オープントップ臓器チップ上でのヒト上皮組織の細胞構造と機能の再構成

Summary

本プロトコルは、初代組織(皮膚、肺胞、気道、および腸)の全層臓器チップ培養の確立と成熟を成功させるためのOpen-Top Organ-Chipの機能と本質的な培養モダリティを説明し、ヒトの上皮/間葉系および血管ニッチ界面のさまざまな機能的側面をin vitroで調査する機会を提供します。

Abstract

ほぼすべての人間の臓器は上皮組織で裏打ちされており、3次元(3D)構造に編成された緊密に接続された細胞の1つまたは複数の層で構成されています。上皮の主な機能の1つは、下線組織を物理的および化学的傷害および感染性病原体から保護する障壁の形成である。さらに、上皮は栄養素、ホルモン、およびその他のシグナル伝達分子の輸送を媒介し、多くの場合、臓器内の細胞の位置決めと区画化を導く生化学的勾配を作成します。上皮は、臓器の構造と機能を決定する上で中心的な役割を果たすため、動物モデルでは必ずしも捕捉されない多くのヒト疾患の重要な治療標的です。明らかな種間の違いに加えて、動物の上皮のバリア機能と輸送特性に関する調査研究を行うことは、生体系でこれらの組織にアクセスすることの難しさによってさらに悪化します。二次元(2D)ヒト細胞培養は、基本的な科学的質問に答えるのに役立ちますが、 in vivo での予測が不十分であることがよくあります。これらの制限を克服するために、過去10年間で、臓器チップとして知られる多数のマイクロエンジニアリングされた生体模倣プラットフォームが、従来の in vitro および動物実験の有望な代替手段として浮上しました。ここでは、皮膚、肺、腸などの臓器特異的な上皮組織をモデル化するために設計されたプラットフォームであるオープントップ臓器チップ(またはオープントップチップ)について説明します。このチップは、機械的に活性なシステム内に組織特異的な線維芽細胞と内皮細胞を組み込むことによって3D間質成分を再現する機能を含む、上皮組織の多細胞構造と機能を再構成するための新しい機会を提供します。このOpen-Top Chipは、単一細胞から多層組織構築物まで、複数の解像度スケールで上皮/間葉系および血管の相互作用を研究するための前例のないツールを提供し、健康と疾患における上皮化臓器の細胞間クロストークの分子解剖を可能にします。

Introduction

歴史的に、科学者は創薬のために前臨床動物実験に依存してきましたが、人間の転帰との相関性が低いため、これらの方法の多くが疑問視されてきました¹。動物実験を置き換え、削減し、改良するための「3R」原則の実施は、科学者に前臨床薬物および化学毒物学のリスク評価をサポートするための新しいin vitro代替方法を見つけることを促します²。しかし、これまでに開発された多くのin vitroモデルは、人間の生体器官の動的な性質を再現するために必要な生物学的構造、細胞の複雑さ、および機械的環境を欠いています^3,4。

従来のin vitro前臨床システムでは、通常、硬質プラスチック表面上で増殖したヒト細胞の2D単培養が使用されます。これらの方法は、簡単な機構研究を行うためのツールを提供し、医薬品候補の迅速なスクリーニングを可能にします。2Dモデルは比較的低コストで堅牢性が高いため、自動ハイスループットシステムと組み合わされることが多く、医薬品開発プロセスの初期段階で潜在的な医薬品候補を迅速に特定するために使用されます^5,6。しかし、このような2Dモデルは、治療薬候補に対する組織レベル、臓器レベル、または全身反応をモデル化するためのトランスレーショナルアプローチを提供しておらず、開発の前臨床段階での医薬品の安全性と有効性を正確に予測する必要があります。フラットセル培養では、複雑な多細胞相互作用、生体力学的特性、ヒト組織の3次元(3D)構造など、天然の組織の微小環境を再現することはできません⁷。平坦な表面上で増殖する細胞は、成熟した表現型を獲得しないことが多く、したがって、天然組織の場合のように薬理学的刺激に応答することができません。例えば、in vitroで増殖した初代ヒト肺胞上皮細胞は、扁平上皮表現型を示し、サーファクタントタンパク質CおよびB(SP-CおよびSP-B⁾⁸を含む重要な表現型マーカーを失います。不十分な分化に加えて、初代細胞は、組織の炎症に関連する特定の生化学的経路が機能しなくなるため、in vitroで生物学的ストレッサーに対して鈍感になることがよくあります⁹。このような細胞機能の喪失は、主に硬い基質の使用と、肺線維芽細胞や平滑筋細胞などの組織特異的間質細胞によって自然に放出される可溶性因子の欠如に関連しているようです^10,11。

化学的物理的および生物学的複雑さの欠如がin vitroでの細胞の生理学的挙動を制限することを理解することで、より洗練された多細胞モデルの開発が促進され、体外のヒト組織の複雑さをよりよく捉えることが証明されています^12,13。1970年代初頭に最初の共培養モデルが作成されて以来¹⁴、合成および天然のヒドロゲルの導入により、天然の組織微小環境を模倣する能力が大幅に向上し、細胞分化を促進し、細胞の自己組織化を組織様構造に導き、天然の組織機能を回復するための貴重なツールになりました^15,16.例えば、適切な3D足場で増殖させると、ヒト細胞はスフェロイドやオルガノイドなどの機能的な構造に自己配列し、幹細胞マーカーを発現し、自己複製することができます¹⁷。対照的に、ヒト細胞(幹細胞を含む)は、従来の2D基質上で増殖すると、急速に老化し、数回継代した後に老化を受ける¹⁸。さらに、ヒドロゲルは、多孔性、孔径、繊維の太さ、粘弾性、トポグラフィー、剛性などの特定の組織特性に合わせて「調整」することも、組織由来の細胞成分および/または生理活性分子でさらに操作して、生理学的または病理学的状態のエミュレーションを可能にすることもできます^19,20.医薬品研究で使用される3Dヒドロゲルベースのモデルは、薬物試験の大きな可能性を秘めているにもかかわらず、in vivo組織の複雑な細胞構造を完全に再現しておらず、静水圧、周期的伸張、流体せん断など、人体に通常存在する重要な血行動態および機械的刺激を欠いています²¹。

臓器チップ(OOC)などの微小生理学的システム(MPS)は、インビトロで複雑な生理学的応答をキャプチャできるツールとして最近登場しました^22,23。これらのモデルは、多くの場合、生体の動的な微小環境のモデリングを可能にするマイクロ流体プラットフォームの使用を採用しています。

3D組織バイオエンジニアリングとメカノバイオロジーの原理を組み合わせて、複雑なヒト上皮組織のオープントップチップモデルを作成しました。これにより、上皮組織の多細胞で動的な微小環境を詳細に再現することができました。これには、生体器官に自然に存在するが、従来のin vitroモデルでは無視されることが多い組織特異的な生化学的および生体力学的手がかりが含まれます²⁴。Open-Top Chipには、多孔質膜で区切られた血管コンパートメント(図1A)と間質コンパートメント(図1B)の2つのコンパートメントが組み込まれており、2つのチャンバー間で栄養素を拡散させることができます(図1C)。血管コンパートメントは、生理学的せん断応力を再現するために連続的な流体の流れにさらされ、間質チャンバーの伸縮性のある設計により、呼吸運動または腸の蠕動運動に関連する機械的ひずみのモデリングが可能になります。間質コンパートメントには、組織特異的線維芽細胞の生理学的成長をサポートするように設計された調整可能な3Dヒドロゲル足場が収容されています。これは、空気 - 液体界面の確立を容易にする取り外し可能な蓋を有し、粘膜組織のヒト生理機能のより大きなエミュレーションを可能にする条件、ならびに上皮層に直接薬物を投与するための組織への直接アクセスを可能にする。補足図1は、寸法や生物学的コンパートメント(補足図1A-D)を含むオープントップチップ設計の主要コンポーネントのいくつかと、このプロトコルで説明されている主な技術的ステップ(補足図1E)を示しています。

オープントップチップの灌流は、プログラム可能な蠕動ポンプで実現されます(図1D)。ペリスタルティックポンプのセットアップにより、12個のオープントップチップを同時に灌流できます。ほとんどのインキュベーターは、インキュベーターあたり最大24チップの培養を可能にする2つのセットアップを収容できます。機械的延伸は、カスタムメイドのプログラム可能な真空圧力調整器を使用して実現されます(図1E)。これは、デジタル-アナログコンバータによって電子的に制御される電空真空レギュレータで構成されています。言い換えれば、電空真空レギュレータは、ユーザーが決定する振幅と周波数を持つ正弦波真空プロファイルを生成します。0%から15%の範囲の周期ひずみは、0〜-90kPaの範囲の振幅と0.2Hzの周波数でオープントップチップの真空チャネルに負圧を加えることによって生成されます。これは、以前に採用され、他の論文²⁵に記載されている市販のFlexcellひずみユニットと同等のカスタムメイドのシステムです。例えば、肺の呼吸運動や腸の蠕動運動に関連する機械的組織変形を模倣するために、空気圧アクチュエータは正弦波真空/ひずみ波を適用し、その大きさと振幅は、ヒト細胞が本来の組織で経験する歪みと周波数の生理学的レベルに一致するように調整できます。

ここでは、プロトタイプのOpen-Top Chipプラットフォーム上で有機型上皮等価物をエンジニアリングおよび培養するための効率的で再現性のある方法について説明します。これにより、血管液の流れと機械的伸張を統合しながら、皮膚、肺胞、気道、結腸などの複雑な臓器モデルを生成できます。複雑な上皮モデルを生成するための組織工学の原理を実装する際に考慮しなければならない重要な技術的側面を概説します。現在の設計の利点と考えられる制限について説明します。

流れとストレッチのパラメーターを含む、組織と臓器の成熟を達成するために使用される主なステップの概要は、皮膚の場合の図2、肺胞の場合の図3、気道の場合の図4、および腸の場合の 図5で報告されています。 異なる臓器モデルの培養に使用される培地組成および試薬に関する追加情報は、補足表に含まれています(皮膚については補足表1;肺胞の補足表2;気道については附則表3、腸については附則表4)。

Protocol

ヒトコロノイドは、シンシナティ小児病院の施設バイオセーフティ委員会(IBC 2017-2011)のガイドラインに従って腸切除から取得されました。

1.表面活性化

1. 活性化バッファーの調製
   1. 架橋剤と溶媒緩衝試薬をバイオセーフティキャビネット(BSC)の下に置き、室温(RT)で10分間平衡化してから使用してください。
   2. 架橋剤溶液を直接光曝露から保護するために、滅菌非透光性容器またはアルミニウム箔で包まれた透明な15 mLコニカルチューブを使用して、5 mLの溶媒バッファー中で5 mgの架橋剤を再構成します。
   3. 溶液を1分間ボルテックスしてすべての凝集塊を除去した後、50 μLの架橋剤溶液をチップのボトムチャネルに直接ピペットで入れ、150 μLをオープントップチャンバーにピペットで入れます。
   4. アスピレーターを使用して、チップの表面から余分な架橋溶液を取り除きます。次に、追加の50 μLの架橋溶液をチップの底部チャネルに直接ピペットで送り、150 μLをオープントップチャンバーにピペットで入れて、残っている気泡を取り除きます。
2. UV架橋機による活性化
   1. BSCの下のチップから蓋をそっと取り外し、滅菌容器に保管します。
   2. 架橋剤溶液を含むチップをペトリ皿に移し、汚染を避けるためにペトリ皿を閉じて、チップの入った皿をUV架橋機の下に置きます。
      注意: ペトリ皿の蓋を取り外して、UV露出を最大化します。
   3. ピーク波長365nmのUV架橋機を100μJ/^cm2の強度にセットし、UV光を20分間オンにします。
      注:20分間のUV処理後、架橋剤溶液はより暗く(茶色)に見えます。
   4. チップをBSCの下に戻し、酸化された架橋剤溶液を吸引します。次に、すべてのチップを溶媒バッファーで3回すすぎ、チップをBSC下で5〜10分間乾燥させて、ポリジメチルシロキサン(PDMS)表面の化学官能基化を完了します。

2.間質等価物の準備

1. 10x再構成バッファー(100 mL)の調製
   1. 2.2 gの重炭酸ナトリウムを75 mLの0.067 M NaOHに二重蒸留水に溶解します。
   2. 4.76 gのHEPESを追加し、二重蒸留水を使用して容量を100 mLにします。
   3. 0.22 μmメンブレンを備えた使い捨て滅菌ボトルトップフィルターを使用して、BSC下の溶液を滅菌ろ過します。
      注:この溶液は、4°Cで保存した場合、約6か月間安定です。
2. プレゲル溶液量の推定
   1. 実験に必要なチップ数に150 μL(中央のオープントップチャンバーの内容積)を掛けて、実験に必要なプレゲル溶液の量を推定します。
      必要量=(チップ数×150)μL
   2. 選択した細胞を含む1容量の10x EMEM、1容量の10x再構成バッファー(ステップ2.1を参照)、8容量のコラーゲンI溶液(10 mg / mL)、およびコラーゲンI1 mgあたり1 μLの1 N NaOH溶液を混合して、氷上でコラーゲンプレゲル溶液を調製します。
      注:実験エラーを考慮して、追加の+ 15%ボリュームを準備することをお勧めします。セクション2.2で説明した例は、12個のチップと追加の15%容量に十分なプレゲル溶液を調製するための詳細なステップバイステップの手順を提供します。
3. 間質当量のプレゲル溶液の調製(12チップ用)
   1. 氷上のBSCの下に次のソリューションをもたらします:10x EMEM;10x再構成バッファ(ステップ2.1を参照)。コラーゲンI溶液(10 mg / mL);滅菌1 N NaOH溶液。
   2. プロバイダーの指示に従って組織特異的間葉系細胞を80%〜90%コンフルエントになるまで培養し、次に細胞プロバイダーが推奨するトリプシンまたはその他の方法を使用して細胞を解離します。250 x g で24°Cで5分間遠心分離することにより、細胞をペレットに回収します。
   3. 細胞ペレットを225 μLの氷冷10x EMEMに再懸濁し、225 μLの氷冷10x再構成バッファーを追加します(ステップ2.1を参照)。上下に静かにピペッティングして溶液を混合し、氷冷コラーゲンI溶液1,800 μLを加えます。
   4. 氷上でプレゲル溶液を混合するために気泡を避けて、5〜6回ピペットで上下させます。
4. 間質等価チップの組み込み(12チップ用)
   1. プレゲル溶液を18 μLの1 N NaOHで中和します。5〜6回上下にピペッティングして穏やかに混合し、気泡を避けて150μLの細胞含有ヒドロゲルをオープントップチップの中央チャンバーにピペットで入れます。
      注意: マイクロパターニングが必要な場合は、次の手順(セクション3)に進んでください。
   2. 各ペトリ皿に2 mLの滅菌ddH₂Oを充填した遠沈管キャップを含む、チップを別々のペトリ皿にグループ化し、インキュベーター内で37°C、5%_CO2でペトリ皿をインキュベートします。
      注:90分後、細胞を含んだヒドロゲルは完全に重合します。

3. 表面マイクロパターニング(オプション)

1. 3Dプリントされたスタンプを使用して、中和コラーゲンヒドロゲル(まだ液体状態)をピペッティングした後、間質ヒドロゲルの表面マイクロパターニングを実行します。
   注:3Dプリントされたスタンプは、前述の^{他の場所24}のように、さまざまなカスタマイズ可能なデザインで入手できます。
2. 中和コラーゲンIプレゲル溶液20 μLを滅菌3Dプリントスタンプのパターン表面にピペットで固定し、間質ヒドロゲルが液体のままでオープントップチャンバーの内側(上部)にスタンプを挿入します。
3. アスピレーター(またはピペット)を使用して、オープントップチャンバーの上部からこぼれる可能性のあるヒドロゲルの残留物を取り除きます。すべてのチップを別々のペトリ皿にグループ化し、各ペトリ皿に2 mLの滅菌ddH₂Oを充填した遠心分離機15 mLコニカルチューブキャップを含めます。
4. すべてのペトリ皿を37°C、5%CO₂ で90分間インキュベートしてから、チップをBSCの下に戻し、精密ピンセットを使用してスタンプをそっと取り除き、ヒドロゲルを損傷するリスクを減らします。

4.上皮および血管表面を組織特異的ECMタンパク質でコーティングする

1. 血管マイクロ流体チャンバーを細胞外マトリックスタンパク質でコーティングする
   1. 実験に必要なチップ数に20 μL(血管チャネルの体積)を掛けて、実験に必要な血管ECMコーティング溶液の体積を推定します。
      必要量=(チップ数×20)μL
      注意: 実験エラーを考慮して、追加の15%ボリュームを準備することをお勧めします。
   2. 氷冷PBSまたはHBSSを使用して、すべてのチップ用の血管ECMコーティング溶液を調製します(たとえば、12チップあたり300 μL)。
      注意: 補足資料セクションの特定の臓器プロトコル表を参照してください(皮膚については補足表1 ;肺胞の 補足表2 ;気道については補足 表2 、および腸については 補足表4 )を特定して、特定の試薬および推奨されるECM組成物を同定した。
   3. 20 μLの血管ECMコーティング溶液を各チップの血管チャネルにピペットで入れます。
2. 間質等価物の頂端表面を細胞外マトリックスタンパク質でコーティングする
   1. 実験に必要なチップ数に50 μL(血管チャネルの体積)を掛けて、実験に必要な上皮ECMコーティング溶液の体積を推定します。
      必要量=(チップ数×50)μL
      注:実験エラーを考慮して、追加の15%ボリュームを準備することをお勧めします。
   2. 氷冷PBSまたはHBSSですべてのチップに十分なECMコーティング溶液(たとえば、12チップあたり750 μL)を調製し、50 μLの上皮ECMコーティング溶液をヒドロゲル表面の上に直接移します。
      注意: 補足資料セクションの特定の臓器プロトコル表を参照してください(皮膚については補足表1 ;肺胞の 補足表2 ;気道については補足 表2 、および腸については 補足表4 )を特定して、特定の試薬および推奨されるECM組成物を同定した。
   3. 各ペトリ皿に2 mLの滅菌ddH₂Oを充填した遠心分離機15 mLコニカルチューブキャップを含む別々のペトリ皿にチップをグループ化し、上皮細胞の播種を進める前に、37°C、5%_CO2 のインキュベーター内でペトリ皿を2時間インキュベートします。

5.間質等価物に上皮細胞を播種する

1. 上皮細胞培養
   1. 組織特異的上皮細胞を80%〜90%コンフルエントになるまで提供者の指示に従って培養する。
   2. 細胞提供者が推奨するタンパク質分解酵素手順を使用して細胞を解離します。
      注:最良の結果を得るには、上皮細胞が70%〜90%のコンフルエントに達する活発な成長期に、低継代(P1-P2)で上皮細胞を採取します。
   3. 解離したら、細胞を遠心分離し、ペレットとして収集します。
   4. 特定の臓器プロトコル表に示されているように、上皮細胞を適切な細胞/フラグメント密度に再懸濁します。.
      注:この研究では、細胞溶液は、皮膚に3 x 10 6細胞/ mL、肺胞に1 x 10 6細胞/ mL、気道に6 x 10 6細胞/ mL、腸に8 x 10 ⁶フラグメント/ mLの密度で使用されました。
2. 上皮細胞播種
   1. チップをインキュベーターからBSCに移します。血管チャネルからコーティング溶液を吸引し、血管マイクロ流体チャネルを50μLの新鮮な内皮細胞培養培地で3回リンスする。
   2. ヒドロゲル表面からコーティング溶液を吸引し、間質表面を100 μLの新鮮な上皮細胞培養培地で3回すすぎ、余分なコーティング溶液を除去します。
   3. 上昇培地を吸引し、補足表に示されているように、適切な細胞密度を使用して50 μLの上皮細胞懸濁液をヒドロゲル表面に播種し、チップをインキュベーターに2時間(またはコロノイドの場合は一晩)戻します。
   4. ヒドロゲル表面を細胞培養培地で2回穏やかにすすぎ、細胞の破片を取り除きます。最後に、密閉されたオートクレーブ可能な容器でオートクレーブして培地をリフレッシュし、チップをペリスタルティックポンプに接続します。

6.チップをフローに接続する

1. 流体部品の準備
   1. 2インチの生体適合性ポリプロピレンベースの熱可塑性エラストマー(TPE)トランスファーチューブ(材料表)を切断して、チップをメディアリザーバーに接続するために必要な短いマイクロ流体チューブを準備します。
   2. 7.5インチの生体適合性TPEトランスファーチューブを切断して、長いマイクロ流体チューブを製造します。
   3. 十分な18Gおよび19Gの金属コネクタを準備します(材料表)。
      注意: オープントップチップをペリスタルティックポンプに接続する少なくとも1日前に、手順6.1.1および6.1.2で説明されているチューブとコネクタを準備して滅菌することをお勧めします。
   4. 各培地リザーバーの蓋を4インチの皮下注射針で突き刺します(材料表)。
2. 中程度の脱気
   1. 細胞培養培地を室温(RT)まで平衡化させます。
   2. 必要な量の培地を円錐形のろ過管に移します。
   3. -20 PSIの負真空圧力を適用して、媒体を脱気します(真空駆動ろ過)。
      注:真空が利用できない場合は、細胞培養培地をインキュベーター内で一晩平衡化させて、同様の結果を得ることができます。
3. 流体の流れのためにオープントップチップを準備する
   1. チップと滅菌流体部品をBSCの下に持ってきて、流体の流れを開始する前に、オープントップチップの蓋(上部)を合わせてオープントップチップのプロトタイプを密閉します。
   2. 脱気した細胞培養培地200 μL(臓器固有の表を参照)を、気泡を避けるように注意しながら、チップの上部チャネルと下部チャネルの両方の入口ポートにピペットで入れます。
   3. 300 μLの培養液を短いマイクロ流体チューブにピペットで入れてチューブの内面をプライミングし、短いチューブをチップの上部チャネルと下部チャネルの入口に接続します。
4. マイクロ流体表面の接続とプライミング
   1. 培地リザーバーをファームラックに配置し、皮下注射針をチップの下部入口に接続し、最後に、インキュベーター内のハウジングキャリアにすべてのチップを収容します。
   2. チップをペリスタルティックポンプに接続し、すべてのコネクタを検査して、すべてのチップが正しく接続され、細胞培養培地の目に見える漏れがないことを確認します。
   3. ポンプの パージ ボタンを使用して、約15秒間、または細胞培養培地の液滴が流出チューブの端に現れるまで保持します。
   4. ポンプの制御システムを使用して、適切な臓器チップ流量を設定します(図2、図3、図4、および図5)。

7.チップのメンテナンス

1. 臓器チップのメンテナンス
   1. 上皮および/または内皮用の新鮮な細胞培養培地を準備し、脱気ステップを実行します(ステップ6.2で前述)。
   2. ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップをポンプから慎重に外し、チップハウジングキャリアを引き出します。チップをインキュベーターからBSCに移し、リザーバーに残っている大量の培地を取り除きます。
   3. 細胞培養培地を上部と下部の入口リザーバーに5 mLの新しい細胞培養培地と交換し、チップハウジングキャリアをインキュベーターに戻します。チップを蠕動ポンプに接続し、流れを再開します。
      注意: パージ 機能を使用して、媒体を血管コンパートメントにすばやくリフレッシュし、気泡のリスクを減らすことをお勧めします。
   4. 図2、図3、図4、および図5に従って、手順7.1.1〜7.1.3を1日おきに繰り返します。
2. 気液界面(ALI)の確立
   1. ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップをポンプから慎重に外し、チップハウジングキャリアを引き出します。チップをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移し、上部のリザーバーに残っている培地の量を取り除きます。
   2. 上部のマイクロ流体チャネルからすべての媒体を穏やかに吸引し、バインダークリップを使用して上部の入口に接続された短いマイクロ流体チューブをクランプして、媒体の蒸発とALIの維持を減らします。
   3. オープントップチップをハウジングキャリアに戻し、インキュベーターに戻し、チップをペリスタルティックポンプに再接続します。
      注意: パージ 機能を使用して、媒体を血管コンパートメントにすばやくリフレッシュし、気泡のリスクを減らすことをお勧めします。
   4. 蠕動ポンプを始動して流れを再開します。
3. ストレッチ(オプション)
   1. ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップごとに2本の長いマイクロ流体チューブを使用して、チップの真空ポートを真空モジュールに接続します。
   2. 真空モジュールを使用して、臓器プロトコルテーブル内で指定されている各臓器に推奨される条件にストレッチ設定を調整します:皮膚の 補足表1 。肺胞の 補足表2 ;気道の 補足表2 ;腸についての 補足表4 。
   3. チューブの接続を目視検査して、すべてのチップが正しく接続されており、中程度の滴りの目に見える液滴がないことを確認します。
   4. 蠕動ポンプを始動して流れを再開します。

8.血管コンパートメントに内皮細胞を播種する

1. 血管細胞播種用の細胞とチップを準備する
   1. 組織特異的内皮細胞を、提供者の指示に従って、80%〜90%コンフルエントになるまで培養する。タンパク質分解酵素手順(プロバイダーが推奨)を使用して細胞を解離し、最後に内皮細胞を3 x 10⁶ 細胞/ mLの溶液に再懸濁します。
      注:最良の結果を得るには、内皮細胞が2%〜4%のコンフルエントに達する活発な成長期に、低継代(P70-P90)で内皮細胞を収穫します。
   2. 蠕動ポンプを一時停止します。チップをインキュベーターからBSCに移し、チップをメディアリザーバーと接続されているチューブから外してから、チップを別々のペトリ皿にグループ化します。
   3. 上皮区画の細胞培養培地を新鮮な上皮細胞培養培地でリフレッシュする。新鮮な内皮細胞培養培地で血管チャネルを2回すすぎ、次いで血管コンパートメントから培地を吸引する。
2. 内皮細胞播種
   1. 底部(血管)チャネルに25 μLの内皮細胞懸濁液(3 x 10⁶ 細胞/mL)を播種し、チップを逆さまにして内皮細胞をマイクロ流体チャンバーの上面に付着させます。
      注:チップあたり50 μLの細胞懸濁液を追加します(12チップあたり600 μL)。
   2. チップをペトリ皿にグループ化します。それらを37°C、5%_CO2 のインキュベーターに戻し、内皮細胞を1時間付着させます。
   3. 1時間後、チップをインキュベーターからBSCに移します。血管チャネルを内皮細胞培養培地で2回すすぎ、細胞残骸を除去する。
   4. 手順8.2.1〜8.2.2を繰り返して、血管チャネルに内皮細胞をもう一度播種し、チップを平らに置いて、血管チャネルの底面への内皮細胞の接着を促進します。
3. チップをフローに再接続します
   1. BSCの下で脱気された血管細胞培養培地で血管培地リザーバーを満たします。
   2. チップをチップハウジングキャリア内に戻し、チップを一方の端の媒体リザーバーに再接続し、もう一方の端のペリスタルティックポンプに再接続します。
      注意: パージ 機能を使用して、媒体を血管コンパートメントにすばやくリフレッシュし、気泡のリスクを減らすことをお勧めします。
   3. マイクロ流体接続を目視検査して、すべてのチップが正しく接続されており、媒体の滴りの目に見える液滴がないことを確認します。次に、蠕動ポンプを始動して流体の流れを再開します。

9. 一般的なエンドポイントアッセイ

1. エンドポイントアッセイ用のチップの切断
   1. ペリスタルティックポンプを一時停止し、チップをポンプから慎重に外し、チップハウジングキャリアを引き出します。チップハウジングキャリアをインキュベーターからBSCに移し、チップを解放します。
   2. Open-Top Chipの中央チャンバーを上皮細胞培養培地で、血管チャネルを内皮培養培地で2回穏やかに洗浄し、細胞の破片を取り除きます。
   3. オープントップチップの蓋を取り外し、ピンセットを使用してチップの頂端コンパートメントにアクセスします。
2. 蛍光顕微鏡のための免疫染色
   1. 従来のサンプルの固定、透過処理、ブロッキングを進めます。
      注:この研究では、サンプルを200 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で1時間固定した後、PBSですすぎ、0.1%Triton X-100で40分間透過処理し、1%ウシ血清アルブミンで1時間ブロッキングしました。
   2. チップを一次抗体(材料表)とともに4°Cで一晩インキュベートします。次に、チップの上皮コンパートメントと内皮コンパートメントの両方を200μLのPBSで2回洗浄します。その後、適切な二次抗体を2時間進めます。
      注:一次抗体と二次抗体をPBS + 1%BSAで1:100(一次抗体)および1:200(二次抗体)の希釈で希釈します。
3. 免疫組織化学
   1. ピンセットを使用してOpen-Top Chipのメインチャンバーからストロマ等価物を抽出し、10%中性緩衝ホルマリンで満たされた1.5 mLチューブに集め、少なくとも24時間インキュベートします。
   2. 固定ストローマ相当物をティッシュプロセッサーに移し、以下の手順に従って最適なサンプル脱水を実現します。
      1. ヒドロゲルを70%エタノールに90分間浸します。
      2. 70%エタノールを除去し、ヒドロゲルを80%エタノールに90分間沈めます。
      3. 80%エタノールを除去し、ヒドロゲルを95%エタノールに90分間沈めます。
      4. 95%エタノールを除去し、ヒドロゲルを100%エタノールに90分間2回沈めます。
      5. 100%エタノールを除去し、ヒドロゲルをキシレン溶液に120分間2回沈めます。
      6. キシレン溶液を除去し、処理した間質当量をパラフィンワックスに120分(~2時間)2回浸透させます。
   3. 浸潤した間質等価物をセクショニングパラフィンブロックに埋め込みます。
   4. この時点で、間質等価物をミクロトームを用いてパラフィンブロックとして切片化し、従来の組織学的手法に従って処理することができる²⁶。

Results

表面マイクロパターニング
細胞外マトリックス(ECM)のマイクロパターニングは、腸陰窩界面の空間的構成を複製するために使用することができる。Open-Top Chipの構成を変更して、結腸上皮-間質界面の自然なトポグラフィー(図6A、B)とマイクロメートルスケールの腸陰窩(図6C-E)を模倣するように特別に設計されたマイクロパターンスタンプを統合することができます。皮膚、気道、肺胞のモデルには平らな(パターン化されていない)表面を使用したことに注意してください。このスタンプをこの際に用いて、種子上皮細胞に対して均一なヒドロゲル表面を得た。私たちは、腸の陰窩を模倣した正と負のドームの交互からなる、人間の腸粘膜の自然な構造を模倣できるデザインを選択しました。

臓器モデル
Open-Top ...

Discussion

Open-Top Chipは、制御された微小環境において内皮、間質、上皮の間で発生する複雑な細胞相互作用をリアルタイムで調査するためのプラットフォームです。この技術は、流体せん断(流れ)、周期的伸張、マイクロパターニングによって達成される上皮表面トポグラフィの再構築など、ヒト組織の微小環境の再構成に関連する物理的および生化学的手がかりの統合など、従来の有機型およびオルガノイド培養 に比べて 重要な利点を提供します。このプラットフォーム内で増殖するヒト細胞は相乗効果を発揮して、免疫組織化学や上部および/または下部コンパートメントからの流出液(または排水)を使用した生化学的アッセイなど、従来の手法 で 分析できる組織特異的機能を再現します。現在の設計では、細胞が組織特異的線維芽細胞や他の間質細胞と直接接触して増殖する上皮層に容易にアクセスでき、上皮組織の多細胞構造を模倣しています。特に、Open-Top Chipプロトタイプは、他のオルガンオンチッププラットフォームの使用に関連する一般的な課題に対する実行可能なソリューションを提供します。間質コンパートメント内にいくつかの異なる細胞タイプを組み込むことがで...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10倍エメム	ロンザ	12-684F	ミディアム;Stroma
18ゲージニードル		MicroGroup316H18RW	チューブステンレス鋼316溶接、18RWフルハード
19ゲージニードル		MicroGroup316H19RW	チューブステンレス鋼316溶接、19RWフルハード
2ストップPharMed BPT	コール・パーマー	EW-95723-12	チューブ、0.25 mm、12個入り
70%エタノールおよびワイプ	-	-	表面滅菌用
8-ブロモアデノシン 3′,5′-環状一リン酸ナトリウム塩 (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Medium supplement
A-83-01	トクリス	2939
アデニン	シグマ	A9795
アドバンスド DMEM/F12	サーモ	12634010
気道上皮細胞ライフ	ラインセル	テクノロジーFC-0016
アルミホイル	-	-	-
肺胞細胞	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	アブカム	ab24751	マウスモノクローナル抗体 [3C9]
抗アクアポリン5 Alexa Fluor 647	アブカム	ab215225	ウサギモノクローナル抗体 [EPR3747]
抗アクアポリン5	アブカム	ab92320	ウサギモノクローナル抗体 [EPR3747]
抗ベータIVチューブリン	アブカム	ab11315	マウスモノクローナル抗体 [ONS.1A6]
抗CD31(PECAM-1)	アブカム	ab9498	マウスモノクローナル[JC/70A]抗体
アンチCK5	アブカム	ab75869	ウサギ組換えモノクローナル [AY1E6]
抗サイトケラチン10	サーモフィッシャー	MA5-13705	マウスモノクローナル抗体 (DE-K10)
抗サイトケラチン14	アブカム	AB7800	マウスモノクローナル抗体
アンチE-カドヘリン	アブカム	ab1416	マウスモノクローナル抗体
抗フィラグリン	サーモフィッシャー	PA5-79267	ウサギポリクローナル抗体
アンチHTI-56	テラス・バイオテック	TB-29AHT1-56	マウスモノクローナル抗体(IgG1)
アンチHTII-280	テラス・バイオテック	TB-27AHT2-280	マウスモノクローナル抗体(IgM)
抗インボルクリン	サーモフィッシャー	MA5-11803	マウスモノクローナル抗体(SY5)
抗アイソフォームTA p63-&α;、-&β;、-&γ;	ビオレンゲント	618902	ウサギポリクローナル抗体
アンチキ67	アブカム	ab8191	マウスモノクローナル抗体 [B126.1]
アンチランプ3	アブカム	ab111090	ウサギポリクローナル抗体
アンチマチュアSP-B	セブンヒル	WRAB-48604	ウサギポリクローナル抗体
アンチMUC5AC	サーモフィッシャー	PA5-34612	ウサギポリクローナル抗体
抗ムチン-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	マウスモノクローナル抗体 (IgG1)
アンチp63	ダコ	GA662	マウスモノクローナル抗体p63タンパク質(Dako Omnis) クローンDAK-p63
アンチPCNA	サーモフィッシャー	PA5-32541	ウサギポリクローナル抗体
抗ポドプラニン(AT-1α)	アブカム	ab128994	ウサギポリクローナル抗体
抗Pro+成熟界面活性剤タンパク質B	アブカム	ab40876	ウサギポリクローナル抗体
界面活性剤C	セブンヒル	WRAB-9337	ウサギポリクローナル抗体
抗子宮グロビン/SCGB1A1	ハイカルト・バイオテック	HM2178	マウスモノクローナル抗体 [AY1E6]
抗VE-カドヘリン	アブカム	ab33168	ウサギポリクローナル抗体
アンチZO-1	サーモフィッシャー	33-9100	マウスモノクローナル抗体 [1A12]
アスコルビン酸	Sigma	A4544
吸引ピペット	コーニング/ファルコン	357558	2mL、ポリスチレン、個包装
吸引のヒント	-	-	滅菌(オートクレーブ滅菌)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution	サーモフィッシャー	37525	ブロッカー剤
塩化カルシウム		Sigma C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Collagen I	Advanced Biomatrix	5133	10 mg/mL (Stroma)
Collagen I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (Vascular ECM)
コラーゲンIV	シグマ	C5533
コラーゲンIV	シグマ	C5533-5MG	ヒト胎盤由来のコラーゲン、5 mg粉末、1 mg / mLに再構成
結腸性線維芽細胞	細胞生物学的製剤	H6231
大腸微小血管内皮細胞	Cell Biologics	H6203
コニカルチューブ	-	-	15 mLおよび50 mL ポリプロピレン、滅菌
架橋剤(ER-1)	エミュレート	10461	5 mg粉末
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、乳酸)	サーモフィッシャー	D3571	DNAプローブ
真皮線維芽細胞	ATCC	PCS-201-010
真皮微小血管内皮細胞	ATCC	CRL-3243
デキサメタゾン	Σ	D4902
DMEM	サーモフィッシャー	11054020
DMEM/F-12	GIBCO
DMEM/F-12、GlutaMAX	GIBCO	〒10565-018	ALI培地用基礎培地
ロバ抗マウスIgG H&L (Alexa Fluor 488)	アブカム	ab150105	ロバ抗マウス二次抗体
ロバ抗マウスIgG H&L(アレクサフロー568)	アブカム	ab175472	ロバ抗マウス二次抗体
ロバ抗マウスIgG H&L (アレクサ フロー 647)	アブカム	ab150107	ロバ抗マウス二次抗体
ロバ抗ウサギIgGハンド&L (Alexa Fluor 488)	アブカム	ab150073	ロバ抗マウス二次抗体
ロバ抗ウサギIgGハンド&L(アレクサフロー568)	アブカム	ab175470	ロバ抗マウス二次抗体
ロバ抗ウサギIgGハンド&L (アレクサ フロー 647)	アブカム	ab150075	ロバ抗マウス二次抗体
ダルベッコs PBS (DPBS-/-) (Ca2+, Mg2+なし)	コーニング	21-031-CV	1倍
上皮成長因子(EGF)ヒト、大腸菌の組換え	PromoCell	C-60170	培地サプリメント
F-12ハムs	Invitrogen	21700-108	血管ECM
FibriColの場合	アドバンスドバイオマトリックス	5133-20ML	I.コラーゲン溶液(10mg/mL)
フィブロネクチン	コーニング	356008
フィブロネクチン、ヒト、ナチュラル、	コーニング	47743-654	ヒト血漿フィブロネクチン
細先端精密ピンセット	アベン	18056USA	Technik Style 5B-SA 精密ステンレス製ピンセット
Glutamax	Invitrogen	21700-108
グルタマックス	インビトロジェン
ヤギ抗マウスIgGハンド&L (Alexa Fluor 594)	アブカム	ab150080	ヤギ抗マウス二次抗体
ヤギ抗マウスIgGハンド&L (アレクサ フロー 647)	アブカム	ab150115	ヤギ抗マウス二次抗体
ヤギ抗マウスIgGハンド&L (FITC)	アブカム	ab6785	ヤギ抗マウス二次抗体
ヤギ抗マウスIgG1 Alexa Fluor 568	サーモフィッシャー	A-21124	ヤギ抗マウスIgG1二次抗体
ヤギ抗マウスIgM Alexa Fluor 488	サーモフィッシャー	A-21042	ヤギ抗マウスIgM二次抗体
ハンドヘルド真空吸引器	コーニング	4930	-
ヒートイン不活化 HyClone FetalClone II セラム (FCS)	GEヘルスケアライフサイエンス	SH30066.03
血球計算盤	-	-	-
豚腸粘膜由来ヘパリンナトリウム塩	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
Human [Leu15] - Gastrin	Sigma	G9145
ヒトコロノイド	臨床		切除から得られた
ヒト EGF 組換えタンパク質	Thermo	PHG0311L
human epithelial growth factor	サーモ
HyClone FetalClone II Serum(米国)	GEヘルスケア	SH30066.02HI	滅菌FBS ヒート不活性化
ヒドロコルチゾン21-ヘミスコハク酸ナトリウム塩	シグマ	H4881
ヒドロコルチゾン	プロモーションセル	C-64420	ミディアムサプリメント
アイスバケツ	-	-	-
イスマテック IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	低速デジタル蠕動ポンプ; q24-Channel (12 チップごとに 1
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK	PromoCell	C-63821
Keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
Laminin	ビオラミナ	CT521-0501
ラミニン、521 CTG(CT521)	ビオラミナ	CT521-0501	ヒト組換えラミニン521
肺線維芽細胞	生物製剤	H6013
肺線維芽細胞	ライン細胞技術	FC-0049
微小血管内皮細胞	ロンザ	CC-2527
肺平滑筋細胞ライフ	ライン細胞技術	FC-0046
手動カウンター	-	-	-
Masterflex (TPE) トランスファーチューブ	コールパー	マーFV-96880-02	PharMed BPT、1/32 "ID×5/32"OD
ミディアム199、フェノールレッドサー	モなし
マイクロ遠心チューブ	-	-	1.5mL、滅菌
顕微鏡(カメラ付き)	-	-	明視野イメージング用
N2	Sigma	17502001
N-アセチルシステイン	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T コンディショニング メディウム)	Sigma	N17001
ノーマル ヤギ セラム	サーモフィッシャー	50062Z	ブロッキングソリューション
O-ホスホスリルエタノールアミン	Sigma	P0503
パラホルムアルデヒド (4% wt/vol)	EMS	15710	固定剤
ペニシリンストレプトマイシン	GIBCO	15140122
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ	P4333	10,000 U/mL; 10 mg/mL
ピペットのヒント	-	-	P20、P200、P1000 滅菌、低接着
ピペット	ギルソン	F167380	P20、P200、P1000
PluriQ Serum Replacement (またはまたはKO Serum Replacement)	AMSBIO (or Thermo)	N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides	シグマ	P0425	スライドガラス
プリモシン	InvivoGen	ant-pm-1
プロゲステロン	Sigma	P8783
プロロング ゴールド	サーモフィッシャー	P36931	DAPI付き退色防止封入剤
レチノイン酸	Sigma	R2625
ROCK阻害剤(Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin(HEK293T Conditioning medium)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuotsサプリメント	ロンザ	CC-4124
SAGMTM 小気道上皮細胞増殖培地 BulletKitTM	ロンザ	CC-4124	ミディアムサプリメント
SB2001190	トクリス	1264/10
セロロジカルピペット	-	-	2 mL、5 mL、10 mL、および25 mLの低エンドトキシン、滅菌
小気道上皮細胞増殖培地(SAGM)	ロンザ	CC-4124
ソルベントバッファー(ER-2)	エミュレート	10462	25 mLボトル
ステリフリップ-HV	ミリポア	SE1M003M00	滅菌ろ過円錐管
Sterilin 100 mm角シャーレ	Thermo	103	、6チップごとに1つ
T25フラスコ	-	-	-
T75フラスコ	-	-	-
トリヨードチロニン	Σ	T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)	シグマ	T8787	透過剤
トリパンブルー	シグマ	93595	0.4%溶液
TrypEEソリューション	シグマ	12604013	細胞剥離ソリューション
トゥイーン-20	シグマ	P2287	透過剤
UVライトオーブン(ピーク周波数365nm、強度100 & マイクロ;J/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
真空セットアップ	-	-	最低圧力:-70 kPa
血管内皮増殖因子165(VEGF-165)ヒト、大腸菌の組換え	PromoCell	C-64420
VEGF-165	プロモーションセル	C-64420	ミディアムサプリメント
フォン・ヴィレブランド因子共役FITC	アブカム	ab8822	ヒツジポリクローナル抗体
ウォーターバス(またはビーズ)	-	-	37 °C
Wnt3A(L-Wnt3A調整媒体)	ATCC	CRL-2647