本研究では、スフェロイドおよびオルガノイド全体を多目的デバイス内のヒドロゲルにそのまま残したまま、さまざまな顕微鏡で培養、凍結、解凍、処理、染色、標識、および検査するための方法論について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
細胞培養ラボで3次元成長構造であるオルガノイドとスフェロイドは、人体をよりよく模倣し、動物実験よりも優れているため、2次元培養モデルと比較して優れたモデルとしてますます認識されるようになっています。ただし、これらの研究は一般的に再現性と一貫性の問題に直面しています。異なる細胞培養容器間でのオルガノイドとスフェロイドの移動、ピペッティング、遠心分離など、長い実験プロセスでは、これらの影響を受けやすく壊れやすい3D成長構造が損傷または失われることがよくあります。最終的には、3D構造が同じ特性と品質を維持できないため、結果に大きな影響があります。ここで説明する方法は、これらのストレスの多いステップを最小限に抑え、オルガノイドとスフェロイドが多目的デバイスのヒドロゲル中に残っている間、処理シーケンス全体を通して安全で一貫した環境を保証します。研究者は、単一の多目的デバイスを使用して、共焦点顕微鏡から電子顕微鏡まで、さまざまなハイテク機器の下でオルガノイドまたはスフェロイドの構造を成長、凍結、解凍、処理、染色、ラベル付け、および検査することができます。この技術は、処理中に3D成長構造のための安定した保護環境を維持しながら、研究の再現性、信頼性、および妥当性を向上させます。さらに、ストレスの多いステップを排除することで、取り扱いエラーを最小限に抑え、所要時間を短縮し、汚染のリスクを低減します。
概要
細胞研究と治療の未来は、3D細胞培養にあります1,2,3。オルガノイドモデルとスフェロイドモデルは、人体の発達、生理学、および疾患を模倣するより良いモデルを作成することにより、in vitro実験と動物モデルの間のギャップを埋めます4,5,6,7,8,9。ただし、これらのモデルの再現性と再現性は依然として困難です。さらに、現在の技術でこれらの構造を取り扱い、収穫、移送、および遠心分離すると、多くの条件でオルガノイドとスフェロイドが失われたり損傷したりし、結果に大きな影響を与えます。
組織学的染色、免疫組織化学染色、免疫蛍光標識、および凍結保存のための多くのプロトコルにもかかわらず、実験条件の標準化、取り扱い、およびこれらの繊細....
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プロトコル
1. オルガノイドとスフェロイドの培養
- ヒドロゲルを氷の上に一晩(冷蔵庫または冷蔵室で)置き、解凍します。
- 市販の多目的装置(MD; 材料表参照)を実験の1日前のインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れて加温する。
- 滅菌済みのワイドエンドピペットチップを4°Cの冷蔵庫に入れます。
注意: 手順1.1〜1.3は0日目に実行され、手順1.4〜1.11は1日目に実行されます。 - ヒドロゲルを層流フード内の氷上に15分間置きます。
- オプション:メーカーの推奨に従って、ヒドロゲルを冷たい細胞培養培地で希釈します。
- HepG2細胞(市販の肝細胞癌細胞株; 材料の表を参照)のペレットを含むチューブを氷上に置きます。
- 予熱した装置のニッチ内に30〜35μLの100%ヒドロゲルをプレートして、ゲルドロップを作成します。
- 各ヒドロゲルドロップの上部の中央に10,000個のHepG2細胞を置き(図2)、37°Cで15分間インキュベートします。
- ヒドロゲルドロップを200 μLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と10%ウシ胎児血清で覆います。
- ....
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結果
本稿は、単一の独自に設計された環境でヒドロゲル中にオルガノイドまたはスフェロイド全体を培養、凍結、解凍、組織学的染色、免疫組織化学染色、免疫蛍光標識、コーティング、および処理するための多目的デバイス(MD)および補完的な方法論を表しています。現在の研究は、35 MDの35ヒドロゲルドロップでHepG2肝がんスフェロイドを調製するように設計されました。さらに、MDの肺オルガノイドは、オルガノイド研究の現在の方法論の結果を実証するために、例として免疫蛍光標識されました。
図1 は、ヒドロゲルドームを含む装置を詳しく見たものである。ニッチのサイズと形状は、オルガノイド/スフェロイドを含むヒドロゲルの保護環境を提供し、さまざまなプロセスで使用される試薬を節約するように設計されています。さらに、ニッチを囲む装置の側面部分は、免疫染色実験中の湿度チャンバーとして使用することができる。サンプルを供給する培地は、ヒドロゲルドロップの高さに応じて、100〜200μLの間で変化し得る。現在の研究では、多くのヒドロゲル、市販の細胞外マトリックス.......
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ディスカッション
MDは、ここで説明する製剤とプロトコルを補完し、より制御された環境でオルガノイドとスフェロイドの迅速かつ自発的な3D成長を促進し、同じ条件で実験を継続します。試験片はプロセス全体を通して同じ環境にとどまり、3D成長アーキテクチャのほぼ100%がコンテナ内にそのまま残ります。これにより、連続実験中の均質性が向上し、培養期間を延長することができます。さらに、オルガノイドおよびスフェロイド処理中のステップ数は、従来のワークフローと比較して大幅に削減され(図4)、処理時間と人為的ミスを最小限に抑え、汚染リスクを低減します。さらに、これにより、単一の環境で3D成長構造を保護しながら実験条件が安定しているため、信頼性と妥当性が向上します。ラボでの時間と労力を節約しながら、精度、信頼性、妥当性を向上させることができます。さらに、シーケンシャルプロセス全体で個々の3D成長構造を追跡できます。培養中のサイズと位置の変化、およびさまざまな化合物に対するそれらの応答の検査が装置で可能です。これは、人体および疾患の発症の再現のための優れたin vitro実験モデルを提供する。研究者は.......
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開示事項
Ranan Gulhan Aktasは、MD、S-IHC、S-IF、およびFSの特許出願を所有しています。オルグ・エニス・トックはこれらの製品の開発に携わっていました。Olgu Enis TokとGamze Demirelは、Celloramaという名前の会社のR&Dチームメンバーです。ユスフ・ムスタファ・サーチ、ゼイネップ・アクブルト、オズゲカン・カヤラルには、宣言すべき利益相反はありません。
謝辞
図の作成にはシカゴ大学のデール・メルテス氏、イスタンブール・メディポール大学健康科学技術研究所での技術支援にはメフメット・セリフ・アイディン博士、原稿の編集にはマルテペ大学のラナ・カゼミ博士に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 無水エタノール(EtOH) | メルク | 8187602500 | dH2Oで希釈して30%、50%、70%、80%、90%、96%の溶液を作り、RT |
| アセトン | 保存します メルク | 8222512500 | RT |
| アレクサ蛍光小麦胚芽凝集素とヘキストで保存します。ハンクの平衡塩溶液(HBSS)で | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, 保存温度は -20 °C;C |
| α-1-Fetoprotein (AFP) 濃縮および希釈済みポリクローナル抗体 | Biocare Medical | CP 028 A | +4 °C |
| 抗アルブミン抗体 | アブカム | EPR20195 | +4 °;C、希釈:1:50 |
| 抗ベータガラクトシダーゼ抗体、チキンポリクローナル | アブカム | 134435 | +4°で保存;C、希釈:1:25 |
| サイトケラチン5 | Abcam | 53121 | +4 >C、希釈:1:100 |
| アルギナーゼ-1濃縮および希釈済みウサギモノクローナル抗体 | バイオケア医療 | ACI 3058 A、B | +4°Cで保存します。C、希釈:1:50 |
| 塩化カルシウム(CaCl2) | Sigma | C1016-500G | カルノフスキーの固定剤に溶解して2 mM CaCl2;RT |
| セルカウンティングキット8(WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
| 遠心分離チューブ、15mL | ネスト | 601051 | |
| 遠心チューブ、50 mL | Nest | 602052 | |
| Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
| CO2 インキュベーター | パナソニック | KM-CC17RU2 | |
| 銅グリッド | 電子顕微鏡科学 | G100-Cu | グリッド上に置かれた超薄型切片; 100 ライン/インチ メッシュ |
| クリティカルポイントドライヤー | ライカ | EMCPD300 | 混合物中のSEMアプリケーション用の生体サンプルの乾燥 |
| 用 | シグマ アルドリッチ | AEC101 | +4 >C |
| ダイヤモンド ナイフ | ジアトーム | ウルトラ 45&�;, 40-US | 超薄切片に使用 |
| Biofroxx | 67-68-5 | ||
| 使い捨てプラスチック パスツールピペット | 巣 | ||
| DMEM - ダルベッコのモディファイド イーグル ミディア | Gibco | 41966-029 | +4 >C |
| エオシン Y 溶液アルコール | ブライト スライド | 2.BS01-105-1000 | |
| エポン樹脂 | シグマ | 45359-1EA-F | エポキシ埋め込みミディアムキット、+4°で保存; |
| Cウシ胎児血清と添加剤強化剤 | パン | バイオテクノロジーP30-3304 | +4 >C |
| 凍結液 (FS) | Cellorama | CellO-F | 4 °C;C |
| ガラスナイフメーカー | ライカ | EM KMR3 | 厚さ 8 mm のガラス ナイフ |
| ストリップ (サイズ 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) | ライカ | 7890-08 | TEM |
| グルタルアルデヒド水溶液、EM グレード、25% | Electron Microscopy Sciences | 16210 | dH2Oで希釈して2.5%の溶液を作り、+4°Cで保存します。C |
| グリセロール溶液 | Sigma Aldrich | 56-81-5 | -20 C、希釈 :1:100 |
| ヤギ抗ニワトリ IgY (H+L) 二次抗体、Alexa、647 | Invitrogen | A32933 | RT で保存 |
| ヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体、DyLight、488 | Invitrogen | 35502 | +4 >C, 希釈 :1:50 |
| ヤギ抗マウスIgG (H+L) 二次抗体, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | +4 >C, 希釈 :1:50 |
| ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 二次抗体, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | +4 >C, 希釈 :1:50 |
| ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 二次抗体, DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | +4 >C |
| ヘマトキシリン・ハリス | 明るいスライド | 2.BS01-104-1000 | |
| HepG2細胞 | ATCC | HB-8065 | 窒素タンクに保存 |
| ヒト/ラット OV-6 抗体 モノクローナルマウス IgG1 クローン # OV-6 | R&D Systems | MAB2020 | -20 °C |
| Hydrogel | Corning 354248 | Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEVフリー, 10 mL, -20 °C;C | |
| Hydrogel | Corning 354234 | Matrigel, 基底膜マトリックス, LDEVフリー, 10 mL, -20 °C;C | |
| Hydrogel | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| Hydrogel | Biotechne, R&D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME、-20°で保管。C |
| Karnovsky の固定液 | %2 PFA、%2.5 グルタルアルデヒド含有 0.15 M カコジル酸緩衝液、2 mM CaCl2; 新鮮に調製; TEM &SEMは | ||
| L-アスパラギン酸 | シグマ | 11189-100G | をRT |
| 鉛アスパラギン酸溶液 | します 40 mgのアスパラギン酸を10 mLのddH2< / sub>Oに溶解し、66mgの硝酸鉛を加えます。溶液は60°Cで安定します。CとpHを5に調整します。新鮮な | ||
| 硝酸鉛 | を準備します 電子顕微鏡科学 | 17900 | RTに保管 |
| ライカ共焦点顕微鏡 | ライカ | DMi8 | |
| LSM 700 レーザー走査型共焦点顕微鏡 | ツァイス | ||
| マイクロプレートリーダー | Biotek Synergy | ||
| 多目的デバイス(MD) | Cellorama | CellO-M | |
| Nuclear-DNA stain | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258、五水和物 (ビス-ベンズイミド) - 10 mg/mL 水溶液、+4 °Cで保存してください。C |
| Nuclear-DNA stain | ThermoFischer Scientific | 62248 | DAPI溶液、+4°Cで保存。C |
| 四酸化オスミウム (OsO4) ,4% | Electron Microscopy Sciences | 19190 | dH2O で希釈して 2% 溶液を調製; +4 °C で保存;Cおよび気密容器に入っています。光を保護する |
| Ov6 抗体 | R&D | MAB2020 | +4°で保存します。C |
| パラホルムアルデヒド(PFA)溶液、4% | シグマ | 1.04005.1000 | 4% PFA を dH2O に溶解し、沸騰させ、冷やして分注します。-20 °C で保存します。 |
| Cパラホルムアルデヒド溶液4%PBS、1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | +4 >C |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、錠剤 | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
| 固定後溶液 | %2 OsO4、%2.5 フェロシアン化カリウム dH2O に溶かし; 新鮮な | ||
| フェロシアン化カリウム水溶液を調製します、5% | 電子顕微鏡科学 | 26603-01 | RT |
| Priprimovertに保管 - 倒立明視野顕微鏡 - ZEISS | Zeiss | 商品番号:491206-0001-000 | |
| 丸底微量遠心チューブ、2mL | ネスト | 620611 | |
| 走査型電子顕微鏡、STEMアタッチメント付き | Zeiss | GeminiSEM 500 | 走査型電子顕微鏡写真には2-3 kVのInlens Secondary Electron (SE) 検出器を、透過型電子顕微鏡写真には30 kVのaSTEM検出器を使用しています。 |
| SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack | ScyTek Laboratories | SHP125 | +4 >C |
| カコジル酸ナトリウム緩衝液、0.4 M、pH 7.2 | 電子顕微鏡科学 | 11655 | dH2Oで希釈して0.2 Mにし、+4°Cで保存します。C |
| ナトリウム/カリウム ATPase α 1 抗体 [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | -20 °C で保存します。 |
| 免疫蛍光標識用C溶液(S-IF) | Cellorama | CellO-IF | +4°Cで保存します。 |
| 免疫組織化学用C溶液(S-IHC) | セロラマ | CellO-P | は+4°Cで保存します。C |
| 試料トリミング装置 | ライカ | EM TRIM2 | エポンサンプルブロックをウルトラミクロトームに調製 |
| スパッタコーター | ライカ | EM ACE200 | サンプルを6nmの金/パラジウムで90秒間コーティング |
| チオカルボヒドラジド(TCH) | シグマ | 223220-5G | dH2Oで希釈して0.5%溶液を作り、0.22 µでろ過します。Mメンブレンフィルター;RTに保管します。新鮮な |
| トリパンブルー溶液、0.4% | Gibco | 15250061 | |
| ウルトラゲルスーパーグルー | Pattex | PSG2C | ホルダーエポンブロックへのサンプル付き接着剤重合エポンブロック用 |
| ウルトラミクロトーム | ライカ | EM UC7 | 透過型電子顕微鏡(TEM)用の高品質の超または半薄切片を準備するためユニバーサル |
| ピペットチップ、10 & マイクロ;L | Nest | 171215-1101 | |
| ユニバーサルピペットチップ、1000µL | Isolab | L-002 | |
| ユニバーサルピペットチップ、200 µL | 巣 | 110919HA01 | |
| 酸ウラニル | 電子顕微鏡科学 | 22400 | dH2Oで希釈して2%の溶液を作り、0.22 µでろ過します。Mメンブレンフィルター;RTでしっかりと閉じたコンテナストアを保管してください |
参考文献
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Nath, S., Devi, G. R.
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