Method Article

線虫Caenorhabditis elegans腸内細菌叢の定量化と分析のためのフローバーミメトリーの応用

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

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線虫Caenorhabditis elegans は、宿主とマイクロバイオームの相互作用を促進する分子決定因子を調べるための強力なモデルです。本稿では、腸内細菌叢のコロニー形成における単一動物レベルのプロファイリングを、 線虫 生理学の重要な側面とともにプロファイリングするハイスループットパイプラインを提示する。

Abstract

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腸内細菌叢の構成は、動物の発育と生涯を通じて宿主の生理機能に劇的な影響を与える可能性があります。マイクロバイオームの組成変化を測定することは、これらの生理学的変化の間の機能的関係を特定する上で非常に重要です。 線虫Caenorhabditis elegans は、宿主とマイクロバイオームの相互作用の分子的要因を調べるための強力な宿主系として浮上しています。透明なボディプランと蛍光タグ付き天然微生物により、個々の C.エレガンス 動物の腸内細菌叢内の微生物の相対レベルは、大型粒子選別機を使用して簡単に定量化できます。ここでは、マイクロバイオームの実験セットアップ、目的のライフステージにおける 線虫 集団の収集と分析、ソーターの操作と保守、および得られたデータセットの統計分析の手順について説明します。また、対象微生物に基づいて選別機の設定を最適化するための考慮事項、 線虫 のライフステージに対する効果的なゲーティング戦略の開発、および腸内細菌叢の構成に基づいて動物集団を豊かにするために選別機機能を利用する方法についても説明します。プロトコルの一部として、高スループットアプリケーションへのスケーラビリティの可能性など、潜在的なアプリケーションの例を示します。

Introduction

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動物の進化は絶え間ない微生物の影響下にある1.動物の宿主は、環境中の多様な微生物から、宿主の能力を拡張し、その生理機能や病気に対する感受性を駆動する特定のパートナー2を獲得します3。例えば、腸内細菌叢のメタゲノム解析により、肥満マウスにおいて、より大きなエネルギー収穫と貯蔵をもたらす可能性のある微生物遺伝子の代謝クラスが濃縮されていることが明らかになり4、その多くはヒトの腸内細菌叢にも見られます5。因果関係を確立し、マイクロバイオームの影響の分子決定要因を特定する必要性は依然として高いが、マイクロバイオームの複雑さと大規模なスクリーニングに対する宿主システムの扱いやすさによって進歩が妨げられている。

モデル生物であるC.エレガンスは、マイクロバイオームと宿主の生理機能との関連性に関する分子的理解を深めるためのプラットフォームを提供します。C.エレガンスは、粘膜層と絨毛構造を持つ20個の腸細胞を持っています。これらの細胞は、微生物産物を感知し、腸内コロニー形成体を調節する可能性のある抗菌分子を産生する豊富な化学受容体遺伝子を備えています

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Protocol

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1. マイクロバイオーム混合物の調製

  1. グリセロールフリーザーストックからリソジェニーブロス(LB)プレートまたは適切な増殖培地に細菌をスタンプまたはストリークアウトし、目的の細菌株( C.エレガンス 天然微生物の場合は通常25°C)に基づいて最適な温度で一晩増殖させます。
  2. LBプレートから、各細菌分離株の1つのコロニー(例:CeMbioコレクションの12個の細菌)を使用して、1 mLのディープウェルプレートの別々のウェルに800 μLのLB培地を接種します。250rpmで振とうしながら、最適な温度で一晩インキュベートします。
    注:このプロトコルは、定義された天然マイクロバイオーム(CeMbioなど)での使用に最適化されていますが、適切な条件下での増殖または他の培養容器(チューブ)により、個々の微生物に合わせて簡単に調整できます。
  3. 分光光度法によって各微生物の成長を評価します。20 μL のアリコートを 80 μL の LB に移し、透明で平底の 96 ウェルプレートに溶液を加えます。プレートリーダーでOD600 を測定します。
  4. 一晩増殖させた後、ディープウェル培養プレートを4,000 x g で10分間遠心分離してバクテリアをペレット化し、96ウェル吸引マニホールドまたはマルチチャンネルピペットを使用して吸引により上清を除去します。
  5. O....

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Results

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成虫と幼虫の個体群ゲートの定義
ここでは、標準的な実験室用飼料である大腸菌OP50(Eco)を播種したNGMプレート上で、同期したC.エレガンスL1を増殖させました。C.エレガンスの個体群は、20°Cで96時間または120時間増殖した後、LPS分析のために収集されました(図2A)。絶滅(EXT、体密度のプロキシ)と飛行時間(TOF、体長のプロキシ)のドットプロットは、視覚的に分離された2つの動物の雲を作成します。各ドットは、幼虫と比較して成虫のEXT値とTOF値が高い1匹の動物を表しています(図2B)。これら2つのパラメータは、個体数増加と生理学に関する貴重な推論です。例えば、幼虫のTOFの密度プロットは、幼虫期の分布を可視化することができます。生後2日の成体の子孫は、TOFが200未満のL1およびL2ステージが優勢であったが、3日齢の成体のほとんどの子孫はL3およびL4ステージに達した(

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Discussion

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フローバーミメトリーは、いくつかの研究で病原体のコロニー形成と毒性に対するC.エレガンスの遺伝子と経路を特徴付けるために使用されています21,22。ここでは、C.エレガンスを用いて腸内細菌叢が宿主の生理機能をどのように調節するかを調査するハイスループットで従順なアプローチを紹介します。コロニー形成単位(CFU)または16S rRNAアンプリコンシーケンシング9,16,17,23,24を使用する既存の方法と比較して、このアプローチは労働集約的なカウントを必要とせず、潜在的なPCRバイアスを導入しません。このアプローチでは、集団全体のマイクロバイオームを測定するだけで.......

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Disclosures

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著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

Acknowledgements

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この研究は、NIHの助成金DP2DK116645(B.S.S.)、Dunn Foundationパイロット賞、NASAの助成金80NSSC22K0250(B.S.S.)の支援を受けました。このプロジェクトは、ベイラー医科大学のサイトメトリーおよびセルソーティングコアの支援も受けており、CPRIT Core Facility Support Award(CPRIT-RP180672)、NIH(S10 OD025251、CA125123、およびRR024574)、Joel M. Sederstromの支援、およびLPS NIH助成金(S10 OD025251)の機器助成金から資金提供を受けました。一部の株は、NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)から資金提供を受けているCGCによって提供されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL 円錐底遠心チューブVWR10026-076
96 ディープウェルプレート (1 mL)AxygenP-DW-11-C
96 ディープウェルプレート (2 mL)AxygenP-DW-20-C
96 ウェル Costar プレートCorning3694
寒天ミリポア シグマ標準細菌学寒天培地も十分です。
吸引マニホールドV&P scientificVP1171A
漂白剤クロロックス
漂白剤溶液 漂白剤と5M次亜塩素酸ナトリウムを混ぜる 2:1 (v/v)
細胞イメージング マルチモードリーダーBiotekCytation 5細菌外径測定
遠心分離機Thermo scientific Sorvall Legend XTR96ウェルプレートおよびコニカルチューブ用
蛍光顕微鏡ニコンTiE
ggplot:データをプロットするためのさまざまなRプログラミングツール。Rパッケージバージョン3.3.2
大粒子オートサンプラーユニオンバイオメトリカLPサンプラー
大粒子ソーターユニオンバイオメトリカCOPASバイオソーター
レバミソールフィッシャーAC187870100
リゾジェニーブロス(LB)RPIL24066バクトトリプトン、酵母エキス、NaClを使用した標準LB自家製レシピもご用意しています足りる。
M9ソリューション 22 mM KH2PO4 一塩基性、42.3 mM Na2HPO4、85.6 mM NaCl、1 mM MgSO4
線虫増殖培地RPIN81800-1000.01 mM CaCl2、25 mM KPO4 pH 6.0、オートクレーブ後に 1 mM MgSO4 を添加。
RStudioGNUバージョン 1.3.1093
次亜塩素酸ナトリウムSigma-Aldrich5M NaOH
実体顕微鏡NikonSMZ745
滅菌直径 10 cm シャーレコーニング351029
滅菌済み 12 ウェルプレートVWR10062-894
滅菌済み 24 ウェルプレートVWR10062-896
滅菌直径6cmのシャーレCorning351007
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al.

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