二次性リンパ浮腫誘発のためのウサギ後肢における膝窩血管リンパ節切除術

サマリー

ここでは、ウサギ後肢における安定後天性リンパ浮腫の外科的誘導について説明する。この実験動物は、顕微手術技術によるリンパ浮腫治療の効果をさらに調査するために使用することができます。

要約

リンパ浮腫は、がんとその治療に関連することが多い一般的な疾患であり、リンパ系の損傷につながり、現在の治療法は治癒的ではなく緩和的であることがほとんどです。腫瘍患者におけるその高い発生率は、正常なリンパ機能と病理学的機能障害の両方を研究する必要があることを示しています。慢性リンパ浮腫を再現するためには、適切な実験動物を選ぶ必要があります。動物モデルを確立する試みは、リンパ系の再生能力によって制限されます。候補の中で、ウサギの後肢は扱いやすく、ヒトの臨床シナリオに外挿しやすいため、有利です。さらに、この種のサイズは、血管新生リンパ節切除のためのリンパ管のより良い選択を可能にする。

本研究では、二次性リンパ浮腫を誘発するためのウサギ後肢の血管リンパ節切除術の手順を提示する。麻酔をかけた動物に、円周測定、パテントブルーV浸潤、およびリアルタイムの近赤外蛍光法(膝窩結節とリンパ管の同定を可能にする技術)を用いたインドシアニングリーンリンパグラフィー(ICG-L)を行った。同定された構造へのアクセスは、膝窩結節を切除し、内側および外側の求心性リンパ管を結紮することによって達成されます。膝窩リンパ節に入らずに大腿部内の大腿リンパ系に結合するリンパ管を特定し、結紮できるように、特別な注意を払う必要があります。

術後評価は、導入後 3、6、および 12 か月に、後肢と ICG-L の円周方向の測定値を使用して実施されました。追跡調査で明らかになったように、本実験動物は12^ヶ月目 まで維持された経皮逆流を発症し、リンパ浮腫の管理における新たな長期評価に有用であることを確認しました。結論として、ここで説明するアプローチは実現可能で再現性があります。さらに、提示された時間枠では、ヒトのリンパ浮腫を代表する可能性があるため、有用な研究ツールを提供します。

概要

リンパ浮腫は、その世界的な発生率、治癒的で標準化された治療法の欠如、および患者の生活の質への深刻な影響のために、特別な注意に値する慢性疾患です^1,2。

先進国では、リンパ浮腫は主に後天性であり、この悪性腫瘍の有病率が高いため、乳がんに続発します。手術後10年での乳がん関連リンパ浮腫の累積発生率は、最大41.1%に達する可能性があります³。しかし、黒色腫、婦人科がん、泌尿生殖器腫瘍、頭頸部腫瘍などの疾患も、この疾患の高い発生率と関連しています⁴。局所リンパ節切除術は、生存率を高めるために必要な腫瘍学的治療の一環として、機能的なリンパドレナージの破壊につながります。場合によっては、これにより、リンパ浮腫⁵の発症を予防または遅延させる代償メカニズムがもたらされます。しかし、化学療法や放射線療法を行うと、これらのメカニズムでは変化を補うことができず、リンパ浮腫が生じます。これは患者の生活の質に悪影響を及ぼし、機能的、社会的、心理的な健康に影響を及ぼします^6,7。

リンパ浮腫の効果的な治療法の必要性は、リンパ系の生理病理学の理解、ならびに正常な^{リンパ系と}機能不全のリンパ系の両方における複雑な細胞メカニズムおよびそれらの応答についての深い洞察を必要とする^8,9,10。このような洞察は、まず、ヒトの慢性疾患を再現できる実験動物モデルから得ることができる¹¹。

実験動物モデルでリンパ浮腫を再現する多くの試みがなされてきました。しかし、それらのほとんどは、安定した動物モデルで慢性リンパ機能不全を再現できないこと、研究の費用、そして最も重要なことに、リンパ系の優れた再生能力など、いくつかの制限によって妨げられてきました^12,13。

この研究は、ウサギの後肢を使用して安定した後天性リンパ浮腫を外科的に誘発するための実験的アプローチを示しています。文献レビューに基づくと、この動物は、後肢を排出し、脚の主要な大腿リンパ系に到達する単一の膝窩結節を含む後肢リンパ系の一貫した解剖学的構造のために、リンパ浮腫の発症に最適と見なすことができます^14,15。

ウサギの後肢の特定の解剖学的構造により、二次性リンパ浮腫を誘発するためにヒトで行われた外科的処置の再現が可能になります。したがって、この手順は、結果を人間の医学に外挿するための顕微手術のトレーニングや前臨床研究に使用できます。

プロトコル

すべての手順は、ヘスス・ウソン低侵襲手術センターの倫理委員会と、ヨーロッパの法律に基づく地域政府の福祉ガイドラインによって承認されました。

1.術前および外科的準備

1. 体重4〜4.5 kg、生後4か月の9匹の雌のニュージーランドの白ウサギを、22〜25°Cの温度に保たれた別々のケージに収容し、餌と水に無料でアクセスできます。ケージに、表面積3 m² 、高さ40 cmのポリスルホントレイと、木の削りくずが入ったベッドが含まれていることを確認してください。
   1. プロジェクトコードと動物識別番号でケージを特定します。
   2. ストレスによる問題を防ぐために、手術の1週間前に動物を順応させます。麻酔前に各動物が健康であることを確認するために、血液サンプルの術前検査値を収集します。
2. すべてのウサギが各外科的処置の前に12時間の絶食に従うことを確認してください。
   1. 前投薬後、フェイスマスク(ホールマスク)を使用して、100%酸素と3〜5 L / minの新鮮なガス流で5分間ウサギに酸素を前処理します。ミダゾラム(0.3 mg / kg)とプロポフォール(10 mg / kg)との共導入期を静脈内投与します。.
3. 3.0-3.5 気管内チューブでウサギを挿管し、ニューモタポネーションを行い、最初の 5 分間は 1 L/min の新鮮なガスの流れで人工呼吸器に接続された半閉円形回路に接続し、その後 0.5 L/min に設定します。
   1. 気化器に設定された3%〜3.5%の濃度でセボフルランを吸入することにより、維持麻酔を行います。
4. 外科的処置全体を通して、耳の辺縁静脈を通じて麻酔をかけられたウサギにリンゲル乳酸溶液(2-4 mL / kg / h)の連続注入を投与します。.
   1. 眼の表面を保護するために、保護用の眼軟膏を使用してください。
5. 全身麻酔モニタリング:直腸体温計を使用して38.7〜39.7°Cの温度を監視し、粘膜の色を検査し、ウサギパルスオキシメータを使用して>95%のO₂飽和度と180〜240bpmの心拍数を監視します。
6. 動物が手順全体を通して一定の温度を維持するように、サーマルサポートを配置します。
7. 術中鎮痛のためにケトロラック(1.5 mg / kg)とトラマドール(3 mg / kg)を静脈内投与します。.
8. 手術前と手術後5日間に抗生物質(7.5 mg/(kg・day)エンロフロキサシンを皮下投与し、術後鎮痛剤(10 μg/(kg・day)ブプレノルフィンS.c.)を5日間投与します。
9. ウサギを仰臥位に置き、動物の後肢と鼠径部を剃ります。動物を背側/仰臥位に置き、後肢と鼠径部から毛を切り取ります。
10. 以前に剃った皮膚に0.5%クロルヘキシジンと70%エタノールを塗布することにより、皮膚消毒を行います。その領域が消毒されたら、左後肢を除いて、ウサギを滅菌布で覆います。

2. 膝窩血管リンパ節切除術(図1)

1. 0.2〜0.3mLのインドシアニングリーン(ICG)を左後肢の第2および第3指間腔に皮内浸潤します。後肢をマッサージし、優しく曲げ、数分間伸ばして、リンパ管への色素の取り込みを促進します。対側肢をコントロールとして使用します。
2. リアルタイムの近赤外蛍光カメラを使用して、膝の高さで交差するリンパ管と皮膚の膝窩リンパ節(PLN)を視覚化し、(手術マーカーを使用して)マーキングします(図2)。
3. パテントブルーV(0.2mL)を指間領域に注入し、その後のリンパ管およびリンパ節の同定のために。
4. リアルタイムの近赤外蛍光カメラを使用してPLNを特定したら(図3)、膝窩の中心に2cmの切開を作成し、後肢の長軸から坐骨静脈を通って縦方向に、皮膚を通して見えるようにします。
   1. リアルタイムの近赤外蛍光カメラでリンパ系のパノラマ画像をリアルタイムで取得するには、励起光源としてクラス1レーザーを搭載した光学ヘッドと、動物の足首から後肢の膝までの近赤外線感度カメラを使用します。
   2. 皮下脂肪を切除することにより、筋筋膜の上のリンパ管を視覚化^します5。ステップ2.3のパテントブルーV染色により、リンパ管が青色に見えます。
   3. 顕微手術用鉗子を使用して切開部を伸ばし、血管および求心性リンパ椎弓根を含むPLNを露出させます。すべてのリンパ管および血管構造が鮮明に見えるようにします(図4)。
   4. 坐骨静脈の下、大腿二頭筋と内側ハムストリング筋の間にある直径0.8mmのPLNを特定します。
5. PLNの内側面にある2つの主要なリンパ管を特定します。これらの血管は遠位伏在静脈と平行に位置し、PLNに近づくと微小血管のネットワークに分かれます(図5)。
6. リンパ節の椎弓根を解剖し、周囲の組織や血管への損傷を避けます(図6)。
7. 内側動脈 (膝窩動脈の枝) と外側伏在静脈を遠位および近位に 10/0 ナイロン非吸収性縫合糸を使用して結紮します。
8. 大腿部内の大腿リンパ系に直接結合するが、PLNには入らない求心性リンパ管の2つのグループを特定して焼灼します(図7)。
   注:最初のグループは、上肢とふくらはぎからリンパ液を排出する内側求心性リンパ管に対応します。2番目のグループは、下肢の筋肉組織のリンパ管で構成されています。これらの血管は、伏在静脈とともに腓腹筋に沿って走っています。
9. リアルタイムの近赤外蛍光イメージングを繰り返すことにより、リンパ系の完全な破壊を確認します。
10. リンパ管新生の可能性を避けるために、周囲の脂肪組織を完全に除去します。.
11. 術後の自己切断を避けるために、4-0ポリグリコール酸(PGA)吸収性編組縫合糸(16mm3/8三角針付き)で皮膚切開を縫合します。
12. 手術後、ウサギを個別にケージに収容します。監視下、16〜22°Cの室温に保管してください。

3. 術後評価

1. 導入後 3、6、および 12 か月で術後評価を実施します。
2. 以前に使用した手順(手順1.2-1.7)に従ってウサギに麻酔をかけます。
3. 巻尺で麻酔をかけたウサギの後肢の周囲を測定します。2 cmごとに測定を行い、最初のポイントは足首、最後のポイントは膝にあります。円錐台頭の式を使用して総体積を計算します。
4. リンパ機能の評価には、インドシアニングリーンリンパグラフィー(ICG-L)を使用します。
   1. 0.2〜0.3mLのICGを2番目と3番目の指間スペースに皮内に浸潤し、1分間優しくマッサージしてICGのリンパ管への取り込みを促進します。
5. 15分後に近赤外蛍光システムを使用して画像を収集し、真皮の逆流を評価します。
6. フォローアップが完了したら、介入で使用されたものと同じ麻酔プロトコルに従ってウサギを安楽死させます。目的の麻酔面が達成されたら、平均 2 meq/kg の速度で耳介静脈に塩化カリウムを静脈内投与します。

結果

この研究では、9匹のウサギがリンパ浮腫導入を受けましたが、3匹のウサギが術後すぐに死亡し、評価できませんでした。研究データは、術後 3 か月、6 か月、および 12 か月で 3 人の独立した研究者によって取得されました。全身麻酔下で円周後肢測定とICG-Lを行い、リンパ系の機能と真皮の逆流を評価しました。

術後 3 か月で ICG-L によって得られたデータは、ウサギの左後肢に経皮逆流と PLN の欠如を示し、正常なリンパ系機能の破壊と互換性があることを示しました。術後6か月および12か月のICG-Lの結果では、外科的探索中に膝窩の遠位に皮膚逆流とリンパ管の拡張が示されました(図8)。

臨床リンパ浮腫の証拠は、検査または周囲後肢の測定では見つかりませんでした。左後肢の容積の増加は、右後肢(対照)の容積の増加と比較して有意ではありませんでした(p < 0.05)(図9)。左後肢から得られ...

ディスカッション

実験動物におけるPLNの切除は、評価と研究のために四肢に二次性リンパ浮腫を誘発できる比較的新しい手順です。リンパ節切除後、リンパ系の機能の変化、リンパの蓄積、および拡張したように見えるリンパ管の組織学的変化の期間があります。このリンパの蓄積が適切なレベルに達すると、ICG-Lなどの客観的な手法を用いて、ヒトで観察されるのと同様のリンパ浮腫の特徴的な真皮逆流を観察することができます。この技術の開発は、費用対効果の高い前臨床研究動物を作成する可能性があり、これはこの病態生理学的プロセスの予防と治療に役立つ可能性があります。

術中では、パテントブルーVアプリケーションは、後肢⁵のリンパ管を通る流れの有無を識別できる。この手法の欠点は、リンパ管を術中にしか観察できないことです。そのため、リアルタイムの近赤外線蛍光カメラ技術が使用されており、これは外科医が手術を必要とせずに適用部位のリンパチャネル内のリンパの流れを識別、マッピング、および定量化できる優れた方法です。今日、この技...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Bleu Patente V sodique (Guerbet)	ゲルベット。フランス、ヴィルパント	2.5 g/100 mL
	ヴェルス、オーストリア	0820645AA	3 mg / 10 mL
Fluobeam	Fluoptics。グルノーブル、フランス		蛍光イメージング
IBM SPSS ソフトウェア	IBM	バージョン 21.0
インドシアニン グリーン (Verdye, Diagnostic Green GmbH)	Diagnostic Green GmbH. アシュハイム・ドルナッハ、ドイツ		5 mg/mL
ケトロラコ (ノーモン)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T01H	30 mg/mL
Microsoft Excel	Microsoft	version 16.66.1
Midazolam (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T35M	15 mg/3 mL
Pentero 800 顕微鏡、蛍光モジュール	Carl Zeiss Meditec AG.ゲシュビッツァー通り51-52。イェーナ、ドイツ	302581-9245-000
塩化カリウム(ブラウン)	B.ブラウン。スペイン・バルセロナ	19262010	20 mmol/10 mL
プロポフォール(Propomitor, Orion Pharma)	オリオンファーマ。スプー、フィンランド	20R039B	200 mg/20 mL
RÜSCH気管内チューブ、	テレフレックスメディカル、IDAビジネス&テクノロジーパーク。アティオーネ、アイルランド。	12CE 12	サイズチューブ4.0 I.D. mm
セボフルラノ(SevoFlo、Zoetis)	Zoetisベルギー。Luvain-la-Neuve, Belgium	6093559	1000 mg/g (250 mL)
Tramadol (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T08U	100 mg/2 mL