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方法論記事

炭素ナノ粒子支援副甲状腺摘出術 による 副甲状腺機能低下ラットの作製

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DOI：

10.3791/64611

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2023年7月14日

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1State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Cariology and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthognathic and TMJ Surgery, West China Hospital of Stomatology, 3Guangdong Province Key Laboratory of Stomatology, Hospital of Stomatology, Guanghua School of Stomatology, Sun Yat-Sen University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

後天性副甲状腺機能低下症(HypoPT)の動物モデルは、HypoPTがミネラルイオン恒常性にどのように影響するかを理解し、新しい治療法の有効性を検証するために重要です。ここでは、カーボンナノ粒子を用いた副甲状腺摘出術(PTX)により後天性副甲状腺機能低下症(AHypoPT)ラットモデルを生成する技術を提示する。

要約

副甲状腺機能低下症(HypoPT)は、副甲状腺が関与するまれな疾患であり、副甲状腺ホルモン(PTH)の分泌または効力の低下を特徴とし、血清リンレベルと血清カルシウムレベルの低下につながります。HypoPTは、最も一般的には、甲状腺または他の前頸部手術中の腺への偶発的な損傷またはそれらの除去に起因します。副甲状腺/甲状腺手術は近年より一般的になり、それに応じて術後合併症としてのHypoPTの発生が増加しています。ミネラルイオン恒常性に対するHypoPTの効果の根底にあるメカニズムをよりよく理解し、新しい治療法の治療効果を検証するために、HypoPT動物モデルが非常に重要です。ここでは、カーボンナノ粒子を用いて副甲状腺摘出術(PTX)を行うことにより、雄ラットに後天性HypoPTを作製する技術が報告されています。ラットモデルは、副甲状腺機能低下症のマウスモデルよりも大きな期待を示しています。重要なことに、ヒトPTH受容体結合領域はラットの配列類似性84.2%であり、これはマウスと共有される73.7%の類似性よりも高い。さらに、PTH / PTHrP受容体シグナル伝達経路に影響を与える可能性のあるエストロゲンの影響は、雄ラットでは十分に調査されていません。カーボンナノ粒子は、機能に影響を与えずに甲状腺リンパ節を黒く染色するリンパトレーサーですが、副甲状腺を染色しないため、識別と除去が容易です。この研究では、血清PTHレベルはPTX後に検出されず、これにより有意な低カルシウム血症と高リン血症が発生しました。したがって、術後HypoPTの臨床状態は、ラットモデルにおいて顕著に表すことができる。したがって、カーボンナノ粒子支援PTXは、HypoPTの病因、治療、および予後を研究するための非常に効果的で容易に実装可能なモデルとして役立ちます。

概要

副甲状腺ホルモン(PTH)は副甲状腺から分泌されます。カルシウムバランスの主要なモジュレーターであり、リン酸代謝を維持し、骨代謝回転に関与します1,2。副甲状腺機能低下症(HypoPT)は、PTHの分泌低下または機能喪失として現れます。これはまれな内分泌障害であり、有病率は10万人年あたり約9〜37人です3,4,5。HypoPTは、血清PTHおよびカルシウムレベルの低下が特徴であり、血清リンの増加を伴う6,7。HypoPTは、その原因に基づいて分類されます:後天性副甲状腺機能低下症(AHypoPT)または特発性副甲状腺機能低下症(IHypoPT)8。AHypoPTは臨床診療でより一般的に遭遇します。AHypoPT症例の約75%は、甲状腺手術またはその他の頭頸部手術中の副甲状腺の切除または偶発的な損傷によって引き起こされます。その他の原因には、頭頸部腫瘍に対する放射線療法と化学療法、および薬物毒性が含まれます1,8。診断法のアップグレードと甲状腺関連疾患のスクリーニングの増加により、甲状腺外科手術の数が増加しています。これは、関連する副甲状腺合併症の対応する増加につながっています9,10。

AHypoPTをよりよく調べ、新しい治療法の治療効果を検証するためには、安定した特性を持つ容易に確立された動物モデルが必要です。ラットおよびマウスに対して行われた副甲状腺摘出術(PTX)は、以前の研究で報告されています6,11;しかし、副甲状腺のサイズが非常に小さく、解剖学的分布が変動するため、実際には成功率は比較的低いです。したがって、甲状腺・副甲状腺摘出術(TPTX)(すなわち、甲状腺および副甲状腺の全摘出)は、通常、副甲状腺12の切除を確実にするために行われる。しかしながら、結果として生じる低チロキシンレベルは、この動物モデル13を用いた研究を複雑にし得る。薬物刺激や遺伝子編集などの他の方法で確立されたHypoPTモデルは、最も一般的なAHypoPT病因を適切に表すことができません。私たちのグループは以前、ノックアウトマウスモデルを使用して副甲状腺を標識し、甲状腺とその周囲の解剖学的構造に損傷を与えることなく副甲状腺を除去できるようにしました14,15。しかし、この方法はトランスジェニックマウスモデルを利用しており、交配や繁殖の要件から開発期間が長くなります。

そこで、AHypoPTの簡易生成モデルの確立を目指しました。この研究では、カーボンナノ粒子標識を使用したPTXのラットモデルについて説明します。甲状腺手術で一般的に使用される50 mg/mLのカーボンナノ粒子懸濁液は、局所注射後に甲状腺に均等に分布します16。甲状腺は黒くなりますが、副甲状腺は染色されないまま17、副甲状腺と甲状腺を明確に区別し、甲状腺に影響を与えることなくPTXを行うことができます。この方法は、さまざまな年齢のラットに適しています。カーボンナノ粒子懸濁液の注入は安全であり、甲状腺機能18に対する影響はごくわずかである。この研究で生成された炭素ナノ粒子標識PTXラットモデルは、4週間の観察期間中に有意な低カルシウム血症および高リン血症の表現型を示しました。したがって、このAHypoPTモデルは確立が容易であり、再現可能な表現型を有する。

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プロトコル

この研究は、四川大学口腔疾患国家重点研究所の施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。実験前に関連する地元の機関から許可を得ました。平均体重200〜250gの8〜10週齢の雄スプレイグドーリー(SD)ラット8匹を本研究に使用しました。.動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。食物と水は実験期間を通して 自由に 提供されました。

1. カーボンナノ粒子支援PTXラット作製のための術前準備

  1. 2.0%〜2.5%のイソフルラン吸入を使用して8〜10週齢のラットを麻酔し、続いて10 mL / kg体重でトリブロモエタノールの腹腔内(i.p.)注射を行います。.瞳孔光反射がないことをテストすることにより、十分な麻酔深度を保証します。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
    注:8〜10週齢のラットは成体ラットとして認識されます。ただし、このモデリング方法は、生後7日齢のラットに使用できます。
  2. 腹側頸部領域の毛皮を仰臥位で剃ることにより、麻酔をかけたSDラットを手術用に準備する。ポビドンヨード綿球を使用して手術部位を消毒します( 材料表を参照)。
  3. 動物を外科用ドレープ( 材料の表を参照)で覆い、微生物汚染を最小限に抑えることを目的として、手術領域を露出させます。

2.副甲状腺摘出術(PTX)

  1. 両耳の中間点から始めて、外科用メスを用いて尾に向かって縦方向に2cmの切開を切ります。筋膜と脂肪層を鋭く湾曲した鋸歯状の鉗子で連続して解剖します。
  2. 気管傍筋を分離し、4倍〜5倍の倍率で実体顕微鏡下で比較的鈍い鉗子を使用して気管を露出させます。
  3. 気管の側面にある蝶の形をした甲状腺の左右の葉を見つけます。
  4. 30 Gの斜角針を備えた10 μLのシリンジを使用して、甲状腺の膜の下に1 μLのカーボンナノ粒子懸濁液( 材料の表を参照)を注入します。5分後、生理食塩水で手術領域を洗浄し、甲状腺膜を覆う余分なカーボンナノ粒子懸濁液を洗浄します。
    注意: 推奨される注射ポイントは、血管が少ない甲状腺葉の近心部分です。カーボンナノ粒子懸濁液は、リンパ節を検出する能力があるため、甲状腺手術で一般的に使用されます。甲状腺を染色し、副甲状腺を染色しないままにしておくと、後者の識別が容易になります。
  5. 甲状腺が黒くなり、副甲状腺が~5分で染色されないことを確認します。ハイライトされた副甲状腺を実体顕微鏡またはテーブルランプのいずれかの光を使用して通常の光の下で観察します。
    注:通常、げっ歯類は甲状腺の左右の表面に2つの滴状の副甲状腺を持っています。時折、追加の副甲状腺がさらに遠くに位置することがあります。
  6. 染色されていない副甲状腺を顕微手術用鉗子とはさみで正確に切断します。止血には滅菌綿球を使用するか、出血が多い場合はゼラチンスポンジを使用してください。
  7. 6-0ポリグラクチン910縫合糸を使用して中断された水平マットレス縫合糸で、筋肉、脂肪層、および皮膚を層ごとに閉じます( 材料の表を参照)。
  8. 偽グループの場合、ステップ2.6を除く術前準備とPTXのすべてのステップを実行します。ラットを麻酔し、気管の上の組織を分離します。副甲状腺を見つけますが、それらを除去しないでください。PTX群のラットと一緒に術後の回復と観察を行います。

3.術後の回復と観察

  1. 手術後、ラットを体温を維持するために恒温電気ブランケット(37°C)に置きます。術後鎮痛として、塩酸ブプレノルフィン0.01 mg / kgを12時間ごとに皮下注射します。.ラットが動き始めて這おうとしたら、ラットを滅菌ケージに移します。
  2. 術後2時間ラットを注意深く観察する。ラットを飼育室に戻し、日常的に観察し、状態を記録します。
  3. 手術の7日後に尾静脈から10μLの血液を採取します。適切な市販キットを使用して、血清Ca2+、血清Pi、および血清PTHを測定し ます(材料の表を参照)。副甲状腺摘出術が成功すると、血清イオン化Ca2+ レベル2SDが低下し、偽手術ラットよりも低くなります(9.00 mmol / L、n = 16)。
    注:統計分析には、統計およびグラフ作成ソフトウェア( 材料表を参照)が使用されました。スチューデントのt検定を使用して、偽グループとPTXグループの間で血清と尿のパラメーターを比較しました。 p < 0.05は統計的に有意であると考えられた。血清および尿中Ca2+ およびPiならびに血清尿素およびクレアチニンは、製造業者の指示に従って市販のキットで測定した( 材料表を参照)。I型コラーゲンおよびオステオカルシンの血清C−テロペプチドを市販のELISAキットを用いて測定した( 材料表参照)。

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結果

副甲状腺の位置と数は、解剖顕微鏡下でラットで最初に観察されました。カーボンナノ粒子注入前は、甲状腺は半透明の赤色であり、副甲状腺は顕微鏡ではほとんど区別できませんでした(図1A)。ナノ粒子注入後、甲状腺は黒く染色されましたが、副甲状腺は染色されていませんでした(図1B)。明るい色の副甲状腺を注意深く解剖すると、甲状腺は手つかずのままでした(図1C)。一般に、副甲状腺は甲状腺の外側または後縁に分布していました。

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図1:外科手術中の甲状腺と副甲状腺の外観。 (

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ディスカッション

疫学的報告によると、甲状腺疾患の検出は大幅に増加し、それに応じて実行される関連する手術の数は19,20増加しています。術後副甲状腺機能低下症の発生率は約7.6%8,21ですが、後天性副甲状腺機能低下症の罹患率の増加により、このまれな疾患はより大きな研究注目を集めています。したがって、疾患の病因を調査し、新しい治療法の結果をテストするために、適切な動物モデルを確立することが特に重要です。ただし、現在のところ、利用可能な動物モデルは限られています。さらに、そのようなモデルを作成する際の外科的処置の成功率、生存率、および難易度は依然として問題があります。私たちのグループは以前にマウスで2つのHypoPTモデルを報告しました。PTHcre+/Rosa-mTmGマウスでは、副甲状腺を正確に解剖するために副甲状腺を蛍光標識し、この方法は解剖学的分布が異常な副甲状腺を見つけて手術の成功率を向上させ...

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開示事項

著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。

謝辞

この研究は、NSFC助成金81800928、四川大学口腔病学西学校/病院からの研究資金(No. RCDWJS2021-1)、および口腔疾患の国家重点研究所オープンファンディング助成金SKLOD-R013によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9%塩化ナトリウム溶液Kelun Co. Sichuan、China
10 & micro;L 30G NanoFil シリンジWPI
6-0 ポリグラクチン 910 縫合糸 針付きEthicon, IncJ510G
カルシウム LiquiColor テストEKF0155-225Ca2+ 分析用
カーボン ナノ粒子懸濁液 注射Lummy, 重慶,中国 H200732461 mL : 50 mg
クレアチニン (Cr) アッセイ キット ( サルコシンオキシダーゼ )Jiancheng、南京、中国C011-2-1クレアチニン分析用
使い捨てメスShinva、中国
Dumstar生物学鉗子Shinva、中国
マイクロ解剖春はさみShinva、中国
MicroVueラット無傷PTH ELISA免疫トピック30-2531血清
中のPTHの測定用ニードルホルダーShinva、中国
リンLiqui-UVテストEKF0830-125Pi分析用
プライガーゼWeian株式会社河南省、中国
Povidone-ヨウ素Yongan製薬 Co.Ltd。成都、中国
Prism 9.0 (統計およびグラフ作成ソフトウェア)GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USAhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ラット C-テロペプチド of Type I コラーゲン (CTX-I) ELISA キットCUSABIO, 武漢, 中国CSB-E12776rCTX-I 分析用
ラット オステオカルシン/ボーン グラ タンパク質 (OT/BGP) ELISA キットCUSABIO, 武漢, 中国CSB-E05129rオステオカルシン分析用
安全シングルエッジカミソリブレードアメリカンセーフティカミソリ会社66-0089
Sprague-Dawley ラット8 〜 10 週齢
外科用切開ドレープLiangyou Co. 四川省、中国
尿素アッセイキットJiancheng、南京、中国C013-2-1尿素分析用
ラット

参考文献

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