出芽酵母における一倍体の交配効率の決定

Summary

この研究では、酵母 サッカロマイセス・セレビシエ の交配効率を定量化するための堅牢な方法が説明されています。この方法は、スペシエーション研究における前接合体障壁の定量化に特に有用です。

Abstract

サッカロミセス・セレビシエは、遺伝学、進化学、分子生物学において広く使用されているモデル生物です。近年では、種分化に関連する問題を研究するための人気のあるモデル生物にもなっています。酵母のライフサイクルには、無性生殖段階と有性生殖段階の両方が含まれます。進化実験の容易さと生物の短い世代時間は、生殖障壁の進化の研究を可能にします。2つの嵌合タイプ(aとα)が嵌合してa/α二倍体を形成する効率は、嵌合効率と呼ばれます。一倍体間の交配効率の低下は、前接合体障壁を示しています。したがって、2つの一倍体間の生殖隔離の程度を定量化するには、交配効率を定量化する堅牢な方法が必要です。この目的のために、シンプルで再現性の高いプロトコルがここに提示されます。このプロトコルには、YPDプレート上のハプロイドのパッチ適用、等数のハプロイドの混合、単一コロニーの希釈とプレーティング、そして最後にドロップアウトプレート上のコロニー数に基づく効率の計算を含む4つの主要なステップが含まれます。栄養要求性マーカーは、一倍体と二倍体を明確に区別するために使用されます。

Introduction

一般に出芽酵母と呼ばれるサッカロミセスセレビシエは、単細胞真核生物です。交配タイプはaとαの2種類で、無性生殖周期と有性生殖周期の両方を示します。aおよびα交配タイプは一倍体であり、酵母の無性サイクルを表す周囲の環境に他の交配タイプがない場合、有糸分裂的に分裂する可能性があります。2つの交配タイプが近接している場合、それらは有糸分裂を停止し、融合して二倍体細胞を形成します。二倍体酵母は、栄養素が存在するときに有糸分裂するか、酢酸¹などの非発酵性の貧弱な炭素源の存在下で窒素飢餓の条件下で減数分裂を起こすことができます。これにより胞子が形成され、良好な成長条件が得られるまで休眠状態が残ります。これらの胞子が発芽し、2つの一倍体タイプが一倍体プールに放出されると、ライフサイクルが完了します^2,3(図1)。

酵母細胞の交配には、凝集、交配突起または「shmoo」の形成、それに続く細胞および核融合などのいくつかのステップが含まれます

Protocol

注:プロトコルには、(1)YPDプレート上の嵌合効率グリッドのハプロイドにパッチを当てる、(2)24時間のインキュベーション後に一倍体を等数で混合し、混合ハプロイドを数時間交配させる(この研究では7時間)、(3)混合細胞をYPDにプレーティングして、30°Cで7時間後に単一コロニーを単離する、 そして最後に、(4)栄養要求性マーカーを用いて形成される二倍体の数を決定する。これらの手順については、以下で詳しく説明します ( 図 2 も参照)。

1. 嵌合効率グリッドにおける一倍体のパッチング

1. YPD寒天プレート(2%寒天、2%デキストロース、1%ペプトン、0.5%酵母エキス)でストリーキングすることにより、冷凍庫ストックからハプロイド a およびα を復活させ、30°Cで48時間増殖させて単離された単一コロニーを得ます。
2. YPDプレートの単一コロニーを5 mLのYPD培地(2%デキストロース、1%ペプトン、0.5%酵母エキス)に接種し、250 rpmで振とうしながら30°Cで48時間インキュベートします。細胞はこの潜伏期間の後、成長の定常期にある。
3. 新しいYPDプレートに嵌合効率グリッドを描きます。 図 2A

Results

2種類の嵌合効率の定量化
ここで説明したプロトコルを使用して、2つの酵母株間(SK1AM aとSK1AMαの間、およびScAMaとScAMαの間の交配効率を定量化しました(図3A)。これらの実験では、2つの一倍体間の交配を少なくとも12回繰り返した。実験の繰り返しのそれぞれにおいて、少なくとも100個のコロニーが二重ドロップアウト培地上にストリークされた。プロトコルの堅牢性により、SK1AMとScAMの2つの系統間の交配効率を簡単に区別することができました。SK1株は非常に高い効率で交配しましたが、ScAM株は比較的低い効率で交配しました(図3A)。ScAM株は、S. cerevisiae株とS. carlsbergensis株のハイブリッド交配に由来するため、これはおそらく驚くべきことではありません

Discussion

S. cerevisiaeの交配効率の定量化は、交配経路に関与する遺伝子に関する研究や、交配行動に対する外部環境の影響を研究するために不可欠です。過去20年間で、S. cerevisiaeは種分化に関連する質問に対処するための人気のあるモデルにもなりました14,36,37,38。2つの交配タイプの存在と、実験室環境での遺伝子操作と維持の容易さにより、生殖障壁の進化をリアルタイムで研究するのに適した生物となっています。交配効率の定量化は、接合前生殖障壁の尺度を与えるため、不可欠です。したがって、再現性の高い便利なプロトコルが必要です。

上記のプロトコルを使用して、全く異なる交配行動を示す2つの異なる株の交配効率を定量化した。したがって、ほとんどの実験酵母株は選択

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アデニン	シグマライフサイエンス	A8626
寒天粉末細菌学用レギュラーグレード	SRL	19661(0140186)
硫酸アンモニウム、HiMedia		GRM1273
D-(+)-グルコース	グマライフサイエンス	G8270
ガラスペトリプレート	HiMediaPW008		寸法 90 mm x 15 mm
L-アルギニン	シグマ ライフサイエンス	A8094
L-アスパラギン酸	シグマ ライフサイエンス	A7219
L-ヒスチジン 一塩化物 一水和物	シグマ ライフサイエンス	H5659
L-イソロイシン	シグマ アルドリッチ	I2752
L-ロイシン	シグマ ライフサイエンス	L8912
L-リジン	Aldrich	62840
L-メチオニン	シグマライフサイエンス	M5308
L-フェニルアラニン	シグマライフサイエンス	P5482
L-スレオニン	シグマ アルドリッチ	T8625
L-チロシン	シグマライフサイエンス	T8566
L-バリン	シグマライフサイエンス	V0513
嵌合効率グリッド			ペトリプレートに描かれた1cm×1.5cmの長方形のグリッド
マイクロ遠心チューブ	ターソン	500010
ペプトン	HiMedia	RM001
ウラシル	グマ ライフサイエンス	U0750
酵母エキスパウダー	HiMedia	RM027
酵母窒素ベース(アミノ酸と硫酸	アンモニウムを含まない)BDディフコ	233520