Method Article

開発中のライブイメージングの方法とプロトコル

DOI:

10.3791/64642

⸱

January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

議論された記事:

Januschke, J., Loyer, N. ライブイメージングのためのフィブリン血栓によるショウジョウバエ組織の固定化の応用.視覚化された実験のジャーナル。(166)、10.3791/61954(2020)。

Li, T., Luo, L.ショウジョウバエの嗅覚回路集合のタイムラプスイメージング研究のための外植片システム。視覚化された実験のジャーナル。(176)、10.3791/62983(2021年)。

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W.頭蓋骨および皮膚の除去による覚醒したゼブラフィッシュの幼生および幼魚の完全活性脳組織のin vivoイメージング。視覚化された実験のジャーナル。(168)、10.3791/62166(2021年)。

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. サンプルチャンバーベースのライトシート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング。視覚化された実験のジャーナル。(163)、10.3791/61713(2020年)。

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS ニューロン発達中の生細胞イメージング.視覚化された実験のジャーナル。(168)、10.3791/62165(2021年)。

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. 誘導ラマン散乱顕微鏡を用いた線虫の脂質貯蔵ダイナミクスのラベルフリーイメージング.視覚化された実験のジャーナル。(171)、10.3791/61870(2021年)。

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. ゼブラフィッシュ原腸における2光子顕微鏡を用いた深く空間的に制御された体積アブレーション.視覚化された実験のジャーナル。(173)、10.3791/62815(2021年)。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

発達は、細胞小器官、細胞、および器官のレベルでの構造の動的変化によって特徴付けられます。タイムラプスイメージングは、生理学的状態の同じ構造から4次元情報を収集する能力により、発達の動的なプロセスを研究するのに理想的な技術になります1,2,3,4,5,6。ライブイメージングで収集した膨大なデータにより、開発の定量分析も可能になります。タイムラプスイメージングは単層細胞培養により広く使用されていますが、生組織の光散乱、適切な取り付け戦略と標識方法の開発、長時間のイメージング期間中の正常な生理学的状態の維持、適切な顕微鏡へのアクセスなどの技術的な困難により、3次元の生体組織または動物のイメージングははるかに困難です。 等。これらの課題により、多くのラボでのライブイメージングの使用が制限されています。このメソッドコレクションでは、7つの論文がライブサンプル調製、標識、およびレーザーベースの操作の新しい方法を報告しました。これらの方法はすべて、さまざまな角度からの発達プロセスのライブイメージングを容易にします。

深部領域の直接イメージングは、生組織の強い散乱のため、技術的に困難です。この散乱は、解剖による内臓の露出によって最小限に抑えることができ、画像の空間解像度が向上します。このコレクションでは、JanuschkeとLoyer7 は、 ショウジョウバエ の幼虫の脳を解剖するためのプロトコルと、フィブリン血栓を使用した取り付け方法について説明しました。この取り付け戦略により、フィブリノーゲンとトロンビンを追加するだけで済むため、同じ皿上の複数のサンプルの倒立顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングが可能になりました。LiとLuo8 は、ハエの蛹からの触角脳外植片の解剖のためのプロトコルと、嗅覚回路の正常な発達を24時間維持するex vivo 培養条件を提示しました。彼らのシステムは、ハエの嗅覚回路の組み立てにおける軸索と樹状突起の標的化を生理学的状態から視覚化することを可能にしました。この外植片システムは、補償光学ベースのイメージングを備えた二光子顕微鏡および格子ライトシート顕微鏡に適しており、短期間で高い時空間分解能で長期連続イメージングと高速イメージングの両方を可能にします。Schramm ら 9 は、マイクロピーリングによってゼブラフィッシュの皮膚と軟い頭蓋骨軟骨を除去する低侵襲外科手術を開発しました。これにより、ニューロンの分化、成熟、可塑性、受精後 30 日までの Ca2+ 一過性など、発達後期のいくつかの重要なイベントを観察することができました。また、ゼブラフィッシュの幼生の皮膚の色素沈着後にライブイメージングを行うこともできました。解剖に加えて、サンプルの適切な取り付けもライブイメージングにとって重要です。Ratkeら10 は、ライトシート顕微鏡を使用して複数のハエ胚を同時にライブイメージングするための実験フレームワークを提示しました。このプロトコルは全体的なスループットを向上させ、比較研究に最適です。

サンプル調製に加えて、新しい標識法により、生組織内の特定の構造の視覚化が容易になります。Terziら11は、発生中に培養されたゼブラフィッシュニューロンおよび幼虫全体から細胞内H2O2レベルをイメージングするための、遺伝的にコードされたH2O2特異的バイオセンサーroGFP2-Orp1を報告しました。この遺伝的にコードされたH2O2バイオセンサーの重要な利点の1つは、H2O2検出の時間的および空間的分解能の向上でした。Mutluら12による別の研究では、細胞内分解能で生細胞中の脂質を迅速かつ定量的に検出するためのラベルフリーの化学イメージング法である誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡法について説明しました。H2O2 と脂質はどちらもサンプルの固定中に失われやすくなります。生組織における標識またはイメージング法の開発は、この課題を回避しただけでなく、生物学的プロセスにおけるこれらの構造の空間的および時間的情報を保持しました。

最後に、光は細胞アブレーションにも使用できます。Boutillonら13 は、2光子顕微鏡を使用して、ゼブラフィッシュの深くて空間的に明確に定義された体積をアブレーションする方法を示しました。紫外線レーザーベースの細胞アブレーションと比較して、2 光子レーザーは軸方向の分解能と組織の浸透を改善しました。このプロトコルは、開発中の細胞間相互作用を研究するための摂動戦略を提供しました。

顕微鏡技術の進歩により、多くの発達過程を4次元で理解できるようになりました。このコレクションのプロトコルは、より多くの科学者がさまざまな生物学的システムにおけるライブイメージングの技術的障壁を克服するのに役立ちます。今後、ライブイメージングを容易にする手法がさらに開発されることが期待されます。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この JoVE Method Collection の問題は、NIH 1K99DC01883001 によって資金提供されました。ポスドクのメンターであるLiqun Luo氏、共同研究者のEric Betzig氏とTian-Ming Fu氏には、ポスドクプロジェクト中にタイムラプスイメージングへの興味を育むための強力なサポートに感謝します。また、浙江大学の脳科学・脳医学院が私を募集し、自分の研究室でタイムラプスイメージングの研究を続けるための支援をしてくれたことに感謝しています。

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rieger, S., Wang, F., Sagasti, A. Time-lapse imaging of neural development: zebrafish lead the way into the fourth dimension. Genesis. 49 (7), 534-545 (2011).
  2. Wong, C., Chen, A. A., Behr, B., Shen, S. Time-lapse microscopy and image analysis in basic and clinical embryo development research. Reproductive Biomedicine Online. 26 (2), 120-129 (2013).
  3. Ezin, M., Fraser, S. Time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  4. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Current Opinion in Cell Biology. 17 (6), 676-681 (2005).
  5. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  6. Christen, P., Muller, R. In vivo visualisation and quantification of bone resorption and bone formation from time-lapse imaging. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 311-317 (2017).
  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Live ImagingDrosophilaImmobilizationTime lapse ImagingOlfactory Circuit AssemblyIn Vivo ImagingBrain TissueZebrafish LarvaeLight Sheet Fluorescence MicroscopyNeuronal DevelopmentROS ImagingLipid Storage DynamicsCaenorhabditis ElegansStimulated Raman Scattering MicroscopyTwo photon MicroscopeVolume Ablations

Related Articles