溶液を吸引し、100 μLのS-IHC 3xと共に37°Cでそれぞれ5分間インキュベートします。 S-IHCを吸引し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン( 材料表を参照)100 μLとともに37°Cで10分間インキュベートします。
8. HRP標識ストレプトアビジンを吸引し、100 μLのS-IHC 3xとともに37°Cでそれぞれ5分間インキュベートします。
9. S-IHCを吸引し、100 μLのDAB / AEC色原体溶液混合物( 材料の表を参照)で37°Cで5〜10分間インキュベートします。
10. 光学顕微鏡で染色の強度を監視します。
11. dH 2 O 3xでそれぞれ₂分間洗浄します。
12. オプション:核対比染色のために100 μLのヘマトキシリン( 材料の表を参照)で37°Cで5分間インキュベートします。
13. ヘマトキシリンを吸引し、dH₂Oで5分間洗浄する。
14. dH₂Oを吸引し、ヒドロゲルドロップを封入剤として100μLのグリセロールで覆います。
15. 顕微鏡検査までMDの蓋をしっかりと閉めます。
    注:S-IHCはこれらのステップを排除するため、このプロトコルでは抗原賦活化およびタンパク質ブロッキングステップは省略されています。

4. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの免疫蛍光標識

1. 次の材料を37°Cに温めます:4%PFA、PBS、S-IF、S-IF中の一次抗体溶液、S-IF中の二次抗体溶液、核染色、およびグリセロール( 材料の表を参照)。
2. 細胞培養培地を吸引し、200 μLの4%PFAで37°Cで15〜30分間固定します。 固定液を吸引し、S-IF 3xで37°Cでそれぞれ10分間洗浄します。
3. ニッチを囲む側にdH₂Oを追加して、次の手順で湿度を提供します。
4. ヒドロゲルドロップの周囲のS-IFを吸引し、ヒドロゲルドロップをS-IF中の100 μLの一次抗体溶液( 材料の表を参照)とともに37°Cで30〜60分間インキュベートします。
5. 一次抗体溶液を吸引し、S-IF3xで37°Cでそれぞれ10分間洗浄します。
6. S-IFを吸引し、S-IF中の100 μLの二次抗体溶液( 材料の表を参照)とともに、暗所で37°Cで30〜60分間インキュベートします。
7. 二次抗体溶液を吸引し、暗所にて37°CでPBS 3xでそれぞれ10分間洗浄する。
8. PBSを吸引し、封入培地またはグリセロールを含む100 μLの核DNA染色剤とともに、暗所で37°Cでインキュベートします。
9. 乾燥を避けるためにニッチをグリセロールで満たします。
10. オプション:カバーガラスでニッチを覆います。このステップは、オルガノイド/スフェロイドの圧迫を避けるために省略することができます。
11. MDをしっかりと閉じます。MDのサンプルは、蛍光の損失を最小限に抑えながら、暗所で4°Cで少なくとも6か月間保存できます。
12. 共焦点顕微鏡検査には、全チャンネルのピンホール値を20.1に設定し、ゲインマスター定数を488nmで550、550nmで485、594nmで450に保ち、すべての実験でレーザー出力を一定に保ち、最低パーセンテージを2.0に設定します。
    注:一次抗体:抗Na-K ATPアーゼ(1:100)、抗アルギナーゼ(1:50)、抗アルブミン(1:50)、抗ベータガラクトシダーゼ(1:25)、抗ミトコンドリア抗体(1:100)、抗ゴルジ抗体(1:50)、抗サイトケラチン5(1:100)、Ov6抗体(1:100)。二次抗体:ヤギ抗ウサギIgG(H + L)-488、ヤギ抗ウサギIgG(H + L)-550、ヤギ抗マウスIgG(H + L)-488、ヤギ抗マウスIgG(H + L)-550、ヤギ抗ニワトリIgY(H + L)-647。すべての二次抗体の希釈率は1:100です。さらに、コンジュゲート抗体であるFITC-ファロイジン(1:100)も使用されます( 材料表を参照)。

5. ヒドロゲル中の生体オルガノイドおよびスフェロイドの原形質膜および核標識

1. メーカーの推奨( 材料表を参照)に従って、ハンクの平衡塩溶液(HBSS)にAlexa蛍光小麦胚芽凝集素(5.0 μg/mL)とヘキスト(2 μM)を含む標識溶液を調製し、37°Cまで温めます。
2. 細胞培養培地を吸引し、ヒドロゲルドロップを覆うために100 μLの標識溶液を加えます。37°Cで15〜30分間インキュベートします。
3. 標識溶液を除去し、PBS 2xで37°Cでそれぞれ10分間2回洗浄します。 オプション:200 μLの4%ホルムアルデヒドで37°Cで15分間固定します。
4. ヒドロゲルドロップを封入媒体としてグリセロールで覆います。オプション:カバーガラスでニッチを取り付けます。
5. MDの蓋をしっかりと閉め、蛍光/共焦点顕微鏡検査まで暗所で冷蔵保管してください。少なくとも6ヶ月間安定しています。

6. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの凍結融解

1. 以下の手順に従ってオルガノイドを凍結します。
   1. 市販の凍結液(FS; 材料表参照)を37°Cに温めます。
   2. ヒドロゲルドームを囲む細胞培養培地を穏やかに吸引する。
   3. 200 μLのFSを穏やかに加えます。サンプルをFSとともに37°Cで1時間インキュベートします。
   4. デバイスの蓋をしっかりと閉め、フォームボックスに入れます。 補足図3に示すように、このフォームボックスを別のフォームボックスに入れます。両方のフォームボックスをしっかりと閉じます。互いの内側にある2つのフォームボックスは、-20°Cの冷凍庫でサンプルの1〜2°C / minの温度冷却勾配範囲を提供します。
   5. ボックスを-20°Cで2時間置きます。箱を-80°Cの冷凍庫に移し、一晩放置します。
   6. 箱からサンプルを取り出します。MDのサンプルは、-80°Cの冷凍庫で6ヶ月間保管できます。
   7. サンプルを含むMDを液体窒素タンクに移し、長期保存します。
2. 以下の手順に従ってオルガノイドを解凍します。
   1. サンプルを含むMDを冷凍庫/窒素タンクから取り出し、37°Cのインキュベーターに直接入れます。 37°Cで1時間インキュベートします。
   2. 200 μLの温かい培養培地をニッチ(FSと細胞培養培地の比率は1:1)に加え、37°Cで30分間インキュベートします。
   3. さらに温かい培養培地をニッチに追加し(FSと細胞培養培地の比率は1:2)、37°Cで30分間インキュベートします。
   4. 培地とFSの混合物を穏やかに吸引します。ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの走査型電子顕微鏡(ステップ7)および透過型電子顕微鏡(ステップ8)イメージングに進みます。

7. ホールマウントオルガノイド/スフェロイドの走査型電子顕微鏡

1. カルノフスキーの固定液および固定後溶液( 材料の表を参照)を室温(RT)に温めます。
2. ヒドロゲルを周囲の細胞培養培地をMDで吸引する。サンプルを層流フード内の氷上のMDに15分間置きます。
3. オルガノイド/スフェロイドを囲む液化ハイドロゲルを非常に穏やかに吸引します。限られた量のマトリゲルは、サンプルの損傷や損失を避けるためにニッチにとどまることができます。
4. カルノフスキーの固定液(2%PFA、0.15 Mカコジル酸緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒド、および2 mM CaCl₂; 材料表を参照)でRTで1時間固定します。
5. 固定液を穏やかに吸引し、蒸留水(dH₂O)でそれぞれ15分間3回洗浄します。
6. dH₂Oを穏やかに吸引し、固定後溶液(1%四酸化オスミウム水溶液[OsO₄]; 材料の表を参照)でRTで1時間固定します。
7. 固定後液を穏やかに吸引し、蒸留水(dH₂O)でそれぞれ15分間3回洗浄します。
8. エタノール(30%、50%、70%、80%、90%、96%、100%)、エタノール/アセトンの混合物(1:1、1:2)、および絶対アセトンをそれぞれRTで15分間、段階的な一連の脱水します。
9. 臨界点乾燥機で乾かします。
10. スパッタコーター( 材料表を参照)を使用して、デバイス内の試料を6 nmの金/パラジウムで90秒間コーティングします。
11. 真空モード(5 x 10-6 mA)で^2-3 kVのレンズ内二次電子検出器を備えた走査型電子顕微鏡下で観察します。作動距離8.1〜8.2 mm、675倍、1050倍、および1570倍の倍率で画像を撮影します。
    注:すべての手順はMDで実行されます。各ステップに200〜250μLの溶液を使用します。

8. ハイドロゲル中のホールマウントオルガノイド/スフェロイドの透過型電子顕微鏡

1. カルノフスキー固定液を37°Cに温めます。 ヒドロゲルを周囲の細胞培養培地をMDで吸引する。
2. サンプルをカルノフスキーの固定剤でRTで1時間固定します。dH₂O 3xでそれぞれ15分間洗浄します。
3. 2%OsO₄水溶液と2.5%フェロシアン化カリウムをRTで45分間ポストフィックスします。dH₂O 3xでそれぞれ10分間洗浄します。
4. 0.5%チオカルボヒドラジド(TCH; 材料の表を参照)中でRTで30分間インキュベートします。dH₂O 3xでそれぞれ10分間洗浄します。
5. 2%OsO₄水溶液中でRTで30分間インキュベートします。dH₂O 3xでそれぞれ10分間洗浄します。
6. 2%酢酸ウラニル溶液( 材料の表を参照)中でRTで1時間インキュベートします。
   注:このステップでは、スフェロイドを一晩4°Cに保つことができます。
7. アスパラギン酸鉛溶液( 材料の表を参照)中で60°Cで45分間インキュベートします。dH₂O 3xでそれぞれ10分間洗浄します。
8. 段階的な一連のエタノール(50%、70%、90%、100%[x2])と無水アセトンをRTでそれぞれ15分間脱水します。
9. (1:1; 1:2)アセトン/エポン樹脂と純粋なエポン樹脂の混合物( 材料の表を参照)でそれぞれ2時間RTで処理します。.
10. 樹脂を60°Cで一晩(最低16時間)重合します。重合後、 補足図4に示すようにMDから樹脂ブロックを取り外す。
11. レジンブロックをレジン接着剤で大きなブロックに取り付けます。ブロックをトリミングし、オルガノイドまたはスフェロイドの位置に到達します。
12. ウルトラミクロトームを使用して、半薄切片(1,000 nm)と極薄切片(60 nm)を取得します(材料表を参照)。
13. 100メッシュの銅グリッド上に極薄切片を置き、加速電圧30kVでSTEM検出器を備えた走査型電子顕微鏡下で観察します。作動距離44mm、倍率2580倍、5020倍、6060倍の画像をキャプチャします。
    注:各ステップに200〜250μLの溶液を使用します。ステップ 8.1 〜 8.10 は MD で実行されます。

本稿は、単一の独自に設計された環境でヒドロゲル中にオルガノイドまたはスフェロイド全体を培養、凍結、解凍、組織学的染色、免疫組織化学染色、免疫蛍光標識、コーティング、および処理するための多目的デバイス(MD)および補完的な方法論を表しています。現在の研究は、35 MDの35ヒドロゲルドロップでHepG2肝がんスフェロイドを調製するように設計されました。さらに、MDの肺オルガノイドは、オルガノイド研究の現在の方法論の結果を実証するために、例として免疫蛍光標識されました。

図1 は、ヒドロゲルドームを含む装置を詳しく見たものである。ニッチのサイズと形状は、オルガノイド/スフェロイドを含むヒドロゲルの保護環境を提供し、さまざまなプロセスで使用される試薬を節約するように設計されています。さらに、ニッチを囲む装置の側面部分は、免疫染色実験中の湿度チャンバーとして使用することができる。サンプルを供給する培地は、ヒドロゲルドロップの高さに応じて、100〜200μLの間で変化し得る。現在の研究では、多くのヒドロゲル、市販の細胞外マトリックス成分、および基底膜抽出物により、ユーザーが滴を調製できるため、ドームベースの方法に焦点を当てています。ただし、MDのニッチをヒドロゲルで満たし、その中の細胞を播種してオルガノイド/スフェロイドを生成することも可能です。この方法は、マトリックスの粘度がドームの調製を可能にしない場合、または実験に大量のオルガノイドが含まれる場合に好まれる可能性があります。滴剤を調製するためのヒドロゲルタイプおよびヒドロゲル/培地比は、細胞タイプ、実験デザイン、および培地によって異なり得る。 図 1 また、オルガノイド/スフェロイドがまだネイティブの in vitro 環境にある間に、明視野、共焦点、および走査型電子顕微鏡でオルガノイド/スフェロイドを調査できるようにするデバイスの設計を表します。

図2 は、ヒドロゲルに細胞を播種し、スフェロイドまたはオルガノイドの発生を調べる方法を示しています。多目的デバイスの設計と寸法もその図に示されています。 ビデオ 1は、ヒドロゲル内の3D成長スフェロイドの位置を示しています。 図 3は、3日目から21日目までのスフェロイドの成長のライブ画像を表しています。スフェロイドおよびオルガノイドの形成時間は、サンプルの性質に応じて変化し得る。例えば、HepG2細胞およびHEK細胞からのスフェロイドは3日以内に形成され、肝臓および胆道オルガノイドの形成は実験中に2週間続いた。

ヘマトキシリンおよびエオシン染色されたスフェロイドを図4に示します。この画像は、保存状態が良く、均一に染色されたスフェロイドを、さまざまなサイズとスフェロイドの融合で表しています。スフェロイドの中心にある生細胞は注目に値します。この画像は、異なるスフェロイドの細胞間の微妙なつながりも示しています。これらの脆弱な接続は、転写、ピペッティング、または遠心分離によって損傷するため、従来のワークフローでは視覚化できませんでした。図 5 肝細胞癌の診断と予後の最も一般的なマーカーの1つであるアルギナーゼに特異的な抗体によるスフェロイドの免疫染色を示します42,43。顕微鏡写真は、同じスフェロイド内の分化した肝臓癌細胞と未分化の肝癌細胞を明らかにします。この図には、ヘマトキシリンによる対比染色の有無にかかわらず画像が含まれています。研究者は、3D構造内の標識領域を区別するのが難しい場合に、ヘマトキシリンによる対比染色を省略することを選択する場合があります。

図6は、ヒドロゲル中の生きたオルガノイド/スフェロイドのホールマウント可視化のためのもう一つの簡単なプロトコル、すなわち生細胞膜および核染色を表しています。この方法論により、周辺と中央で同じ標識密度が可能になり、試薬の完全な浸透が示されます。図7、図8、および図9 は、それぞれ1つ、2つ、または3つの抗体で標識されたスフェロイドの代表的な画像を示す。 1〜3個の一次抗体を同時にS-IFで希釈します。同様に、実験に適した1〜3個のマッチング二次抗体をS-IFで同時に希釈する。免疫標識プロトコルにより、研究者は3D構造を紛失したり損傷したりすることなく、4〜6時間以内に3D構造をマークすることができます。背景は透明であり、ここで使用される技術は、追加の透明化、抗原賦活化、またはブロッキング方法/溶液を必要としません。この方法では、研究者は1つのステップで複数の抗体で検体を標識することもできます。換言すれば、ユーザは、1〜3個の一次抗体を含む1つの溶液と、1〜3個の二次抗体とマッチングする別の溶液を調製する。ここで説明するプロトコルは、従来の方法論における異なる抗体による連続的な標識ステップを排除します。

図10 は、スフェロイドの走査型および透過型電子顕微鏡像を表す。最初の行は、走査型電子顕微鏡下でのMDのスフェロイド全体の写真を示しています。2列目は、MDにホールマウントスフェロイドを含む樹脂ブロックを作製した後のスフェロイドの透過型電子顕微鏡像と、切片化および染色されたスフェロイドの画像です。保存状態の良い細胞小器官や細胞の他の微細構造の特徴は、サンプル全体の3D構造を保護するこの簡単なプロトコルの有効性を示しています。MDはまた、研究者がヒドロゲル中のマウントサンプル全体を凍結および解凍することを可能にする。 図 11 凍結前後のヒドロゲルドームとスフェロイドをより高い倍率で示します。ヒドロゲルドームの境界における不規則性は顕著である。しかし、凍結保存されたスフェロイドの真円度は、凍結前のスフェロイドと比較して、解凍後にほぼ安定しています。凍結/融解手順が3Dアーキテクチャ、細胞膜、および細胞生存率にどのように影響したかを示すために、融解の48時間後に生細胞膜および核標識法も適用されます。ジメチルスルホキシドを含む従来の凍結溶液と現在の新しく処方された溶液SFは、同様の結果を示しています。3D構造の75%以上がこのプロトコルで生き残ることができます。ただし、オルガノイドとスフェロイドに対する各製剤の長期的な副作用を明らかにするには、さらなる実験が必要です。

表1および表2は、ステップ数、期間、および廃棄物生産(すなわち、各ワークフローのプラスチック手袋、ピペットチップ、血清学的ピペット、遠心チューブ、マイクロ遠心チューブ、細胞培養容器、クライオバイアルなど)に基づいて、従来のワークフローとここで説明したワークフローを比較しています。

補足図1は、単一のMDで実行できる順次ステップを概略的に表している。 補足図2は、MDまたは従来のガラス底皿におけるHepG2細胞の細胞生存率、毒性、および増殖率を比較するために設計された実験の結果を示しています。補足図3は、MD内のサンプルを凍結するために使用されたフォームボックスを示しています。 補足図4は、MDから樹脂ブロックを取り出す手順をまとめたものです。補足図5には、免疫蛍光標識され、MDに残っている間に視覚化された気道オルガノイドの画像が含まれています。同様に、ビデオ 2は、MDにおける2つの免疫蛍光標識気道オルガノイドを示しています。最後に、補足図6は、従来のワークフローとここで説明するワークフローを使用して、凍結前後の生きたスフェロイドにおける細胞膜標識強度の平均強度を比較したグラフです。画像Jソフトウェアは、分析に使用されています。

図1:多目的細胞培養装置(MD)。 (A)デバイスの中央部分であるニッチ(N)は、連続プロセス中にヒドロゲルドロップ(D)で成長したオルガノイド/スフェロイドの保護環境を作り出すように設計されています。ニッチの周囲部分である側面(S)は、免疫染色実験中の加湿器チャンバーとして使用できます。(B)蓋の中央が透明なため、デバイスを閉じたときにオルガノイド/スフェロイドを観察できます。(C)MD中のオルガノイドを含むヒドロゲルドームは、染色するか、透過型電子顕微鏡用の樹脂ブロックに埋め込むことができる。蓋には、ハンギングドロップ方法論用のニッチ(N)も含まれています。装置のサイズと設計により、ユーザーは(D)明視野、(E)共焦点、および(F)走査型電子顕微鏡の下でオルガノイド/スフェロイドを調べることができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ヒドロゲル内の細胞を播種する。(A)ピペット内のセルペレットをドームの上部に挿入します。3〜5日後、スフェロイドはドーム内、特にドロップの周辺に見えるようになります。(B)ドーム内の各四半期から成長する回転楕円体の4つのライブ画像をキャプチャし、マージしました。スケールバー= 200μm。 (C)多目的装置(MD)の設計と寸法(センチメートル単位)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:3日目から21日目までのヒドロゲルドロップでのスフェロイドの発生。スケールバー= 200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:MD内のヘマトキシリンおよびエオシン染色されたホールマウントスフェロイド。隣接するスフェロイドまたは融合スフェロイドに位置するセル間の接続の視覚化。細胞間の繊細なプロセス(矢印)は、ヒドロゲル内のマウントサンプル全体が固定され、染色され、3D成長構造に損傷を与えることなく検査されるため、見えます。スケールバー:3日目、9日目= 50μm;7日目、17日目= 20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:MD内のヒドロゲル中の全マウントスフェロイドの免疫組織化学的染色。サンプルをアルギナーゼに特異的な抗体で免疫染色した。アルギナーゼ陽性(赤矢印)および陰性(黒矢印)細胞がスフェロイドに見られる。 画像は2つの実験からのものである:(A-C)なしおよび(D-F)ヘマトキシリンによる対比染色。スケールバー= 20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:ヒドロゲル中の生オルガノイドの共焦点画像。生きたオルガノイドを生細胞膜(WGA)および核染色剤(ヘキスト)で標識した。スケールバー= 20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:1つの抗体と核染色(Hoechst)を用いたヒドロゲル中のホールマウントスフェロイドの免疫蛍光標識。(A-C)上のパネルは、細胞膜中のNa−K ATPaseに特異的な抗体で標識されたスフェロイドを示す。(D-F)下のパネルは、肝がんスフェロイドにおける肝細胞がんに特異的な細胞質タンパク質であるアルギナーゼに特異的な別の抗体の位置を示しています。染色プロトコルの持続時間:6時間。スケールバー= 20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:2つの抗体と核染色(Hoechst)を含むヒドロゲル中のホールマウントスフェロイドの免疫蛍光標識。 (A-C)上のパネルは、アルブミンおよびOv6に特異的な2つの抗体で標識されたスフェロイドを示す。スケールバー = 5 μm。 (D-F) 下のパネルは、肝がんスフェロイドにおけるアルファフェトタンパク質とOv6の位置を示しています。 スケールバー= 20μm。染色プロトコルの持続時間:6時間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:3つの抗体と核染色(Hoechst)を含むヒドロゲル中のホールマウントスフェロイドの免疫蛍光標識。 (A-E)上パネルのスフェロイドは、アルギナーゼ、Na-K ATPase、およびβ-ガラクトシダーゼに特異的な抗体で標識されています。スケールバー = 10 μm. (F-J) 中央のパネルは、Ov6、β-ガラクトシダーゼ、およびα-フェトタンパク質で標識されたスフェロイドを示しています。スケールバー = 20 μm。 (K-O) 下パネルのスフェロイドは、FITCファロイジン、抗ミトコンドリア抗体、および抗ゴルジ抗体で標識されています。スケールバー= 20μm。高い標識特異性と低いバックグラウンドに注意してください。染色プロトコルの持続時間:6時間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図10:電子顕微鏡画像。(A-C)MDにおけるヒドロゲル中のスフェロイド全体の走査型電子顕微鏡像。スケールバー = 10 μm. (D-F) スフェロイド内の細胞の微細構造的特徴も透過型電子顕微鏡で可視化されています。スケールバー:(D)= 4μm;(E,F) = 2 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図11:凍結前後のスフェロイドのライブ画像。(A-F)ヒドロゲルドームの境界の不規則性は凍結後に明らかである。ただし、回転楕円体のサイズと真円度は似ています。(F)融解後に培養面での細胞遊走が見られる。(G-L)生細胞膜(WGA)および核染色(Hoechst)は、MD中のヒドロゲル中のスフェロイド全体を凍結する前後で、同様の細胞生存率および無傷の細胞膜を示す。スケールベース: (A、B、D、E) = 200 μm;(C,F,G-L) = 20 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:短期実験中の従来のワークフローと新しいワークフローのステップ数、時間、および廃棄物発生の比較。

表2:従来の免疫標識と新しい免疫標識プロトコルの比較。

ビデオ1:倒立位相差顕微鏡下でのスフェロイドを含むヒドロゲルのさまざまなレベルでの時系列画像。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:サイトケラチン5およびDAPIの抗体で標識された2つの気道オルガノイドの3D構造。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:実験の概要。 この回路図は、ヒドロゲル中のホールマウントオルガノイドを成長および検査するための一連の実験ステップを示しています。ここで説明する技術により、オルガノイドを成長、凍結、解凍、標識、およびさまざまな顕微鏡で調べることができます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:従来のガラス底皿またはMDにおけるHepG2細胞の細胞生存率、毒性、および増殖率の比較。 HepG2細胞を(A)従来のガラス底細胞培養皿または(B)MDで増殖させて、細胞の生存率と毒性を比較しました。(C)トリパンブルー排除試験を用いて、生存率を実証した。スケールバー= 20μm。結果を、(D−E)CCK8細胞毒性および(F)細胞増殖アッセイを用いて比較した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:2つのフォームボックスの配置。 一方のフォームボックスは、MD内のオルガノイドまたはスフェロイド全体のゆっくりとした凍結プロセス中に、もう一方のフォームボックスの内側に配置されます。*は2つのボックスを示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:樹脂の重合後にMDから樹脂ブロックを除去する方法を示す工程。(A)スフェロイドまたはオルガノイドを囲む樹脂ブロックをMDニッチの内部で調製し、重合する。(B-D)次に、適切な細い棒で、樹脂ブロックを押してニッチから取り除きます。(E)次に、樹脂ブロックを以下のプラスチックで除去します。(F-G)最後に、ブロックがまだプラスチックに取り付けられている場合は、ピンセットを使用してそれらを分離します。(H)ブロックは薄い切片化の準備ができています。樹脂ブロック(*)内のホールマウントオルガノイドまたはスフェロイドは、透過型電子顕微鏡用の切片作成の準備ができています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図5:免疫蛍光標識され、MDにまだある間に視覚化された気道オルガノイド。(A-C)上のパネルは、中央の内腔を持つ円形の気道オルガノイドを示しています。緑色はオルガノイドの最外輪にサイトケラチン5を発現する気道前駆細胞を表し、青色は核を表す。スケールバー = 50 μm。 (D-F) 下のパネルには、(D)DAPIフィルターと(E)Alexa 488フィルターの2つのサイドバイサイドオルガノイドの3次元画像と、(F)マージされた画像が表示されます。スケールバー = 100 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図6:細胞の生細胞膜上の標識密度の比較。 グラフは、凍結前後のスフェロイドを、従来のワークフローと現在採用されているワークフローを使用して比較します。解析は画像解析ソフトのImage Jを用いて行った。略語:IntDen = 積分密度(選択したスフェロイドの蛍光強度)。CTCF = 全細胞蛍光を補正。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Ranan Gulhan Aktasは、MD、S-IHC、S-IF、およびFSの特許出願を所有しています。オルグ・エニス・トックはこれらの製品の開発に携わっていました。Olgu Enis TokとGamze Demirelは、Celloramaという名前の会社のR&Dチームメンバーです。ユスフ・ムスタファ・サーチ、ゼイネップ・アクブルト、オズゲカン・カヤラルには、宣言すべき利益相反はありません。