静的法と動的法を組み合わせたアプローチによる有機ペルオキシ酸の乳バイオフィルム根絶効果評価

酪農産業は、毎年約9,000万hLの牛乳を生産する10,500以上の酪農場があるカナダを含む、世界の主要な産業部門です¹。加工工場を含む酪農業界で課せられた厳格な衛生要件にもかかわらず、牛乳は微生物にとって優れた培養培地を構成するため、乳製品には腐敗微生物や病原性微生物などの微生物が含まれている可能性があります。これらの病原体はさまざまな病気を引き起こす可能性があります。たとえば、 サルモネラ 菌と リステリア菌は 、それぞれ胃腸炎と髄膜炎を引き起こす可能性があります²。腐敗微生物は、ガス、細胞外酵素、または酸を生成することにより、乳製品の品質と官能特性に影響を与える可能性があります³。牛乳の外観と色も、例えば シュードモナス 属⁴によって変更される可能性があります。

これらの微生物のいくつかは、ステンレス鋼を含むさまざまな表面にバイオフィルムを形成することができます。このようなバイオフィルムは、機器の表面での微生物の持続と増殖を可能にし、したがって乳製品の汚染を可能にします⁵。バイオフィルムは、熱伝達を妨げ、機器の腐食を加速させる能力があるためにも問題があり、機器の早期交換につながり、したがって経済的損失につながります⁶。

定置洗浄(CIP)手順により、食品業界は微生物の増殖を制御できます。これらの手順には、水酸化ナトリウム、硝酸、および場合によっては次亜塩素酸と過酢酸を含む消毒剤の順次使用が含まれます^7,8。次亜塩素酸は微生物に対して非常に効果的ですが、天然有機物とも反応し、有毒な副産物の形成を引き起こします⁹。過酢酸は有害な副産物を生成しません¹⁰;ただし、食品業界におけるバイオフィルムに対するその有効性は非常に変動します^10,11。最近、ペルプロピオン酸およびペル乳酸を含む他のペルオキシ酸がそれらの抗菌活性について研究されており、それらはバイオフィルムにおける微生物増殖の制御のための優れた代替手段であるように思われる^12,13。

そこで本研究では,有機ペルオキシ酸(過酢酸,過プロピオン酸,過乳酸,過乳酸,過酢酸系消毒剤)の乳用バイオフィルム除菌効果を,最小バイオフィルム消去濃度(MBEC)アッセイ,静的ハイスループットスクリーニング法,およびin situ 模倣動的手法である米国疾病対策センター(CDC)バイオフィルムリアクターと組み合わせたアプローチを用いて,乳用バイオフィルムを除菌する有効性を評価することを目的とした。 条件。MBECアッセイは、以下、プロトコルにおいて「バイオフィルムマイクロタイタープレート」と呼ばれる。ここに提示されたプロトコルと代表的な結果は、有機ペルオキシ酸の有効性と、乳製品産業における微生物バイオフィルムを制御するためのそれらの潜在的な用途を示しています。

この記事に含まれる作業には、バイオセーフティレベル2のラボが必要であり、ラバル大学の機関バイオセーフティ委員会によって以前に承認されています(プロジェクト番号119689)。

注: 図1 のフローチャートは、バイオフィルムを根絶するための有機ペルオキシ酸の有効性を評価するために使用された静的アプローチと動的アプローチを組み合わせた方法論の要約を表しています。

1.材料の準備

1. 微生物分離株
   1. 使用の15分前に生物学的安全キャビネット(BSC)の電源を入れ、70%(v / v)アルコール溶液で洗浄します。
   2. BSCが無菌になったら、試験する微生物分離物のバイアル(この研究ではシュードモナスアゾトフォルマン スまたは ブレブンディモナスベシクラリス )、接種ループ、10 mLの滅菌トリプシン大豆ブロス(TSB)で満たされた15 mLチューブ、およびボルテックスミキサーを置きます。BSCに配置する前に、すべての材料をアルコールで消毒してください。
   3. 微生物分離物のバイアルをボルテックスして培養物を均質化する。
   4. 20 μLの微生物分離物を15 mLチューブに含まれる10 mLの滅菌TSBに無菌的に移し、160 rpmで攪拌しながら30°Cで16〜24時間インキュベートします。
      注意: B. besicularis は、病原性生物の取り扱いに必要なガイドラインに従って、封じ込めレベル2の実験室で使用する必要があります。.ハンドラーは適切な訓練を受け、安全メガネ、手袋、コートを着用する必要があります。
2. 消毒 剤
   1. 有機ペルオキシ酸溶液(60 mL)を調製するには、24 mLの過酸化水素と36 mLの酸(酢酸、プロピオン酸、または乳酸)を250 mLの三角フラスコに加えます。次に、事前定義された容量の10 M硫酸を追加します(過酢酸の場合は655 μL、過プロピオン酸の場合は635 μL、または過乳酸の場合は715 μL)。フラスコを軽く振って混合し、フラスコをケミカルフード内に設置した30°Cの水浴に入れます。フラスコを2日間インキュベートし、毎朝穏やかに混合します。
      注意: 市販の過酢酸ベースの消毒剤( 材料の表を参照)は、メーカーから直接提供されました。
      注意: 消毒剤は化学フードの下で使用する必要があります。実験中は安全メガネと手袋を着用する必要があります。消毒剤の詳細については、各製品安全データシートを参照してください。
   2. 下記のように過酸化水素の滴定を行う。
      1. 空の300 mLビーカーを分析天びんの上に置き( 材料の表を参照)、スケールを風袋引きします。ビーカーに約0.23 gの消毒剤を量り、追加された正確な重量を書き留めます。ビーカーに冷たい1N硫酸溶液100 gを加え、ビーカーに磁気攪拌子を加えて、攪拌プレートに置きます。
      2. 完全に均質化されるまで溶液を攪拌します。次に、フェロイン指示薬溶液(H₂O中0.1重量%)をビーカーに3滴加え、溶液がサーモンピンク色から水色に変わるまで0.1 N硫酸セリウム溶液で滴定します。添加する硫酸セリウム溶液の量に注意してください。
      3. 次の式を使用して過酸化水素の割合を計算します。
         式 (1)
         ここで、S は添加した硫酸セリウム溶液の体積、N は硫酸セリウム溶液の正規度 (0.1 N)、W はサンプルの重量 (~0.2300 g)、0.017 = (1 mol H₂O 2/2 mol Ce) × (34.0147 g H 2 O 2 /1 mol H 2 O)₂ × (1 L/1,000 mL)
   3. 下記のように有機ペルオキシ酸の滴定を行う。
      1. 20 mLの7.5%(w / v)ヨウ化カリウム溶液をビーカーに加えます。溶液の青色が淡褐色/オレンジ色に変わり始めるまで、0.1 Nチオ硫酸ナトリウム溶液でゆっくりと滴定します。
      2. 2 mLのデンプン溶液(H₂O中に1 wt%)をビーカーに加え、溶液が黒からオレンジに変わるまで0.1 Nチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定します。使用したチオ硫酸ナトリウム溶液の容量に注意してください。
      3. 次の式で有機ペルオキシ酸の割合を計算します。
         式 (2)
         ここで、T は使用したチオ硫酸ナトリウム溶液の体積、N はチオ硫酸ナトリウム溶液の正規度 (0.1 N)、W はサンプルの重量 (~0.2300g)、0.038 = (1 mol CH 3 COOOH/1 mol I 2) × (1 mol I 2/2 mol S₂ O 3) × (76.06 g/1 mol CH₃COOOH) × (1 L/1,000 mL)
         注意: 手順1.2.2と手順1.2.3をさらに2つのサンプルで繰り返して、各テストを3回で実行します。

2.単一および混合バイオフィルムの形成

1. バイオフィルムマイクロタイタープレート
   1. 細菌培養物(20 μLの菌株+ 10 mLのTSB培地、ステップ1.1.4で調製)を含むチューブをボルテックスします。トリプシン大豆寒天培地(TSA)上で段階希釈とプレーティングを行い、一晩培養の菌体数(cfu)を測定します。次に、100 μLの培養液を10 mLの滅菌TSB培地(最終濃度約2 x 10⁷ cfu/mL)に無菌的に移します。
      注:バイオリアクターでのアッセイでは、100 μLの容量の微生物分離物を100 mLの滅菌TSBに移します。
   2. チューブを渦巻きます。各細菌について、希釈した細菌培養物をマルチチャンネルピペットを使用して3連でバイオフィルムマイクロタイタープレート(ウェルあたり150 μL)に移します。150 μLのTSB培地を3つの新しいウェルにロードし、コントロールとして使用します。バイオフィルムマイクロタイタープレート( 材料の表を参照)を攪拌せずに30°Cで24時間インキュベートします。
      注:混合バイオフィルムアッセイの場合は、各懸濁液75 μLを追加して、総容量150 μLにします。バイオフィルムマイクロタイタープレートは、その蓋にペグを含み、その上にバイオフィルムが形成される。
2. バイオリアクター
   1. 製造元の指示に従ってバイオリアクターの部品を洗浄および風乾し( 材料の表を参照)、以下に説明するようにリアクターの準備に進みます。
      1. まず、磁気バーでホルダーに取り付けられた1Lガラスビーカー(バイオリアクター)の内側にフラットブレードを置き、バイオリアクターの蓋の内側に取り付けられたプラスチックバーを使用してセットアップを直立位置に維持します。
      2. ドライバーを使用してステンレス鋼のクーポンまたはスライド( 材料の表を参照)をポリプロピレン棒に置き、ノッチに位置合わせピンを配置せずに蓋の穴に挿入して、滅菌中に蒸気を逃がします。
      3. すべてのバイオリアクターベントをアルミホイルで覆い、残りの機器、すなわちチューブL / S 18(ID = 7.9 mm)とL / S 16(ID = 3.1 mm)、ガラスフローブレーク、コンテナキャップ、ドライバー、鉗子、および0.2μmフィルターをアルミホイルで包みます。
         注意: シリコンチューブ( 材料表を参照)を中型コンテナキャップの内面にあるバーブに挿入します。
      4. オートクレーブに設置したバイオリアクターをドライサイクルで121°C、20分間行います。
   2. バイオリアクター内でバイオフィルム形成をバッチモードで行う(第1工程)。
      1. BSCでは、チューブL / S 18の一方の端をバイオリアクターの出口注ぎ口に接続し、もう一方の端をアルミホイルで包んで無菌性を維持します。
      2. バイオリアクターの蓋からクーポンまたはスライドホルダーを1つ取り外し、滅菌済みの50 mLチューブに入れます。その後、バイオリアクターのビーカーに340 mLの300 mg/L TSB培地を、50 mLの血清学的ピペットを使用してロッドが占めていた穴を通して満たします。
      3. バイオリアクター内の培養液に、5 mL ピペットを使用して 1 mL の細菌溶液 (~10⁸ cfu/mL の P. azotoformans) を接種し、ロッドを元の位置に戻します。すでに蓋の穴に配置されているロッドを、ピンがそれぞれのノッチに収まるように配置します。
      4. バイオリアクターの蓋にある最小直径のチューブの端に0.2μmのバクテリアエアパージフィルターを配置します。同じ直径の他のチューブは、金属製のスクリューキャップまたはしっかりと閉じるシリコンプラグで恒久的に差し込まれたままになります。
      5. バイオリアクターを30°Cに設定した加熱プレート上に24時間置き、130rpmで攪拌します。
         注:複数種のバイオフィルム形成には、等量の異なる細菌培養物を使用して、接種材料の総容量1mLを取得します。
   3. 連続フローモードでバイオリアクター内でバイオフィルム形成を行う(第2工程)。
      1. 18 Lの滅菌蒸留水を含むカーボイをBSCに入れ、1,000 mg/L TSB培養液2 Lを加えて最終濃度100 mg/Lを得ます。
      2. 2本のチューブが接続されている滅菌キャップで容器を覆います。1つ目は、キャップの内面に固定されたシリコンチューブで、媒体をポンピングするために使用されます。2番目のチューブ(L / S 16)は、液体がバイオリアクターに向かって流れるように外部ポートに接続されています。培地容器の蓋にある2番目のチューブに0.2μmのフィルターを置きます。
      3. この2番目のチューブを蠕動ポンプに接続し、もう一方の端をガラスフローブレークに結合し、ガラスフローブレークをバイオリアクター蓋の大きなチューブに挿入します。
      4. 別の20Lカーボイを使用して、バイオリアクターから廃液を収集します。バイオリアクター出口注ぎ口に接続されたチューブの端を廃棄物容器のキャップに取り付けます。この容器の蓋にあるチューブに0.2μmのフィルターを挿入します。
      5. 蠕動ポンプを11.3 mL / minの流量で始動し、システムを24時間稼働させます。
         注:バイオリアクターでのバイオフィルム形成中に使用された培地またはミルクの流量(11.3 mL / min)は、340 mL(リアクター内の液体の体積に相当)を30分の滞留時間で割ることによって決定されました。
   4. 細菌バイオフィルムを回収します。
      1. 蠕動ポンプをオフにし、バイオリアクターの攪拌と加熱を停止します。
      2. バイオリアクターから各ロッドを慎重に取り外し、クーポンまたはスライドを40 mLのPBSで3回すすぎ、浮遊細菌を除去します。その後、適切なドライバーを使用して、クーポンまたはスライドを40 mLのPBSを含む滅菌済みの50 mLコニカルチューブに解放します。チューブを30秒間ボルテックスし、超音波処理器浴に配置されたラックに移し、40kHzでチューブを30秒間超音波処理します(これには110Wの電力が必要です)。この操作を3回繰り返します。
      3. 40 mLのバイオフィルム懸濁液を滅菌50 mLコニカルチューブに集め、クーポンまたはスライドを2 mLの滅菌PBS溶液ですすいでください。このすすぎ液を回収し、すでに採取したバイオフィルム懸濁液に加えます。
   5. バイオフィルム中の生菌を列挙する:得られたバイオフィルム懸濁液を使用して、10倍の段階希釈を行い、次に10-5および^10-6希釈液の100 μLをTSAに3連でプレートします。プレートを30°Cで24時間インキュベートします。寒天プレートに存在するコロニーの数を数え、次の式を使用してASTM E2562-17¹⁴に従ってクーポンとスライド(生存固着菌)の細菌密度を計算します。
      式 (3)
      ここで、 X はコロニー形成単位(CFU)の数、 B は播種された容量(0.1 mL)、 V はバイオフィルムが懸濁している容量(ストック溶液)、 A はバイオフィルムで覆われたクーポンまたはスライドの表面、 D は希釈係数です。

3. 有機ペルオキシ酸のバイオフィルム除菌効果の定量的評価

1. バイオフィルムマイクロタイタープレート
   1. 200 μLのリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を96ウェルマイクロプレートの3つのウェルに加えます。
   2. ペグ上に形成されたバイオフィルムを含むバイオフィルムマイクロプレートの蓋を、PBSを含む96ウェルマイクロプレートに10秒間移し、バイオフィルムを洗浄し、浮遊細菌を除去します。
   3. 必要な濃度で消毒剤を準備します(例:.、25 ppm、50 ppm、500 ppm、1,000 ppm、5,000 ppm、10,000 ppm、および25,000 ppmの活性物質)。
      注:すべての希釈は、滅菌蒸留水を使用して無菌的に行われます。
   4. 各濃度の消毒剤200 μLを、新しい96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに3連で加えます。バイオフィルムマイクロタイタープレートの蓋を消毒剤を含むこの96ウェルマイクロタイタープレートに移し、プレートを室温で所望の曝露時間インキュベートします。
   5. 200 μLのDey-Engley中和ブロスを新しい96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えます。バイオフィルムマイクロタイタープレートの蓋を中和ブロスを含む96ウェルマイクロタイタープレートに移す。マイクロタイタープレートをパラフィルムで密封し、40kHzのバス超音波処理装置に30分間入れます。
   6. 30分後、超音波処理器からマイクロタイタープレートを取り外し、パラフィルムを取り外します。超音波処理後に剥離したバイオフィルムを含む96ウェルプレートの最初の列から新しい96ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に100μLを移します。
   7. 180 μLの滅菌1x PBSを、最初の行を除いて、新しい96ウェルマイクロプレート(ステップ3.1.6で調製)のウェルに追加します。1列目のバイオフィルム溶液20 μLを、180 μLの1x PBSを含む2列目のウェルに移します(2列目、希釈率:10⁻¹)。次に、2列目に含まれる液体20 μLを、1x PBSの180 μLを含む次の列のウェルに移します(行3、希釈:10⁻²)。同じ手順を繰り返して、^{10-5から10-7}の間の希釈を取得します。
   8. 100 μLの希釈液をTSAに接種し、各細菌の増殖に必要なパラメータに従ってプレートをインキュベートします。
   9. インキュベーション後、cfusを数え、各ペグのlog10密度と各消毒剤濃度での_log10の減少を次の式で計算します。
      式 (4)
      ここで、 X はスポットでカウントされたコロニー形成単位、 B は播種された容量(0.01 mL)、 V はウェル容量(0.20 mL)、 A はペグ表面積(46.63 mm²)、 D は希釈率です。
      式 (5)
   10. 独立した日に各実験を3回繰り返します。
       注:「バイオフィルムを根絶する消毒剤の最小濃度」、またはMBECは、細菌の増殖を示さない最低消毒剤濃度に対応します。
2. バイオリアクター
   注意: ASTM規格E2871-19¹⁵ の手順に従って、 P.アゾトフォルマンス PFlA1を使用してこのテストを実行します。
   1. ステップ2.2で説明したように、バイオリアクター内のクーポン上にバイオフィルムを形成することから始めます。次に、クーポンを保持しているロッドを取り外し、30 mLのPBSを含む円錐形のチューブ内ですすぎます。
   2. ドライバーを使用して各クーポンを滅菌済みの50 mLコニカルチューブにドロップし、コントロールに適した有機ペルオキシ酸溶液またはPBSを4 mL追加します。5分間インキュベートしてから、36 mLのデイエングレー中和ブロスを加えます。30秒間渦を巻き、次に超音波処理器浴を使用して30秒間40kHzで超音波処理します。このプロセスを3回繰り返し、バイオフィルム懸濁液を得る。
   3. 同様に、他のすべてのロッドをすすぎ、クーポンからバイオフィルムを回収します。TSA培地上でバイオフィルム懸濁液およびプレート0.1 mLの段階希釈を行います。プレートを30°Cで24時間インキュベートします。
   4. インキュベーション後、cfusを数え、次の式を使用して、各クーポンのバイオフィルム密度(式6)、処理と対照を含む同じロッドからの3つのクーポンの各セットの平均対数密度(LD)(式7)、および消毒剤の対数減少(式8)を計算します。
      式 (6)
      ここで、 X はカウントされたコロニー形成単位/クーポンの平均、 B はメッキされた容量(0.1 mL)、 V は消毒剤またはPBSと中和剤(40 mL)の容量、 D は希釈液です。
      式 (7)
      式 (8)

4. 有機ペルオキシ酸のバイオフィルム除菌効果の定性的評価

注:消毒剤で処理した後(ステップ3.1.1からステップ3.1.5)、静的法でバイオフィルムマイクロタイタープレートのペグ上に形成された P.アゾトフォルマンス バイオフィルムを調製し、走査型電子顕微鏡および共焦点顕微鏡での観察によって分析した。

1. 走査型電子顕微鏡(SEM)
   1. 200 μLの1x PBSを96ウェルマイクロプレートの3ウェルに加えます。蓋をバイオフィルムマイクロタイタープレート(ステップ3.1.5)からPBSを含む96ウェルマイクロプレートに移し、室温で10秒間放置して、Dey-Engley中和ブロスを除去します。
   2. 滅菌したニードルノーズプライヤーを使用して、バイオフィルムマイクロタイタープレートからペグを取り外します。各ペグをフードの下の空のバイアルに入れ、一次固定液(0.1 M Naカコジル酸バッファーpH 7.5中の5%グルタルアルデヒド)を各バイアルに追加します。各バイアルにキャップをし、4°Cで24時間インキュベートします。
   3. インキュベーション後、固定液をピペットでデカントし、すべての液体廃棄物を適切な容器に捨てます。各バイアルのキャップを外し、フードに入れて72時間風乾します。
   4. 各スタブの平らな上面にエポキシ樹脂(材料表を参照)を塗布することにより、サンプルをアルミニウムスタブ(材料表を参照)に取り付けます。次に、鉗子でペグをスタブに慎重に取り付けます。
   5. EMS950x + 350sゴールドスパッタ(材料表を参照)で、2 x 10-1バールのアルゴン圧力と20mAの電流で4分間サンプルを金属化します。金に露出していないペグの側面を銀の塗料で塗装して、適切な接地を行います(材料の表を参照)。
   6. SEMコントロールユーザーインターフェイスバージョン6.28を使用して、走査型電子顕微鏡で画像を取得します( 材料表を参照)。本研究で用いた加速電圧は15kVで、倍率は300倍と2,000倍とした。
2. 共焦点顕微鏡
   1. 200 μLの1x PBSを96ウェルマイクロタイタープレートの3ウェルに追加します。蓋をバイオフィルムマイクロプレートからPBSを含む96ウェルプレートに移し、10秒間放置してDey-Engley中和ブロスを除去します。
   2. 1 mLの滅菌水に3 μLの緑色蛍光染色剤と3 μLの赤色蛍光染色剤( 材料表を参照)を加えて、蛍光染色剤の溶液を調製します。
   3. 200 μLの染色液を96ウェルマイクロタイタープレートの1ウェルに加えます。蓋をバイオフィルムマイクロタイタープレートから染色液の入った96ウェルプレートに移します。バイオフィルムマイクロタイタープレートをアルミホイルで覆い、サンプルを室温で20〜30分間インキュベートします。
   4. 200 μLの滅菌水を96ウェルマイクロプレートのウェルに加えます。その後、蓋をバイオフィルムマイクロプレートから水の入った96穴マイクロプレートに移し、観察するまで放置する。
   5. 63x/1.40オイルDIC対物レンズを備えた共焦点レーザー走査型顕微鏡( 材料表を参照)を使用して、ペグ上に形成されたバイオフィルムを視覚化します。関連するソフトウェアを使用して画像を取得します( 材料表を参照)。緑色蛍光染色剤に用いた蛍光励起波長は、赤色蛍光染色剤に用いた蛍光励起波長はそれぞれ482nm、490nmであった。
      注意: 最良の結果を得るには、ペグをカットして60 mmのペトリ皿に入れ、皿に滅菌水を入れます。

SEM分析は、バイオフィルムマイクロプレートペグ上に P.アゾトフォルマンス PFl1Aによって生成されたバイオフィルムの存在を示しています(図2A)。3次元的なバイオフィルム構造を観察することができます。 P. azotoformans PFl1Aは、96ウェルマイクロタイタープレートを使用して強力なバイオフィルム生産者(A570 > 1.5)として以前に同定されました12。

また、バイオリアクターを用いてステンレススライド上に形成されたP. azotoformans PFl1Aバイオフィルムは非常に緻密であり、三次元構造を有する成熟バイオフィルムの形態学的特徴を示した(図2B)。さらに、動的システムにおけるこの分離株によって開発されたバイオフィルムの細菌数の結果は、TSB培養培地および滅菌スキムミルクでそれぞれ8.74 log CFU/cm 2および7.86 log CFU/cm2に相当する有意な細胞密度を示しました(図2C)。

さらに、B. besicularis分離物で得られた図3に示す結果は、特定の要因がバイオリアクター内のバイオフィルム形成に重要な影響を与える可能性があることを示しました。バイオリアクター内の攪拌速度、培地流量、培地栄養素濃度、連続モードステップの持続時間などのいくつかのパラメータを変化させることにより、細胞付着を強化し、より密度の高いバイオフィルムを観察することができます。例えば、栄養素濃度を100 mg/Lから900 mg/L(条件Fと比較して条件A)に増やすと、バイオフィルムの細菌数が6.11 log CFU/cm2から8.71 log CFU/cm2に増加した。さらに、流速を6.0 mL/min(条件C)に下げると、バイオフィルムの有意な成長が観察され、この分離株の成長速度と一致するより長い滞留時間が得られました。

バイオフィルムマイクロタイタープレートまたはバイオリアクターの消毒処理前後に形成されたバイオフィルムの顕微鏡観察は、生細胞数を補完しました。 図4 は、乳製品工場に通常施用される消毒剤の接触時間(5分)および濃度(有機ペルオキシ酸で500ppm、過酸化水素で100,000ppm)で検出可能な生細胞を含まないバイオフィルムがなかったことを示しています。これらの結果は顕微鏡観察によって確認された(図5)。 図5A は、未処理のMBECバイオフィルム(対照)の立体構造を示し、処理されたMBECバイオフィルム(過酸化水素、過酢酸、過乳酸、過プロピオン酸、および市販の消毒剤調製物を含む)は、SEMによって決定された3次元立体配座を失う。しかし、バイオフィルムは消毒剤で処理されましたが、特に過酸化水素では、明らかなバイオフィルム構造が残っていました。それにもかかわらず、ライブ/デッド技術、この場合は蛍光生存率染色を伴う共焦点顕微鏡(CM)を使用すると、消毒剤処理後に残りのバイオフィルム構造が主に生命がないことが確認されました(図5B)。

図1:バイオフィルムを根絶するための有機ペルオキシ酸の有効性を評価するための静的アプローチと動的アプローチを組み合わせたフローチャート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2: シュードモナスアゾトフォルマンス PFl1Aによるバイオフィルム形成の解析。 (A)バイオフィルムマイクロタイタープレートのペグ上に形成された P.アゾトフォルマンス PFl1Aバイオフィルムの走査型電子顕微鏡写真(300xおよび2,000x)。この図は、Goetzらの許可を得て12 から修正されています(Copyright 2022 American Society for Microbiology.全著作権所有。スケールバー= 50 μm(300倍)、100 μm(2,000倍)。(B)(1)バイオリアクター内で成長した P.アゾトフォルマンス PFl1Aバイオフィルムを含むステンレス製スライドおよび(2)バイオフィルムフリースライド(陰性対照)の走査型電子顕微鏡写真(2,000倍)。スケールバー= 10μm。この図は、Niboucha et al.16 から許可を得て修正されています。(ウ) P.アゾトフォルマンス PFl1Aバイオフィルムの細菌密度は、TSB培養培地および滅菌スキムミルク中のバイオリアクター内で形成され、ステンレス鋼スライドから超音波によってそれらを除去した後に決定された。データは平均±SD(n = 3)として表されます。有意差(p < 0.05)は、スチューデントのt検定に基づいています。この図は、Niboucha et al.16 から許可を得て修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:攪拌、流速、連続モードでの時間、および培地(TSB)のさまざまな条件下でバイオリアクターを使用して開発されたブレブンディモナス・ベシキュラリスバイオフィルムの細菌密度。条件A:130 rpmの攪拌速度、11.8 mL /分の流量、100 mg / L TSB培地で24時間連続モード(緑膿菌によるバイオフィルムの形成に関するASTM国際プロトコルE2562-1714に準拠);条件B:60 rpmの攪拌速度、11.8 mL /分の流量、100 mg / L TSB培地で24時間の連続モード。条件C:60 rpmの攪拌速度、6.0 mL /分の流量、100 mg / L TSB培地で24時間の連続モード。条件D:60 rpmの攪拌速度、6.0 mL /分の流量、100 mg / L TSB培地で48時間の連続モード。条件E:60 rpmの攪拌速度、6.0 mL /分の流量、300 mg / L TSB培地で48時間の連続モード。条件F:60 rpmの攪拌速度、6.0 mL /分の流量、900 mg / L TSB培地で48時間の連続モード。条件G:60rpmの攪拌速度、6.0mL/分の流量、2.7g/L TSBで24時間バッチモード、900mg/L TSB培地で48時間連続モード。データは平均±SD(n = 3)として表されます。有意差(異なる文字、p < 0.05)は、一元配置分散分析とテューキーの多重比較検定に基づいています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:過酸化水素、ペル乳酸、ペルプロピオン酸、過酢酸、または市販の消毒剤で処理する前後の シュードモナスアゾトフォルマンス PFl1Aバイオフィルムの生細胞数。 各点は、各分離株について3つの独立した日に得られた三重カウントの平均を表す。データは平均±SD(n = 3)として表されます。この図は、Goetzらの許可を得て12 から修正されています(Copyright 2022 American Society for Microbiology.全著作権所有。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:バイオフィルムの構造と生存率の顕微鏡観察。 (A)過酸化水素、過酢酸、ペル乳酸、ペルプロピオン酸、および市販の消毒剤で処理する前(対照)および処理後にバイオフィルムマイクロタイタープレートのペグ上に形成された シュードモナスアゾトフォルマンス PFl1Aバイオフィルムの走査型電子顕微鏡写真(300倍および2,000倍)それらの最小バイオフィルム根絶濃度(MBEC)。スケールバー= 10μm。この図は、Goetzらの許可を得て12 から修正されています(Copyright 2022 American Society for Microbiology.全著作権所有。(B) P. azotoformans PFl1Aによって形成されたバイオフィルムの生存率を、過酢酸(500 ppm)による処理前(左)および処理後(右)のバイオフィルムマイクロプレートPEG上の蛍光細胞生存率染色を用いて、共焦点レーザー走査顕微鏡(63x/1.40油微分干渉コントラスト対物レンズ)で可視化した。生細胞は緑色に染色され、死細胞は赤色に染色されます。スケールバー= 20μm。この図は、Goetzらの許可を得て12 に修正されています(Copyright 2022 American Society for Microbiology.全著作権所有。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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