方法論記事

C.エレガンスを使用してタンパク質安定の不均衡を監視する

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DOI:

10.3791/64643

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2022年8月24日

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この記事について

要約

プロテオスタシス ネットワークは、プロテオームの機能を確保し、細胞と生物の健康を促進する細胞タンパク質品質管理システムです。年齢とともに忠実度が低下し、ストレスに対するプロテオームの脆弱性が高まり、最終的には神経変性疾患や癌などの病気にかかりやすくなります。この進化的に保存されたネットワークに関する研究に焦点を当てるために、Journal of Visualized Experiments (JoVE) は、C. elegans を使用してプロテオスタシスの不均衡を監視する研究者による方法のコレクションを紹介しています。この社説では、細胞、組織、および生物レベルでのタンパク質静止ネットワークを理解するためのこれらのさまざまな実験的アプローチの概要を説明します。

議論された記事:

Golden, N. L.、Plagens, R. N.、Kim Guisbert, K. S.、Guisbert, E. Caenorhabditis elegans における熱ショック反応の誘導を測定するための標準化された方法。 視覚化された実験のジャーナル。 (161)、土井:10.3791/61030 (2020)。

Chauve、L. 他。ナノ流体技術を用いた単一およびバルクC.エレガンスサンプルのハイスループット定量RT-PCR 視覚化された実験のジャーナル。 (159)、土井:10.3791/61132 (2020)。

Bar-Ziv、R. 他。C.Elegansにおける生理的ストレス反応の測定 視覚化された実験のジャーナル。 (159)、土井:10.3791/61001 (2020)。

Okkenhaug, H.、Chauve, L.、Masoudzadeh, F.、Okkenhaug, L.、Casanueva、O. ワームアライメントとWorm_CP、Caenorhabditis elegans から得られた蛍光画像データの矯正と定量化のための 2 つのオープンソース パイプライン。 視覚化された実験のジャーナル。 (159)、doi:10.3791/61136 (2020)。

Lazaro-Pena、MI、Cornwell、AB、Samuelson、AV Caenorhabditis elegans における組織特異的タンパク質静性低下の定量化。 視覚化された実験のジャーナル。 (175)、doi:10.3791/61100 (2021)。

Dror, S.、Meidan, TD、Karady, I.、Ben-Zvi, A. Caenorhabditis elegans を使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングします。 視覚化された実験のジャーナル。 (160)、doi:10.3791/61140 (2020)。

Miles, J., van Oosten-Hawle, P. 全身ストレスシグナル伝達の成分を特定するための組織特異的 RNAi ツール。 視覚化された実験のジャーナル。 (159)、doi:10.3791/61357 (2020)。

ピガッツィーニ、ML、キルスタイン、J.光変換性デンドラ2を用いた老化したC.エレガンスにおける蛋白質代謝回転のin vivo定量化 視覚化された実験のジャーナル。 (160)、土井:10.3791/61196 (2020)。

Pigazzini, ML、Gallrein, C.、Iburg, M.、Kaminski Schierle, G.、Kirstein, J. 蛍光寿命イメージングを使用した老化 C. elegans のアミロイド構造の特性評価。 視覚化された実験のジャーナル。 (157)、土井:10.3791/61004 (2020)。

Rudich, P.、Snoznik, C.、Puleo, N.、Lamitina, T. C. elegans における RAN ペプチド毒性の測定。 視覚化された実験のジャーナル。 (158)、doi:10.3791/61024 (2020)。

Arnold, ML、Cooper, J.、Grant, BD、Driscoll, M. C. elegans の大きな外出小胞における in vivo ニューロン凝集体と細胞小器官の押し出しをスコアリングするための定量的アプローチ。 視覚化された実験のジャーナル。 (163)、doi:10.3791/61368 (2020)。

編集記事

タンパク質恒常性、またはプロテオスタシスは、細胞および生物の健康の基礎です1,2。保存された細胞プロセスは、タンパク質合成、折り畳み、およびクリアランスに影響を与えることにより、適切に折りたたまれたプロテオームを維持するために協力します3,4。プロテオスタシスの摂動は、加齢に伴う神経変性疾患や癌に関連しています 5,6。高いレベルの保存に基づいて、線虫Caenorhabditis elegans(C. elegans)などのモデル生物は、人間の健康と病気におけるプロテオスタシスの役割を理解するのに役立っています7,8。C.エレガンスは、ライフサイクルが短く、キューティクルが透明であること、化学的および遺伝子操作の容易さなど、理想的な実験モデルとなる多くの特徴を持っています9。このメソッドコレクションは、C. elegansの分子、細胞、および生物レベルでのプロテオスタシスの不均衡を監視するための詳細なプロトコルを提供します。

細胞は、熱ショック応答(HSR)、アンフォールドタンパク質応答(UPR)、酸化ストレス応答(OxSR)などのさまざまなストレス応答を活性化して細胞プロテオームを再調整することにより、プロテオスタシスの破壊に応答します10。現場での再現性を高めるために、HSRの堅牢な誘導のための標準化された実践がGoldenと同僚によって説明されています11。RT-qPCRは、mRNAを定量することによって遺伝子発現を分析するために広く使用されている高感度の方法であり、このアッセイは、さまざまな熱ショック誘発性遺伝子の細胞mRNAレベルを測定するために使用できます11。このアプローチを大規模でハイスループットな分析に拡張するために、Chauveら12は、堅牢で高感度のナノ流体RT-qPCRプラットフォームと組み合わせた、cDNA調製のための新しい適応について説明しています。遺伝子発現の正確な測定は、単一のワームまたはバルクサンプル12で実行できます。ストレス応答遺伝子の転写アップレギュレーションを測定するためのプライマーペアとともに、推奨されるストレス応答遺伝子標的は、対応するプロトコル12,13にリストされている。

RT-qPCRを使用してストレス反応の活性化を評価することの1つの制限は、高価で技術的に困難であり、特殊な機器の使用が必要になることです。したがって、ストレス誘導性プロモーター(例えば、HSRモニタリング用のhsp-16.2p::gfp)の下で蛍光タンパク質を発現する経路特異的転写レポーター株は、細胞ストレス応答を評価するために頻繁に使用されます11。Okkenhaugたちは、フィジーを拠点とするシンプルなオープンソースのワークフローをCellProfilerパイプラインWorm_CPと組み合わせて、個々のワームからの蛍光を迅速に定量化するための14のステップを概説した。さらに、Bar-Zivら13は、数千匹の動物の蛍光強度、サイズ、および空間(2D)分布をキャプチャできる大粒子フローサイトメーターを使用したハイスループット法について説明しています。細胞ストレス応答の活性化を評価するための転写レポーターに関する情報と、蛍光顕微鏡およびワームバイオソーターを使用した定量化の推奨設定が提供されています13。重要なことに、これらのレポーターは、特定のストレスレジメン11,13に従った動物の健康状態を監視する特定の生理学的ストレス生存アッセイと組み合わせることができる。蛍光レポーターには組織特異的な違いを明らかにするという利点がありますが、特定の閾値を超える誘導しか検出できず、GFPなどの特定の蛍光色素の安定性により、遺伝子発現の動的変動の検出が妨げられます。さらに、ほとんどの生理学的アッセイは時間がかかるため、拡張性は限られています。これらの制限にもかかわらず、これらの方法により、内部および外部のストレッサーの細胞的および生理学的影響を包括的に特徴付けることができます。

慢性プロテオトキシック摂動は、機能的なプロテオームの維持に関与する品質管理機構であるプロテオスタシスネットワーク(PN)の崩壊に関連しています5,6。プロテオスタシスの進行性の低下は、多くの加齢に伴う疾患に関与しています。C. elegans は、プロテオスタシスの失敗に対する特定の組織の脆弱性を調べるための優れたモデル システムです。Lazaro-Pena et al.15 は、ワームの老化に伴う体壁の筋肉またはニューロンの機能を監視するアプローチについて説明しています。このアプローチは、ハイスループットの遺伝子解析または薬物スクリーニングに適応することができます15。主な課題は、in vivoでPNのさまざまな成分間の相互作用がどのように機能するかを理解することです。この欠点に対処するために、Drorら16は、発生と老化の過程で特定の組織におけるPNの重要な構成要素である分子シャペロンの相互作用に関する特定の情報を収集するシステムを開発しました。折り畳み平衡の組織特異的摂動を、RNAiによる標的遺伝子の組織特異的サイレンシングを可能にする利用可能な変異体またはトランスジェニック株と結合することにより、特定の組織内のシャペロンネットワークを調べることができます。特定の組織または細胞型の機能を評価する単純な行動アッセイでこの戦略を補完すると、in vivoでのPNの生物学的に関連する相互作用を明らかにすることができます15,16。1つの組織または細胞型におけるタンパク質静態の不均衡が、細胞の非自律的な方法で追加の組織の品質管理システムに影響を与える可能性があることを認識することが重要です。Milesおよびvan-Oosten-Hawle17は、さまざまなストレスレポーターおよびプロテオスタシスセンサー17と組み合わせた組織特異的RNAiアプローチを使用して、細胞非自律型PNのメカニズムおよび構成要素を特定するアプローチを説明しています。この戦略により、細胞の非自律活性化ストレス応答メカニズムの結果として、さまざまな組織における PN 能力を調べることができます。

C. elegans は、ハンチントン病18 などのポリグルタミン反復拡張変異によって引き起こされる加齢に伴う神経変性疾患をモデル化するために一般的に使用されます。頻繁に利用されているタンパク質静態センサーは、polyQの長さと年齢19歳に応じてin vivoで病巣を形成する蛍光タンパク質に融合したポリグルタミン(polyQ)フラグメントです。生物学的試験全体、個人間、およびラボ間の再現性を向上させるには、何が病巣として採点されているかを定義する必要があります。Lazaro-Pena ら 15 は、加齢中のニューロンまたは体壁筋内の polyQ::YFP 病巣形成を正確に測定する戦略について説明しています。ポリグルタミン増殖を持つ凝集しやすい変異型ハンチンチンタンパク質の代謝回転率を監視するために、PigazziniとKirstein20は、光変換可能な蛍光色素Dendra2の使用を必要とする非侵襲的技術について説明しています。共焦点顕微鏡と、変異体ハンチンチンを発現するC.エレガンス株を用いてデンドラ2に融合することで、老化生物におけるこの凝集しやすいタンパク質の分解を監視および定量化することが可能である20。変異ハンチンチンなどの凝集しやすいタンパク質のアミロイド線維化を定量化するために、蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)を採用できます21。FLIMは、アミロイド構造の近傍にある蛍光色素の消光を監視することにより、凝集プロセスの非侵襲的分析を可能にし、それによって蛍光寿命を短縮します21。蛍光寿命は融合したアミロイドタンパク質の凝集と負の相関があり、蛍光色素発現レベルとは無関係です。この技術により、研究者は、あらゆるタンパク質の凝集傾向に対する老化とPN障害の影響を追跡できます。ただし、蛍光色素の強度が低い場合、FLIMは比較的多数の光子を取得する必要があるため、これが問題になる可能性があります。したがって、より高い励起レーザー出力が必要となり、光退色が速くなり、崩壊曲線が信頼できなくなります。さらに、この技術には、既存の顕微鏡システムへのアドオンとして、高度で高価な機器が必要です。重要な標準化されたアプローチは、リピート拡張を含むRNAに関連するリピート関連非AUG依存性(RAN)翻訳を調査する別のプロトコルに含まれています。RAN翻訳は、リーディングフレームを決定するために開始コドンを必要としないため、疾患に関連する毒性ペプチドの数が増加します。Rudichらの研究グループ22は、C.エレガンスの移動と繁殖を使用してRANペプチドの毒性を定量する方法について詳しく説明しています。

プロテオスタシスの不均衡は、タンパク質のミスフォールディングと、複数の加齢に伴う神経変性疾患に関連するタンパク質凝集体の蓄積につながります5,6。蛍光レポーターに融合したさまざまな凝集しやすいタンパク質を発現するC.エレガンス株は、さまざまな細胞および組織タイプにわたるタンパク質静性の不均衡を監視するために利用されています。これらのモデルの分析により、一連の新しい観測結果が得られました。今回、Monica Driscollたちの研究グループは、ニューロンがPolyQ凝集体や損傷した細胞小器官などの他の細胞破片を「エクソファー」で放出し、これまで認識されていなかったニューロンのプロテオスタシスの枝を明らかにしたことに注目した23。これは新しい現象であるため、圃場内での再現性を確保するために、エキソファーの生産を監視するための明確な指示を提供することが重要です。Arnold et al.24 は、C. elegans exophers の物理的特徴、検出戦略、識別基準、および定量化の最適なタイミングを概説しています。さらに、このプロトコルは、エクソファー産生の再現性のある評価を達成するために、エクソファーレベルを調節できる意図しないストレスを排除するために、成長条件を厳密に制御するために必要な重要な注意を強調しています。

このコレクションは、 C.エレガンスの分子、細胞、および生物レベルでのプロテオスタシスの不均衡を監視するための複数の方法論的戦略を提供します。誤って折りたたまれた疾患タンパク質などのストレッサーは、特定の組織タイプに実験的に導入できますが、タンパク質毒性に対する細胞および生物の応答は経時的に監視されます。このコレクションは、プロテオスタシスのプロービングとモニタリング、折り畳まれたプロテオームを維持する品質管理システムの評価、および病気につながるこれらのシステムの調節不全を調査するためのツールキットを提供します。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

このメソッドコレクションに非常に貴重な貢献をしてくれた同僚に感謝します。

参考文献

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  5. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
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  11. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (161), e61030(2020).
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  19. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  20. Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In vivo quantification of protein turnover in aging C. elegans using photoconvertible dendra2. Journal of Visualized Experiments. (160), e61196(2020).
  21. Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Characterization of amyloid structures in aging C. elegans using fluorescence lifetime imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), e61004(2020).
  22. Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
  23. Melentijevic, I., et al. C. elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367-371 (2017).
  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

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