本プロトコルは、初代組織(皮膚、肺胞、気道、および腸)の全層臓器チップ培養の確立と成熟を成功させるためのOpen-Top Organ-Chipの機能と本質的な培養モダリティを説明し、ヒトの上皮/間葉系および血管ニッチ界面のさまざまな機能的側面をin vitroで調査する機会を提供します。
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この記事について
サマリー
要約
ほぼすべての人間の臓器は上皮組織で裏打ちされており、3次元(3D)構造に編成された緊密に接続された細胞の1つまたは複数の層で構成されています。上皮の主な機能の1つは、下線組織を物理的および化学的傷害および感染性病原体から保護する障壁の形成である。さらに、上皮は栄養素、ホルモン、およびその他のシグナル伝達分子の輸送を媒介し、多くの場合、臓器内の細胞の位置決めと区画化を導く生化学的勾配を作成します。上皮は、臓器の構造と機能を決定する上で中心的な役割を果たすため、動物モデルでは必ずしも捕捉されない多くのヒト疾患の重要な治療標的です。明らかな種間の違いに加えて、動物の上皮のバリア機能と輸送特性に関する調査研究を行うことは、生体系でこれらの組織にアクセスすることの難しさによってさらに悪化します。二次元(2D)ヒト細胞培養は、基本的な科学的質問に答えるのに役立ちますが、 in vivo での予測が不十分であることがよくあります。これらの制限を克服するために、過去10年間で、臓器チップとして知られる多数のマイクロエンジニアリングされた生体模倣プラットフォームが、従来の in vitro および動物実験の有望な代替手段として浮上しました。ここでは、皮膚、肺、腸などの臓器特異的な上皮組織をモデル化するために設計されたプラットフォームであるオープントップ臓器チップ(またはオープントップチップ)について説明します。このチップは、機械的に活性なシステム内に組織特異的な線維芽細胞と内皮細胞を組み込むことによって3D間質成分を再現する機能を含む、上皮組織の多細胞構造と機能を再構成するための新しい機会を提供します。このOpen-Top Chipは、単一細胞から多層組織構築物まで、複数の解像度スケールで上皮/間葉系および血管の相互作用を研究するための前例のないツールを提供し、健康と疾患における上皮化臓器の細胞間クロストークの分子解剖を可能にします。
概要
歴史的に、科学者は創薬のために前臨床動物実験に依存してきましたが、人間の転帰との相関性が低いため、これらの方法の多くが疑問視されてきました1。動物実験を置き換え、削減し、改良するための「3R」原則の実施は、科学者に前臨床薬物および化学毒物学のリスク評価をサポートするための新しいin vitro代替方法を見つけることを促します2。しかし、これまでに開発された多くのin vitroモデルは、人間の生体器官の動的な性質を再現するために必要な生物学的構造、細胞の複雑さ、および機械的環境を欠いています3,4。
従来のin vitro前臨床システムでは、通常、硬質プラスチック表面上で増殖したヒト細胞の2D単培養が使用されます。これらの方法は、簡単な機構研究を行うためのツールを提供し、医薬品候補の迅速なスクリーニングを可能にします。2Dモデルは比較的低コストで堅牢性が高いため、自動ハイスループットシステムと組み合わされることが多く、医薬品開発プロセスの初期段階で潜在的な医薬品候補を迅速に特定するために使用されます5,6
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プロトコル
ヒトコロノイドは、シンシナティ小児病院の施設バイオセーフティ委員会(IBC 2017-2011)のガイドラインに従って腸切除から取得されました。
1.表面活性化
- 活性化バッファーの調製
- 架橋剤と溶媒緩衝試薬をバイオセーフティキャビネット(BSC)の下に置き、室温(RT)で10分間平衡化してから使用してください。
- 架橋剤溶液を直接光曝露から保護するために、滅菌非透光性容器またはアルミニウム箔で包まれた透明な15 mLコニカルチューブを使用して、5 mLの溶媒バッファー中で5 mgの架橋剤を再構成します。
- 溶液を1分間ボルテックスしてすべての凝集塊を除去した後、50 μLの架橋剤溶液をチップのボトムチャネルに直接ピペットで入れ、150 μLをオープントップチャンバーにピペットで入れます。
- アスピレーターを使用して、チップの表面から余分な架橋溶液を取り除きます。次に、追加の50 μLの架橋溶液をチップの底部チャネルに直接ピペットで送り、150 μLをオープントップチャンバーにピペットで入れて、残っている気泡を取り除きます。
- UV架橋機による活性化
- BSCの下のチップから蓋をそっと取り外し、滅菌容器に保管します。
- 架橋剤溶液を含むチップをペトリ皿に移し、汚染を避けるためにペ....
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結果
表面マイクロパターニング
細胞外マトリックス(ECM)のマイクロパターニングは、腸陰窩界面の空間的構成を複製するために使用することができる。Open-Top Chipの構成を変更して、結腸上皮-間質界面の自然なトポグラフィー(図6A、B)とマイクロメートルスケールの腸陰窩(図6C-E)を模倣するように特別に設計されたマイクロパターンスタンプを統合することができます。皮膚、気道、肺胞のモデルには平らな(パターン化されていない)表面を使用したことに注意してください。このスタンプをこの際に用いて、種子上皮細胞に対して均一なヒドロゲル表面を得た。私たちは、腸の陰窩を模倣した正と負のドームの交互からなる、人間の腸粘膜の自然な構造を模倣できるデザインを選択しました。
臓器モデル
Open-Top .......
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ディスカッション
Open-Top Chipは、制御された微小環境において内皮、間質、上皮の間で発生する複雑な細胞相互作用をリアルタイムで調査するためのプラットフォームです。この技術は、流体せん断(流れ)、周期的伸張、マイクロパターニングによって達成される上皮表面トポグラフィの再構築など、ヒト組織の微小環境の再構成に関連する物理的および生化学的手がかりの統合など、従来の有機型およびオルガノイド培養 に比べて 重要な利点を提供します。このプラットフォーム内で増殖するヒト細胞は相乗効果を発揮して、免疫組織化学や上部および/または下部コンパートメントからの流出液(または排水)を使用した生化学的アッセイなど、従来の手法 で 分析できる組織特異的機能を再現します。現在の設計では、細胞が組織特異的線維芽細胞や他の間質細胞と直接接触して増殖する上皮層に容易にアクセスでき、上皮組織の多細胞構造を模倣しています。特に、Open-Top Chipプロトタイプは、他のオルガンオンチッププラットフォームの使用に関連する一般的な課題に対する実行可能なソリューションを提供します。間質コンパートメント内にいくつかの異なる細胞タイプを組み込むことがで.......
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開示事項
著者は、潜在的な競合する利益と見なされる可能性のある以下の金銭的利益/個人的な関係を宣言します。 ヴァローネアントニオはEmulate Inc.の元従業員であり、Emulateの株式を保有している可能性があります。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10倍エメム | ロンザ | 12-684F | ミディアム;Stroma |
| 18ゲージニードル | MicroGroup316H18RW | チューブステンレス鋼316溶接、18RWフルハード | |
| 19ゲージニードル | MicroGroup316H19RW | チューブステンレス鋼316溶接、19RWフルハード | |
| 2ストップPharMed BPT | コール・パーマー | EW-95723-12 | チューブ、0.25 mm、12個入り |
| 70%エタノールおよびワイプ | - | - | 表面滅菌用 |
| 8-ブロモアデノシン 3′,5′-環状一リン酸ナトリウム塩 (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | トクリス | 2939 | |
| アデニン | シグマ | A9795 | |
| アドバンスド DMEM/F12 | サーモ | 12634010 | |
| 気道上皮細胞ライフ | ラインセル | テクノロジーFC-0016 | |
| アルミホイル | - | - | - |
| 肺胞細胞 | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | アブカム | ab24751 | マウスモノクローナル抗体 [3C9] |
| 抗アクアポリン5 Alexa Fluor 647 | アブカム | ab215225 | ウサギモノクローナル抗体 [EPR3747] |
| 抗アクアポリン5 | アブカム | ab92320 | ウサギモノクローナル抗体 [EPR3747] |
| 抗ベータIVチューブリン | アブカム | ab11315 | マウスモノクローナル抗体 [ONS.1A6] |
| 抗CD31(PECAM-1) | アブカム | ab9498 | マウスモノクローナル[JC/70A]抗体 |
| アンチCK5 | アブカム | ab75869 | ウサギ組換えモノクローナル [AY1E6] |
| 抗サイトケラチン10 | サーモフィッシャー | MA5-13705 | マウスモノクローナル抗体 (DE-K10) |
| 抗サイトケラチン14 | アブカム | AB7800 | マウスモノクローナル抗体 |
| アンチE-カドヘリン | アブカム | ab1416 | マウスモノクローナル抗体 |
| 抗フィラグリン | サーモフィッシャー | PA5-79267 | ウサギポリクローナル抗体 |
| アンチHTI-56 | テラス・バイオテック | TB-29AHT1-56 | マウスモノクローナル抗体(IgG1) |
| アンチHTII-280 | テラス・バイオテック | TB-27AHT2-280 | マウスモノクローナル抗体(IgM) |
| 抗インボルクリン | サーモフィッシャー | MA5-11803 | マウスモノクローナル抗体(SY5) |
| 抗アイソフォームTA p63-&α;、-&β;、-&γ; | ビオレンゲント | 618902 | ウサギポリクローナル抗体 |
| アンチキ67 | アブカム | ab8191 | マウスモノクローナル抗体 [B126.1] |
| アンチランプ3 | アブカム | ab111090 | ウサギポリクローナル抗体 |
| アンチマチュアSP-B | セブンヒル | WRAB-48604 | ウサギポリクローナル抗体 |
| アンチMUC5AC | サーモフィッシャー | PA5-34612 | ウサギポリクローナル抗体 |
| 抗ムチン-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | マウスモノクローナル抗体 (IgG1) |
| アンチp63 | ダコ | GA662 | マウスモノクローナル抗体p63タンパク質(Dako Omnis) クローンDAK-p63 |
| アンチPCNA | サーモフィッシャー | PA5-32541 | ウサギポリクローナル抗体 |
| 抗ポドプラニン(AT-1α) | アブカム | ab128994 | ウサギポリクローナル抗体 |
| 抗Pro+成熟界面活性剤タンパク質B | アブカム | ab40876 | ウサギポリクローナル抗体 |
| 界面活性剤C | セブンヒル | WRAB-9337 | ウサギポリクローナル抗体 |
| 抗子宮グロビン/SCGB1A1 | ハイカルト・バイオテック | HM2178 | マウスモノクローナル抗体 [AY1E6] |
| 抗VE-カドヘリン | アブカム | ab33168 | ウサギポリクローナル抗体 |
| アンチZO-1 | サーモフィッシャー | 33-9100 | マウスモノクローナル抗体 [1A12] |
| アスコルビン酸 | Sigma | A4544 | |
| 吸引ピペット | コーニング/ファルコン | 357558 | 2mL、ポリスチレン、個包装 |
| 吸引のヒント | - | - | 滅菌(オートクレーブ滅菌) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | サーモフィッシャー | 37525 | ブロッカー剤 |
| 塩化カルシウム | Sigma C7902 | ||
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| コラーゲンIV | シグマ | C5533 | |
| コラーゲンIV | シグマ | C5533-5MG | ヒト胎盤由来のコラーゲン、5 mg粉末、1 mg / mLに再構成 |
| 結腸性線維芽細胞 | 細胞生物学的製剤 | H6231 | |
| 大腸微小血管内皮細胞 | Cell Biologics | H6203 | |
| コニカルチューブ | - | - | 15 mLおよび50 mL ポリプロピレン、滅菌 |
| 架橋剤(ER-1) | エミュレート | 10461 | 5 mg粉末 |
| DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、乳酸) | サーモフィッシャー | D3571 | DNAプローブ |
| 真皮線維芽細胞 | ATCC | PCS-201-010 | |
| 真皮微小血管内皮細胞 | ATCC | CRL-3243 | |
| デキサメタゾン | Σ | D4902 | |
| DMEM | サーモフィッシャー | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | ||
| DMEM/F-12、GlutaMAX | GIBCO | 〒10565-018 | ALI培地用基礎培地 |
| ロバ抗マウスIgG H&L (Alexa Fluor 488) | アブカム | ab150105 | ロバ抗マウス二次抗体 |
| ロバ抗マウスIgG H&L(アレクサフロー568) | アブカム | ab175472 | ロバ抗マウス二次抗体 |
| ロバ抗マウスIgG H&L (アレクサ フロー 647) | アブカム | ab150107 | ロバ抗マウス二次抗体 |
| ロバ抗ウサギIgGハンド&L (Alexa Fluor 488) | アブカム | ab150073 | ロバ抗マウス二次抗体 |
| ロバ抗ウサギIgGハンド&L(アレクサフロー568) | アブカム | ab175470 | ロバ抗マウス二次抗体 |
| ロバ抗ウサギIgGハンド&L (アレクサ フロー 647) | アブカム | ab150075 | ロバ抗マウス二次抗体 |
| ダルベッコs PBS (DPBS-/-) (Ca2+, Mg2+なし) | コーニング | 21-031-CV | 1倍 |
| 上皮成長因子(EGF)ヒト、大腸菌の組換え | PromoCell | C-60170 | 培地サプリメント |
| F-12ハムs | Invitrogen | 21700-108 | 血管ECM |
| FibriColの場合 | アドバンスドバイオマトリックス | 5133-20ML | I.コラーゲン溶液(10mg/mL) |
| フィブロネクチン | コーニング | 356008 | |
| フィブロネクチン、ヒト、ナチュラル、 | コーニング | 47743-654 | ヒト血漿フィブロネクチン |
| 細先端精密ピンセット | アベン | 18056USA | Technik Style 5B-SA 精密ステンレス製ピンセット |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| グルタマックス | インビトロジェン | ||
| ヤギ抗マウスIgGハンド&L (Alexa Fluor 594) | アブカム | ab150080 | ヤギ抗マウス二次抗体 |
| ヤギ抗マウスIgGハンド&L (アレクサ フロー 647) | アブカム | ab150115 | ヤギ抗マウス二次抗体 |
| ヤギ抗マウスIgGハンド&L (FITC) | アブカム | ab6785 | ヤギ抗マウス二次抗体 |
| ヤギ抗マウスIgG1 Alexa Fluor 568 | サーモフィッシャー | A-21124 | ヤギ抗マウスIgG1二次抗体 |
| ヤギ抗マウスIgM Alexa Fluor 488 | サーモフィッシャー | A-21042 | ヤギ抗マウスIgM二次抗体 |
| ハンドヘルド真空吸引器 | コーニング | 4930 | - |
| ヒートイン不活化 HyClone FetalClone II セラム (FCS) | GEヘルスケアライフサイエンス | SH30066.03 | |
| 血球計算盤 | - | - | - |
| 豚腸粘膜由来ヘパリンナトリウム塩 | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| ヒトコロノイド | 臨床 | 切除から得られた | |
| ヒト EGF 組換えタンパク質 | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | サーモ | ||
| HyClone FetalClone II Serum(米国) | GEヘルスケア | SH30066.02HI | 滅菌FBS ヒート不活性化 |
| ヒドロコルチゾン21-ヘミスコハク酸ナトリウム塩 | シグマ | H4881 | |
| ヒドロコルチゾン | プロモーションセル | C-64420 | ミディアムサプリメント |
| アイスバケツ | - | - | - |
| イスマテック IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | 低速デジタル蠕動ポンプ; q24-Channel (12 チップごとに 1 |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | ビオラミナ | CT521-0501 | |
| ラミニン、521 CTG(CT521) | ビオラミナ | CT521-0501 | ヒト組換えラミニン521 |
| 肺線維芽細胞 | 生物製剤 | H6013 | |
| 肺線維芽細胞 | ライン細胞技術 | FC-0049 | |
| 微小血管内皮細胞 | ロンザ | CC-2527 | |
| 肺平滑筋細胞ライフ | ライン細胞技術 | FC-0046 | |
| 手動カウンター | - | - | - |
| Masterflex (TPE) トランスファーチューブ | コールパー | マーFV-96880-02 | PharMed BPT、1/32 "ID×5/32"OD |
| ミディアム199、フェノールレッドサー | モなし | ||
| マイクロ遠心チューブ | - | - | 1.5mL、滅菌 |
| 顕微鏡(カメラ付き) | - | - | 明視野イメージング用 |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-アセチルシステイン | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T コンディショニング メディウム) | Sigma | N17001 | |
| ノーマル ヤギ セラム | サーモフィッシャー | 50062Z | ブロッキングソリューション |
| O-ホスホスリルエタノールアミン | Sigma | P0503 | |
| パラホルムアルデヒド (4% wt/vol) | EMS | 15710 | 固定剤 |
| ペニシリンストレプトマイシン | GIBCO | 15140122 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | シグマ | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| ピペットのヒント | - | - | P20、P200、P1000 滅菌、低接着 |
| ピペット | ギルソン | F167380 | P20、P200、P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (またはまたはKO Serum Replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | シグマ | P0425 | スライドガラス |
| プリモシン | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| プロゲステロン | Sigma | P8783 | |
| プロロング ゴールド | サーモフィッシャー | P36931 | DAPI付き退色防止封入剤 |
| レチノイン酸 | Sigma | R2625 | |
| ROCK阻害剤(Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin(HEK293T Conditioning medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuotsサプリメント | ロンザ | CC-4124 | |
| SAGMTM 小気道上皮細胞増殖培地 BulletKitTM | ロンザ | CC-4124 | ミディアムサプリメント |
| SB2001190 | トクリス | 1264/10 | |
| セロロジカルピペット | - | - | 2 mL、5 mL、10 mL、および25 mLの低エンドトキシン、滅菌 |
| 小気道上皮細胞増殖培地(SAGM) | ロンザ | CC-4124 | |
| ソルベントバッファー(ER-2) | エミュレート | 10462 | 25 mLボトル |
| ステリフリップ-HV | ミリポア | SE1M003M00 | 滅菌ろ過円錐管 |
| Sterilin 100 mm角シャーレ | Thermo | 103 | 、6チップごとに1つ |
| T25フラスコ | - | - | - |
| T75フラスコ | - | - | - |
| トリヨードチロニン | Σ | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | シグマ | T8787 | 透過剤 |
| トリパンブルー | シグマ | 93595 | 0.4%溶液 |
| TrypEEソリューション | シグマ | 12604013 | 細胞剥離ソリューション |
| トゥイーン-20 | シグマ | P2287 | 透過剤 |
| UVライトオーブン(ピーク周波数365nm、強度100 & マイクロ;J/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| 真空セットアップ | - | - | 最低圧力:-70 kPa |
| 血管内皮増殖因子165(VEGF-165)ヒト、大腸菌の組換え | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | プロモーションセル | C-64420 | ミディアムサプリメント |
| フォン・ヴィレブランド因子共役FITC | アブカム | ab8822 | ヒツジポリクローナル抗体 |
| ウォーターバス(またはビーズ) | - | - | 37 °C |
| Wnt3A(L-Wnt3A調整媒体) | ATCC | CRL-2647 |
参考文献
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L.
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