本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。
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この記事について
サマリー
要約
腫瘍生物学の理解は目覚ましい進歩を遂げているにもかかわらず、臨床試験に入る腫瘍薬候補の大多数は、多くの場合、臨床効果の欠如が原因で失敗します。この高い失敗率は、主に腫瘍の不均一性と腫瘍の微小環境を反映する上での不十分なために、現在の前臨床モデルが臨床効果を予測できないことを明らかにしています。これらの制限は、個々の患者に由来するヒト腫瘍サンプルから確立された3次元(3D)培養モデル(スフェロイド)で対処できます。これらの3D培養は、腫瘍の不均一性を反映しない確立された細胞株よりも現実世界の生物学をよりよく表しています。さらに、3D培養は、低酸素、壊死、細胞接着などの腫瘍環境の要素を複製し、自然な細胞の形状と成長を維持するため、2次元(2D)培養モデル(単層構造)よりも優れています。本研究では、多細胞スフェロイドで増殖する個々の患者からの癌細胞の初代培養を調製する方法を開発しました。細胞は、患者腫瘍または患者由来の異種移植片から直接誘導することができる。この方法は、固形腫瘍(結腸、乳房、肺など)に広く適用可能であり、特殊な機器に頼らずに典型的な癌研究/細胞生物学ラボで完全に実行できるため、費用対効果も高くなります。ここでは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデル(多細胞スフェロイド)を生成し、細胞生存率アッセイ(MTT)と顕微鏡検査の2つの補完的なアプローチを使用して薬物に対する感受性を評価するためのプロトコルを提示します。これらの多細胞スフェロイドは、潜在的な薬剤候補の評価、潜在的なバイオマーカーまたは治療標的の特定、および応答と耐性のメカニズムの調査に使用できます。
概要
インビトロおよびインビボ研究は、がん治療法を開発するための補完的なアプローチを表しています。in vitroモデルは、ほとんどの実験変数の制御を可能にし、定量分析を容易にします。多くの場合、低コストのスクリーニングプラットフォームとして機能し、機構研究にも使用できます1。ただし、そのようなモデルは腫瘍微小環境を部分的にしか反映していないため、それらの生物学的関連性は本質的に制限されています1。対照的に、患者由来の異種移植片(PDX)などのin vivoモデルは、腫瘍微小環境の複雑さを捉えており、トランスレーショナルスタディや患者の個別化治療(つまり、個々の患者に由来するモデルで薬物に対する反応を調査する)に適しています1。しかし、in vivoモデルは、実験パラメータをin vitroモデルほど厳密に制御できず、その開発に時間がかかり、労働集約的で、コストがかかるため、薬物スクリーニングのためのハイスループットアプローチを助長しません1,2。
in vitroモデルは100年以上前から利用可能で....
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プロトコル
初代腫瘍細胞培養に使用されたヒト腫瘍サンプルの収集は、患者からの書面によるインフォームドコンセントを得て、ラビン医療センターで治験審査委員会(IRB)が承認したプロトコルに従って実施されました。研究への参加対象となる患者には、非転移性乳がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん、神経内分泌がん、卵巣がん、膵臓がん、小児がん、または転移がんの男性および女性の成人および小児がん患者が含まれていました。唯一の除外基準は、インフォームドコンセントを提供する能力の欠如であった。
1. スフェロイドの生成と収集
注:原発腫瘍細胞の単離は、Kodakら8に記載されているように実行できます。重要なことに、スフェロイドを生成するために使用される原発性腫瘍細胞は、Moskovitsらによって記載されるように、生検、切除などによって得られた患者サンプルから直接、または患者由来の異種移植片(PDX)モデルからの腫瘍サンプルを使用して間接的に誘導され得る。
- 単一細胞付着初代細胞培養物を入れた小型フラスコ(T25)を採取し、細胞培養培地を除去し、PBSで洗浄した後、1 mLの1x Accutase(細胞剥離溶液)( 材料の表を参照)を37°Cで3分間添加することにより、75%〜....
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結果
このプロトコルは、原発腫瘍細胞からスフェロイドの均質な培養を生成し、スフェロイド培養に対する薬効を定量的に評価し(MTTアッセイ)、およびスフェロイド形態に対する治験薬の効果を決定するための手順を提示します。結腸および乳癌細胞培養から生成されたスフェロイドにおける代表的な実験からのデータが提示される。同様の実験を、胆管癌、胃癌、肺癌、および膵臓癌を含む他の腫瘍タイプを用いて実施した(データは示さず)。本明細書に提示する全ての実験は、三連で行われた。
図2 は、初代大腸癌細胞培養物から作製したスフェロイドを示す。 図2に見られるように、生成されるスフェロイドの数は、各ウェルに最初に播種された細胞の数に依存する。スフェロイドの直径100μm以上への成長には10〜14日かかりました。腫瘍細胞の起源(例えば、異なる患者および異なる起源)が増殖速度を決定した。ウェルにより多くの細胞を播種しても、スフェロイドの生成に必要な時間は短縮されず、形成されるスフェロイドの数が増加しま.......
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ディスカッション
本プロトコルは、ヒト腫瘍サンプルに由来する3D初代細胞培養物(スフェロイド)を生成するための簡単な方法を記載する。これらのスフェロイドは、潜在的な薬剤候補や薬剤の組み合わせの評価、潜在的なバイオマーカーや治療標的の特定、応答と耐性のメカニズムの調査など、さまざまな分析に使用できます。このプロトコルでは、患者サンプルから直接得られた初代腫瘍細胞、またはPDXモデル由来の腫瘍細胞のいずれかを使用し、患者サンプルを使用して確立することができます。後者のアプローチは、同じ原発腫瘍を用いて インビトロ および インビボ 実験を行うことを可能にする。PDXモデルとこれらのモデル9に由来する3D培養との間の薬物感受性実験の結果では一貫性が以前に示されており、したがって、このin vitro/in vivo アプローチの関連性を裏付けています。
現在のプロトコルの主な利点には、ほとんどの固形腫瘍への幅広い適用性と、癌研究/細胞生物学ラボの典型的な機能/機器との互換性に起因する費用.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5 フルオロウラシル | TEVA イスラエル | ロット 16c22NA | フルオロウラシル、Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase 細胞解離 |
| シスプラチン | TEVA イスラエル | 20B06LA | アビプラチン、 |
| カルトレックス | Trevigen | 3632-010-02 | 基底膜マトリックス、3型 |
| DMSO (ジメチルスルホキシド) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 2391595 | |
| フラロメーター ELISAリーダーBiotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 | |
| 塩酸(HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | バージョン1.52a | オープンソースソフトウェアImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド |
| 非必須アミノ酸 | ギブコ | 11140050 | |
| パルボチクリブ | Med Chem Express | CAS #571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)*カルシウムとマグネシウム |
| ペニシリンなし–ストレプトマイシン | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| ピッペッティングリザーバー | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 培地 | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| トラスツズマブ | F. ホフマン - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan Blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| 超低アタッチメント 96 ウェルプレート | Greiner Bio-one | 650970 | |
| ビノレルビン | Ebewe | 11733027-03 | へそ |
参考文献
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
- Yoshida, G. J.
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