真核生物における細胞表現型の主な要因の 1 つは遺伝子発現です。遺伝子発現の制御は不可欠であり、転写から翻訳プロセスまで、複数のタンパク質とRNAに依存しています1。これらのステップに沿った変化は、いくつかの異なる病気を引き起こす可能性があります。RNAプロセシングとスプライシングは、成熟RNA分子2,3,4,5の生成に関与する重要な反応群を構成します。スプライシングはイントロンを除去し、エクソンを結合して、機能的および構造的活性を実行できる成熟 RNA 分子を生成します。スプライシングの効率と速度は、さまざまな条件下で観察される表現型に大きく影響します6。
スプライシングは、5つのsnRNAと100以上のタンパク質で構成されるスプライセオソームと呼ばれる複雑な高分子機構によって行われます5,7。コアタンパク質成分に加えて、スプライセオソームにはトランス作用タンパク質があり、このプロセスの調節に直接影響を与える可能性があります8,9。スプライシングの重要性は、神経変性疾患、神経筋疾患、およびいくつかの種類の癌を含む、このプロセスの変化によって引き起こされる広範囲の疾患に反映されています3,10,11。スプライシングダイナミクスとスプライセオソームアセンブリの研究は、これらの障害の生物学の理解に大きな影響を与える可能性があります。
スプライセオソームアセンブリは、U1 snRNPと最近転写されたプレmRNAの特定の領域、5'スプライス部位5,8との結合から始まります。U1 snRNAによる5'スプライス部位の効率的なペアリングと認識は、使用すべきスプライス部位を定義するだけでなく、どのプレRNAが最初に、またはより効率的にスプライシングされるかを制御します6,12,13。異なるスプライス部位を使用すると、同じ遺伝子から成熟RNAの複数の代替アイソフォームを生成できます。選択的スプライシングはプロテオミクスの多様性の主要な供給源であり、発生中または異なる細胞や組織で必要なRNAとタンパク質の生成を可能にします14,15。代替RNA転写産物は、切断されたまたは機能しないタンパク質アイソフォームを生成する可能性があり、疾患を引き起こす可能性があります10,16。したがって、U1 snRNP複合体のタンパク質成分は、スプライシング1において重要な調節的役割を果たします。ガレクチン-1およびガレクチン-3(Gal1およびGal3)は、U1 snRNP17,18の成分です。Voss et al.19 は、U1 が枯渇した細胞のスプライシング活性を救うことができる Gal3-U1 snRNP に富む複合体を得るための核抽出物分画法を提案しています。この分析は、スプライセオソームへのGal3結合のメカニズムの理解に貢献し、同様のアプローチを使用して、他の潜在的なスプライシング調節タンパク質を探索できます。
U1 snRNPの5'スプライス部位への結合は、スプライシング忠実度の重要なメディエーターです20。5'スプライス部位の変異は重要であり、U1 snRNPペアリングの喪失を引き起こし、スプライシング欠陥をもたらします2。たとえば、嚢胞性線維症は、CFTR遺伝子21の変異した5'スプライス部位によって引き起こされます。Wongら22 は、U1 snRNAの相補的変異で5'スプライス部位変異を補償する方法を説明しています。このアプローチは、エクソンの封入を促進し、成熟したRNAを生成し、スプライシング欠陥からの救済に成功します。これらの疾患に対する可能なRNAベースの治療法を提供することに加えて、このアプローチは、プレmRNAにおける個々の調節配列の分析にも有用であり得る23。
スプライス部位へのU1 snRNA会合の忠実度は、van der Feltz24によって酵母モデルシステムでも調査されています。出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae は、スプライシング速度論とスプライセオソームアセンブリを調査するために広く使用されています25。スプライシング速度論とスプライセオソーム組成は真核生物でよく保存されており、酵母は集合中の中間複合体の形成を監視するために広く使用されてきました26。ACT1-CUP1レポーターアッセイは、最適なスプライス部位配列を持つ1つのイントロンを含むACT1と、銅キレート剤を発現するCUP1の遺伝子のペアの発現に基づいており、この金属イオンによって引き起こされる損傷から細胞を保護します。CUP1は、ACT1が正しくスプライシングされている場合にのみ表現されるため、レポーターシステム27が作成されます。異なる銅濃度の条件下での細胞増殖を監視して、異なるイントロン配列のスプライシング効率に対処したり、異なる調節タンパク質を使用したりすることができます。van der Feltz24 は、このレポーターシステムと銅生存率アッセイを使用して、スプライシング調節タンパク質の効果を分析する方法を提示しています。同様のアプローチを使用して、酵母のスプライシングの成功に対処するために、異なるタンパク質と組み合わせてイントロン配列のバリエーションを設計できます。
snRNP会合に加えて、タンパク質の結合はスプライセオソームアセンブリ中に不可欠です1。スプライセオソーム活性の制御は、そのタンパク質組成とその形成中に発生する相互作用に直接依存します。タンパク質成分の構造的および機能的特徴は、複合体を活性化するために重要です5,7。Carvalhoら28は、グリセロール勾配分析で不可逆的なタンパク質架橋に依存するGrafix法に基づくアプローチを使用しています。この分析は、タンパク質の組成と、活性複合体の組み立てとスプライシングの成功に重要となる、組み立て中に発生する一過性の相互作用に対処します。このアプローチによる他の動的高分子複合体の分析は非常に有用であり、タンパク質の組織化と相互作用に関する洞察を提供します。
スプライシングの化学的性質と速度は、異なるスプライセオソーム成分の動的結合によっても影響を受けます8。最近、低分子スプライシング阻害剤の使用により、スプライシング反応の速度が低下するため、特定のステップがin vitroで停止する可能性があることが明らかになりました29,30。Basei et al.31 は、スプライシング調節因子 Nek4 の影響に対する選択的スプライシングを分析する方法を提示しています。ミニ遺伝子を使用して、HEK293細胞における腫瘍促進または抗腫瘍表現型につながる転写アイソフォームの有病率が取り上げられています。スプライシングの誤った調節やスプライス部位の異なる使用法は、代替転写産物の生成につながり、さまざまな種類の癌を引き起こす可能性があります16。治療中にスプライシングモジュレーターまたは阻害剤を使用すると、スプライス部位の選択が決定され、プロ腫瘍または抗腫瘍のいずれにかかわらず、生成される代替アイソフォームが定義されます。パクリタキセルとシスプラチンは現在、化学療法剤として使用されています。E1Aミニ遺伝子を使用すると、選択的スプライシングにおけるこれらの薬剤の効果が取り上げられます。ミニジーンを使用した選択的スプライシング解析は、治療および特定の薬物の使用に対するトランス作用タンパク質およびスプライシング変化の影響を監視するための重要な戦略です。
この系統では、多くのイントロンマイクロRNA(miRNA)が腫瘍表現型に関連していることが報告されています32,33。イントロンmiRNA合成と生合成の制御と調節は、スプライシング反応の制御と関連している可能性があります。miRNAは、細胞内のmRNAの安定性と有病率を調節し、RNAの安定性と翻訳速度に影響を与える可能性があります34。Gatti da Silva と Coltri35 は、イントロン miRNA の生合成と成熟を評価するためのレポーター システムについて説明しており、これは細胞表現型の変化と腫瘍促進または抗腫瘍特性の決定に直接関連している可能性があります。スプライシング調節タンパク質HuRの調節により、このシステムはイントロン発癌性miRNAの生合成と機能活性の分析を可能にします。
プレRNAスプライシングの分析と特定の細胞におけるさまざまなRNAの成熟は、ゲノム情報を理解し解釈するために不可欠です。酵母と哺乳類のスプライセオソームは保存されており、基礎研究により、治療薬や生物医学に適用されるさまざまな方法の使用を改善することができます。現在利用可能な大量のゲノムデータにもかかわらず、表現型におけるこの情報の発現は細胞特異的であり、RNAプロセシングとスプライシングに依存している可能性があります。このプロセスの複雑な制御を理解することは、将来の研究に不可欠です。