方法論記事

統計的手法を用いた 大腸菌 Rosetta pLysS細胞における組換えキチン脱アセチル化酵素発現のプロセス評価と動態

DOI：

10.3791/64590

⸱

2023年3月10日

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

この記事について

サマリー

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現在のプロトコルでは、統計的手法であるセントラルコンポジットデザイン(CCD)を適用して、大腸菌ロゼッタpLysS細胞における組換え細菌キチン脱アセチル化酵素(BaCDA)の発現のプロセス条件を最適化しました。CCDの採用により、BaCDAの発現と活性が~2.39倍増加しました。

要約

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近年、酵素キチン脱アセチル化酵素を用いたキチンからキトサンへの脱アセチル化のより環境に優しいルートが重要性を増しています。エミュレート特性を持つ酵素変換キトサンは、特に生物医学分野で幅広い用途があります。さまざまな環境源からのいくつかの組換えキチン脱アセチル化酵素が報告されていますが、これらの組換えキチン脱アセチル化酵素の製造のためのプロセス最適化に関する研究はありません。本研究では、応答曲面法の中心複合設計を使用して、大腸菌ロゼッタpLysSにおける組換え細菌キチン脱アセチル化酵素(BaCDA)産生を最大化しました。最適化されたプロセス条件は、0.061%グルコース濃度、1%ラクトース濃度、22°Cのインキュベーション温度、128rpmでの攪拌速度、および30時間の発酵でした。最適化された条件で、乳糖誘導による発現は、発酵の16時間後に開始されました。最大発現量、バイオマス、および BaCDA 活性は、導入後 14 時間で記録されました。最適化条件では、発現したBaCDAのBaCDA活性は~2.39倍に増加しました。プロセスの最適化により、導入後、総発酵サイクルが22時間短縮され、発現時間が10時間短縮されました。これは、中央複合材料設計とその速度論的プロファイリングを使用して、組換えキチン脱アセチル化酵素発現のプロセス最適化を報告した最初の研究です。これらの最適な成長条件を適応させることで、あまり調査されていないモネラン脱アセチル化酵素の費用対効果の高い大規模な生産が可能になり、生物医学グレードのキトサン生産のためのより環境に優しいルートに着手する可能性があります。

概要

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構造βである1-4グリコシド結合天然ポリマーであるキチンは、セルロースに次いで自然界で2番目に豊富な多糖類です。この事実にもかかわらず、キチンは不溶性1のため、工業用途は限られています。このボトルネックは、キチンをN-脱アセチル化にさらすことで対処され、これにより正電荷が付与され、得られるポリマーであるキトサン1の溶解度が向上します。キチンは、化学的および酵素的という2つの異なるルートでキトサンに修飾することができます。キトサンの生物医学的応用には、制御され定義された脱アセチル化が必要であり、これは化学ルート2,3で制限されています。この制限は、脱アセチル化プロセス4,5のグリーン酵素的アプローチであるキチン脱アセチル化酵素(CDA)を使用して対処できます。

キチンデアセチル化酵素は、炭水化物活性酵素(CAZY)データベースで定義されている炭水化物エステラーゼ4(CE-4)ファミリーに属します。CE-4ファミリーの酵素は、保存領域としてNodBホモロジーまたは多糖類脱アセチル化酵素ドメインを共有しています。統計ツールであるCentral Composite Design(CCD)は、いくつかの野生型キチン修飾酵素6,7,8,9の最適化に使用される。しかし、野生型生物の使用における下流のステップは面倒になり、したがって、組換え酵素10,11,12,13,14,15,16,17への移行が進む。近年、海洋源からの好塩性組換えCDAは、生物医学グレードのキトサン18,19の工業的応用および製造が容易であるため、重要性を増しています。

大腸菌における組換え酵素産生は、そのプロセスに限界があり、大腸菌での発現は使用する遺伝子およびプラスミドによって異なるため、培地の最適化が必要である20。したがって、適切なプロセスと栄養素パラメータのスクリーニングが重要になります。一般的に採用されている最適化手法であるOne Factor at a Time(OFAT)は、段階的な実験を行うために膨大なリソースと時間を必要とします。この方法は、パラメータ20、21、22、23間の相互作用に関する統計情報の欠如に悩まされています。そこで、大腸菌Rosetta pLysSにおける好塩性細菌キチン脱アセチル化酵素(BaCDA)の発現収量とBaCDA活性の研究に、応答表面法(RSM)のCCDを採用しました。 大腸菌宿主における発現最適化のために考慮されたパラメータは、乳糖濃度、グルコース濃度、インキュベーション温度、攪拌速度、およびインキュベーション時間でした。ほとんどの大腸菌発現研究では、イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を含むLuria Bertani(LB)培地を誘導剤として使用しました。このIPTGの追加には、定期的な成長モニタリングが必要でした24。発酵プロセス中に繰り返されるこれらの媒介も、汚染の道を開きます。そのため、研究グループは、ラクトースを誘導剤とする素晴らしいブロス(TB)に移行しました。IPTGの代わりに乳糖をメディアに含めることで、この懸念に対処します。大腸菌はこの乳糖を消費し、副産物として同種乳糖を生成し、自動誘導状態を引き起こします。この自己誘導培地には、組換えタンパク質の収量が改善されたグリセロールが含まれています25。 結核培地における組換えタンパク質のこの過剰発現は、プロセスパラメータを最適化することによりさらに改善されました。本研究では、大腸菌ロゼッタpLysS細胞における好塩性BaCDAの異種発現を最適化するために、中心的な複合設計を適用しました。選択されたプロセスパラメータは、インキュベーション温度、攪拌速度、およびインキュベーション時間であり、評価された栄養パラメータはグルコースとラクトースの濃度でした。好塩性BaCDA発現は、予測された最適化条件で評価され、SDS-PAGEを使用して交差検証されました。

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プロトコル

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1. 発現培地と培養条件

  1. BaCDA遺伝子を含むpET−22bベクターを、15に記載の熱ショック法を用いて大腸菌Rosetta pLysSコンピテントセルに形質転換する。
    注:微生物を扱う際には注意が必要です。すべての微生物学的作業は、汚染を避けるためにバイオセーフティキャビネットフード内で行う必要があります。
  2. 0.05%(w/v)グルコースと0.2%(w/v)ラクトースを含む結核培地で、16°C、180rpmで予備発現試験を実施します。BaCDAクローニングプラスミドを含む培地100 mLで6.792 x 10 7E. coli Rosetta pLysS細胞を固定相に達するまで増殖します。上記の増殖条件では、大腸菌ロゼッタpLysS細胞は、10.85±0.21の光学密度600(OD600)に達する。 
    注:TBメディアの組成(%w / v):トリプトン、1.2;酵母抽出物、2.4;グリセロール、0.6;1x TB塩(17 mM KH2PO4 および74 mM K2HPO4)17。

2. 最適化と実験計画

  1. 統計ツールソフトウェアを使用して、実験を計画し、中心複合計画で2次多項式モデルを適合します。本研究で使用した統計ソフトウェアは、MINITAB 17.0(試用版)でした。
    1. これを行うには、ソフトウェアを開き、次のボタンをクリックします: Stat > DoE>Response surface>Create response surface」>「Response design」> Central composite。出力はダイアログボックスとして表示されます。
  2. インキュベーション温度、攪拌速度、インキュベーション時間、グルコース濃度、ラクトース濃度の5つのパラメータを、ダイアログボックスの5つのレベル(-2、-1、0、+1、+2)で入力します。
    1. これを行うには、ダイアログボックスにレベルを含むパラメータを入力し、すべてのパラメータの詳細を入力して、[ OK]を押します。これにより、中心点に6回の反復を持つ実験計画行列が生成され、32回の実験実行が必要になります。ソフトウェアは、CCDを使用したプロセス最適化で使用される、コード化された用語とコード化されていない用語でパラメータとそのレベルを含むテーブルを生成します(表1)。
  3. ソフトウェアで生成された条件で 32 回の実験を実行します。実験結果を、コード化されたユニットとコード化されていないユニットのレベルとパラメーターを含む実験計画マトリックス(ソフトウェアによって生成)にフィードします(表2)。
  4. ソフトウェアを使用して実験計画マトリックス(表2)を解析します。これを行うには、ソフトウェアを開き、応答をデータシートに入力します。 「統計>DoE」>「応答曲面」>「応答曲面計画の分析」>「OK」>「応答列」を選択します。出力は統計的有意性について分析され、モデルはソフトウェアによって予測されます。

表1:大腸菌RosettapLysS細胞における組換えキチン脱アセチル化酵素の発現を推定するための実験デザインで使用されるコード化された用語およびコードされていない用語のパラメータとそのレベル。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:大腸菌Rosetta pLysS細胞における組換えキチン脱アセチル化酵素の実験的および予測されたBaCDA活性(発現)を含む実験デザインマトリックス。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

3. モデルの検証

  1. ソフトウェアで利用可能な応答オプティマイザーツールを使用して、設計されたモデルを検証します。
  2. ソフトウェアが予測した最適条件で発酵を繰り返し、実験値とソフトウェアが予測した値を比較します。
    1. これを行うには、ソフトウェアを開き、[ 応答列] > [統計] > [DoE] > [応答サーフェス] > [応答オプティマイザー] > [> の最大化] を選択します。出力は、ソフトウェアによって予測された最適なプロセス条件と値です。予測された最適条件で発酵を繰り返し、値を比較します。

4. 分析方法

  1. 発現、バイオマス、タンパク質の定量
    1. 実験計画マトリックス(表2)のソフトウェアによって与えられた32の条件で発酵を実行します。各分析後に、培養物を5,405 x g で4°Cで10分間遠心分離することにより、ペレットを取得します。 セルペレットを秤量して、バイオマス収量を決定します。
      注:すべての微生物の取り扱いは、無菌条件(つまり、バイオセーフティキャビネット内)で行う必要があります。
    2. 細胞ペレットを溶解して、超音波処理によりペリプラズムタンパク質を得る。細胞ペレットの各グラムに5mLの溶解バッファー(50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10 mMイミダゾール)を添加し、60%の振幅で10 sオンと10 sオフのパルスで10サイクル超音波処理して破壊します。ライセートを5,405 x g で4°Cで10分間遠心分離して回収します。 Bradfordのアッセイ26によりタンパク質濃度を定量します。
      注:タンパク質の変性を避けるために、超音波処理は低温条件下で行う必要があります。超音波処理を行いながらサンプルを氷の上に置きます。
    3. BaCDA発現をSDS-PAGEとImageJソフトウェアを使用して解析します。10 μLの可溶性細胞溶解物(ペリプラズムタンパク質)を12%ビスアクリルアミドゲルにロードし、1x tris-glycine-SDS(TGS)バッファー100 Vで2時間泳動します。ランが完了したら、ゲルをクーマシーブルーで染色し、デステインして背景27を除去する。
    4. ゲルドキュメンテーションユニットを使用して画像をキャプチャします。ImageJ ソフトウェアを使用してピクセル値の形式でバンド強度を比較することにより、BaCDA 式を決定します。参照ピクセル28として、BaCDA活性およびバイオマスが最も低い実験実行を考えてみる。
      1. これを行うには、ソフトウェアを開いて画像ファイルを開き、長方形のボックスを使用して各レーンを選択します。 [解析 ]に進み、各レーンを100%に設定し、長方形のボックスを使用して各レーンで過剰に表現されたバンドを選択します。 [解析 ]に移動してバンドの強度を決定し、各レーンでプロセスを繰り返して、結果を.xlsファイルとしてエクスポートします。 BaCDAアクティビティが最も低い実験実行のバンド強度を基準強度として考え、各レーンの表現を分析します。
  2. 酵素活性アッセイ
    1. 酢酸アッセイキット15を使用して、エチレングリコールキチン(1 mg / mL;EGC)を基板29として用いる。
    2. 40 μL の 50 mM Tris-HCl (pH 7) バッファーの存在下で、800 rpm で撹拌し、20 μL の BaCDA を 40 μL の基質と反応させます。
    3. 1時間後、100 μLの反応物を3 kDaカラムで2,111 x g 、4 °Cで15分間遠心分離します。 BaCDAを含む保持物を廃棄し、反応中に放出される酢酸を含む濾液を回収します。酢酸アッセイの濾液を使用して、 BaCDA活性を測定します。
      注:酵素の1単位は、1分間に酵素1マイクロリットルあたり1μMの酢酸を基質から放出する活性として定義されます。酵素活性アッセイはトリプリケートで実施し、それに応じてそれぞれの酵素活性を計算しました。
  3. ラクトース誘導の発酵速度論
    1. 活動プロファイルを調査して、乳糖誘導のポイントと発現の開始点を決定します。活性プロファイリングは、最適化された発酵条件でバイオマスと BaCDA活性を推定することによって行われます。
    2. グルコース推定キットを使用して、培地中のグルコース濃度を測定します。バイオマス、グルコース濃度、 および発酵時間に対するBaCDA活性を使用して、活性プロファイルをプロットします。

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結果

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Central Composite Design(CCD)を用いた大 腸菌 におけるペリプラズム組換え酵素キチン脱アセチルラーゼの発現プロセス最適化
pET22b-Ba CDAコンストラクトは、最適化されていない条件で成長させた場合、最大バイオマス収量とBaCDA活性は、それぞれ22.26 ± 0.98 g/Lおよび84.67 ± 0.56 U/Lでした15。現在の研究では、統計的アプローチCCDを採用して、大腸菌RosettapLysS細胞でペリプラズム組換え酵素キチン脱アセチル化酵素を発現するための最適なプロセス条件を見つけました。インキュベーション温度(A)、攪拌速度(B)、インキュベーション時間(C)、グルコース濃度(D)、ラクトース濃度(E)の5つのプロセスパラメータは、予備作業に基づいて選択されました(表1)。ペリプラズム組換え酵素キチンデアセチラーゼの発現を定量化し、組換えキチンデアセチラーゼのBaCDA活性(U ...

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ディスカッション

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脱アセチル化キチン、キトサンは、特に生物医学分野で多くの用途があります30。しかし、キトサンのアセチル化度(DA)やアセチル化パターン(PA)の再現性は、他の環境懸念に加えて大きな懸念事項です。したがって、酵素を使用するより環境に優しいルートが利用されています。CDAの配列は、脱アセチル化のユニークなパターンを持つキトサンを作成するために採用することができ、これにより生物医学的応用が増加します4,5。私たちの以前の研究では、クローニングされたBaCDA遺伝子は大腸菌のRosetta pLysS細胞で発現していました15。

BaCDAは、一次スクリーニングで37°Cで封入体として発現しました。文献調査に基づくと、より低い発現温度(すなわち、16°C)を用いて、結核自己誘導培地31

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開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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著者らは、MAHE UNSW基金を提供してくれたManipal Academy for Higher Education(MAHE)に感謝し、著者は、2019年3月31日付けの上級研究フェローシップ、賞レター番号09/1165(0007)2K19 EMR-Iを提供してくれたインド政府の科学産業研究-人材開発グループ(CSIR-MHRD)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Kits
アセテートアッセイキットMegazyme、アイルランドK-ACETAKプロトコルはわずかに変更され、96ウェルプレートでアッセイを実行するために最適化されています
グルコース推定キットAgappe診断株式会社、インド12018013プロトコルはわずかに変更され、96ウェルプレート
でアッセイを実行するために最適化されていますChemicals
酢酸ハイメディア、インドAS001SDS-PAGE染色および脱ステイン溶液の調製に使用
アクリルアミドハイメディア、インドMB068SDS-PAGEゲルの調製に使用
プルスルフェートアンモニウムハイメディア、インドMB003SDS-PAGEゲル
ビスアクリルアミドハイメディアの調製に使用、インドMB005SDS-PAGEゲルの調製に使用
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media、インドMB092SDS-PAGE染色および脱ステイング溶液の調製に使用
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media、インドMB153バードフォードアッセイの調製に使用
エチレングリコールキトサンSigma-aldrich、米国E1502エチレングリコールキチンの調製に使用され、エチレングリコールキチンは酵素反応
D-グルコースHi-mediaのMB037培地成分として使用されました。
イミダゾールHi-media, IndiaGRM1864溶解バッファーに使用
LactoseHi-media, IndiaGRM017メディアコンポーネントとして使用されます。
メタノールフィナール、インド30930LC250SDS-PAGE染色および脱ステ溶液の調製に使用
塩化ナトリウム(NaCl)Hi-media、インドMB023溶解バッファーに使用
リン酸Hi-media、インドMB157バードフォードアッセイの調製に使用
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)Hi-media、インドGRM6218SDS-PAGEゲルの調製に使用
リン酸ナトリウム二塩基性無水Hi-media、インドMB024酵素反応のための培地および緩衝液用のTB塩分を調製するために使用されます。
リン酸ナトリウム一塩基性無水Hi-media、インドGRM3964地および酵素反応用のバッファー用のTB塩分を調製するために使用されます。
テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)Hi-media、インドMB026SDS-PAGEゲルの調製に使用
トリスベースHi-media、インドMB029SDS-PAGEゲルの調製に使用
TryptoneHi-media、インドRM7707メディアコンポーネントとして使用されます。
酵母エキスHi-media、インドRM027メディアコンポーネントとして使用されます。
Equipment
AlphaImager HPゲルドキュメンテーションユニットProteinSimple, USA92-13823-00SDS-PAGE写真のキャプチャに使用
ベンチトップミキサーエッペンドルフ, ドイツ 9.776 6602 mLアダプターバイオ
インキュベーターシェーカートリシュル機器、インド13410622異なる温度およびRPMで細菌培養をインキュベートするために使用されます
バイオ分光光度計ッペンドルフ、ドイツ 6135000009すべての分光測定値を取るために使用されます
冷却遠心分離機エッペンドルフ、ドイツ 5805000017培養物、溶解物、その他すべての遠心分離プロトコルの遠心分離に使用
ドライバスLabnet International, USAS81522039SDS-PAGEマイクロピペットのタンパク質サンプルの変性に使用
ッペンドルフ, ドイツ 3123000900ボリューム測定のためのプロトコルを throghout ロッカー
カーTrishul instruments, India11770719および脱染するためのSDS-PAGEゲルを振るために使用されます
SDS-PAGEゲル
UltraソニックーターSonics&をキャストして実行するために使用されますMaterials, Inc., USAVCX 130超音波処理により細菌細胞を溶解するために使用される
計量天秤ザルトリウス、ドイツBSA124 Sプロトコル全体の重量を測定するために使用される
Devices
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane (3 kDa)PALL life sciences, USAOD003C33基質後の酵素を分離するために使用MINITAB
でSoftwaresバージョン
(体験版) ペンシルベニア州立大学実験モデルを設計し、データを分析するために使用されます
ImageJ1.53o国立衛生研究所 (NIH)SDS-PAGE image
Plasmid
pET22b (+) DNA—NovagenMerck- Millipore, USA69744− 20 ° で保存C
Cells
大腸菌ロゼッタpLysS—NovagenMerck-Millipore、USA70956Luria&ndashで維持されています。25%グリセロールを含有するベルターニ(LB)ブロス(マイナス)。80度;ハ
基質として使用され、インド 培との酵素反応のために保持するために使用されます エ エシェー SDS-PAGEユニットBio-Rad, USA 1658001FCを染色 17.0開発されたtreatmentは

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