方法論記事

改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)

DOI：

10.3791/64644

⸱

2023年5月12日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では,活性化好中球由来の好中球細胞外トラップ残骸の2つの成分,ミエロペルオキシダーゼ抱合型DNAと好中球エラスターゼ抱合型DNA複合体を定量的に測定するための改変サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ法のプロトコルについて紹介する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微生物などの特定の刺激により、好中球は好中球細胞外トラップ(NET)を放出しますが、これは基本的に、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)や好中球エラスターゼ(NE)などの顆粒タンパク質を含むDNAと細胞質および細胞骨格タンパク質で構成されるウェブ様構造です。近年NETへの関心が高まっていますが、臨床現場でNETを測定するための高感度で信頼性の高いアッセイ法はありません。本稿では、NETの特定の成分であり、NETの分解産物として細胞外空間に放出される循環NETの2つの成分であるMPO-DNAおよびNE-DNA複合体を定量的に測定するための改変サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイについて説明します。このアッセイでは、捕捉抗体としてMPOまたはNEに特異的なモノクローナル抗体を使用し、DNA特異的検出抗体を使用します。MPOまたはNEは、MPO-DNAまたはNE-DNA複合体を含むサンプルの初期インキュベーション中に、捕捉抗体の1つの部位に結合します。このアッセイは、良好な直線性と高いアッセイ間およびアッセイ内精度を示します。急性呼吸窮迫症候群を伴うCOVID-19患者16例に使用したところ、MPO-DNAおよびNE-DNAの血漿中濃度が健常対照から得られた血漿中よりも有意に高いことがわかりました。この検出アッセイは、ヒト血漿および培養上清中のNETsの特性を調べるための信頼性が高く、高感度で有用な方法です。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いてミエロペルオキシダーゼ(MPO)と好中球エラスターゼ(NE)とDNA 1,2の複合体を検出することにより、体液中の好中球細胞外トラップ(NET)形成を定量する方法について概説します。NETは、好中球顆粒に由来する抗菌プロテアーゼで装飾されたDNA骨格で構成されています3,4。MPO-DNA複合体とNE-DNA複合体はどちらもNETの重要な特異的成分であり、NETの分解産物として細胞外空間に放出されます3,4。

NETは、抗菌防御における重要な生理学的役割3に加えて、血栓形成6の促進や敗血症7の悪化など、さまざまな病理学的効果4,5も持っています。そこで、最近はNETが注目されています。それにもかかわらず、NETのin vivo定量は、高感度で信頼性の高い定量アッセイ法がないため、困難であることが証明されています。

蛍光顕微鏡8,9およびフローサイトメトリー10によるNETの直接測定や、循環無細胞DNA、ヌクレオソーム、およびシトルリン化ヒストンH3の間接測定など、いくつかの方法が利用可能ですが、それぞれの方法には独自の利点と制限があります11。免疫蛍光顕微鏡法はNETに特異的であり、NET形成の局在と程度を明確に示していますが、サンプルは生検組織と分泌材料に限定されています。さらに、この方法は熟練した研究者が行う必要があり、結果が得られるまでに長い時間を必要とします。フローサイトメトリーによるNET関連成分の循環レベルの測定は簡単で、迅速に結果が得られます。ただし、このメソッドは NET12 に固有のものではありません。

We13およびその他1,2は、捕捉抗体としてMPOまたはNEに特異的な抗体を使用し、DNA特異的検出抗体を使用する修正ELISA技術を用いて、ヒト血漿中の循環NET成分であるMPO結合またはNE結合DNAを測定するための高感度で信頼性の高いアッセイを開発しました。このアッセイは、ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)刺激に応答して活性化好中球によって放出される細胞培養上清中のNET成分を同定するためにex vivoで使用することもできます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究はヘルシンキ宣言に準拠して実施され、愛知医科大学の治験審査委員会(2017-H341、2019-H137)で承認されました。書面によるインフォームドコンセントは各参加者から得られた。

1. 試薬調製

注:サンドイッチELISAアッセイを実施するために、試薬は以下のように調製される。

  1. コーティングバッファー:
    1. 0.1 mol/Lの炭酸水素塩緩衝液を作るには、無水炭酸ナトリウム10.6 g(分子量106 g/mol)と重炭酸ナトリウム8.4 g(分子量84 g/mol)を秤量します。
    2. ビーカー内の蒸留水約900mLに加えます。
    3. 必要量の希塩酸または水酸化ナトリウムを加えて、緩衝液のpHを9.6に調整します。
    4. pHメーターでpHを確認してください。
    5. 次に、必要な量の蒸留水を加えて、総容量1,000mLにします。
    6. この0.1 mol/L炭酸水素塩バッファーを4°Cの冷蔵庫に保管してください。
  2. ブロッキングバッファ:
    1. 137 ミリモル/L NaCl、8.1ミリモル/L Na 2 HPO 4、2.68 ミリモル/L KCl、および1.47 モル/L KH2PO 4(pH7.4)からなるリン酸緩衝生理食塩水(PBS)70 mLに、約20%アジ化ナトリウムとウシ血清アルブミン(BSA)1 gを加え、穏やかに混合します。
    2. 蒸留水を加えて、総容量を100mLにします。ウシ血清アルブミンおよびアジ化ナトリウムの最終濃度はそれぞれ1%および0.05%である。10分待つと、ソリューションを使用できるようになります。
  3. 洗浄液:蒸留水中で0.5%t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル(Triton X-100)を調製します。
    1. 100%Triton X-100を蒸留水で10%に希釈し、10%溶液を使用前に1日間放置します。
    2. 次に、10%Triton X-100溶液を蒸留水で20倍に再希釈して、0.5%の濃度にします。
  4. 抗体希釈:
    1. 捕捉抗体(抗MPO抗体[1 mg/mL]または抗NE抗体[1 mg/mL])をアッセイ1日目(下記参照)に使用する前にコーティングバッファー(pH 9.6)で1:2,000に希釈し、検出抗体(ペルオキシダーゼ結合抗DNA抗体)をPBSで1:40に希釈してから、アッセイの3日目に使用します(下記参照)。
      注:予備実験では、アイソ型抗体(IgGウサギ[5 mg/mL]およびIgG1マウスクローンCi4 [0.5 mg/mL])をコーティングバッファー(pH 9.6)で1:10,000および1:1,000に希釈します。
  5. ABTS基質溶液:サンプル数に応じて、1つ、2つ、または3つの2,2'-アジノ-ビス(3エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)錠剤)を5 mL、10 mL、または15 mLのABTSバッファー(過ホウ酸ナトリウム、クエン酸、リン酸水素二ナトリウムを含む)に溶解します。調製した溶液を光から保護された2〜8°Cで保存する。溶液は最大3ヶ月間安定です。

2.サンプルの収集と保管

  1. プラズマ分離:
    1. 末梢血4 mL検体を22 Gシリンジによる静脈穿刺によりリチウムヘパリン採血管に採取し、1,600 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
    2. 上清を2 mLのセーフロックサンプルチューブに移します。
    3. 上清を16,000 x g で4°Cで10分間再遠心分離し、残留細胞を除去します。
    4. チューブの底にあるペレットを乱すことなく、上清を新しいセーフロックサンプルチューブに集めます。
    5. 得られた血漿をさらに使用するまで-80°Cで保存する。
      注:このアッセイでハイスループット結果を得るには、高品質のサンプルが必要です。血漿サンプルを使用する場合は、2回目の遠心分離を実行して残留細胞を除去します。サンプルの繰り返し解凍は避けてください。EDTAはDNase活性に影響を与えるため、抗凝固剤としてヘパリンを使用してください。
  2. 多形核好中球の単離
    1. 末梢血サンプルをリチウムヘパリン採血管に採取し、22Gシリンジで静脈穿刺します。
    2. 6 mLの血液を6 mLのワンステップ多形に重ね、チューブを1,000 x g で室温(RT)で45分間遠心分離します。
    3. 好中球を含む3番目のバフィーコート層を採取し、フェノールレッドを含まないRPMI-1640で400 x g でRTで10分間3回洗浄します。
    4. 好中球を6%熱不活化ウシ胎児血清を添加した2 mM L-グルタミンを含むフェノールレッドフリーRPMI-1640に再懸濁し、血球計算盤で顕微鏡視野内の細胞をカウントします。
      注:この方法は、トリパンブルー染料の除外によって評価されるように、95%を超える生存率で96%から98%の純度をもたらします。
  3. 多形核好中球の活性化とイン ビトロシス
    1. 新たに単離した多形核好中球を、6%熱不活化ウシ胎児血清を添加した2 mM L-グルタミンを含むフェノールレッドフリーRPMI-1640で1 × 105 細胞/mLに希釈し、35 mm培養皿に播種します。
    2. NETを誘導するには、多形核好中球を25 nM PMAで5%CO2/95%空気中、37°Cで4時間刺激します。
    3. 4時間のインキュベーション後、0.6 μg/mL DNase Iを培養皿に直接RTで15分間添加してNETを部分的に消化し、5 mM EDTAを加えてDNase I活性を停止させます。
    4. 合成したNETsを含む培地を回収し、400 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞残渣を除去した。
    5. 4つの健康なコントロールから上清を取得し、混合し、使用するまで-80°Cで保存します。
      注:4つの健康な対照から得られたDNase消化PMA刺激好中球は、NET標準1,14,15として使用されます。PBSで段階的に希釈したNET標準から検量線を作成し、希釈していないNET標準から得られた光学濃度(OD)値を100%NETとして割り当てます。

3. アッセイ方法

注:アッセイを実施するためのステップを以下に詳述する。

  1. 1日目
    1. 0.05 μgの抗体を含む希釈抗MPOまたは抗NE抗体の合計100 μLを、ブランクウェルを含むプレートの各ウェルに適用します。
      注:コーティングバッファーには、抗体が各ウェルの壁に均等かつスムーズに結合しない可能性があるため、いかなる種類の界面活性剤も含有しないでください。フック効果を防ぐために、コーティングタンパク質濃度は20 μg/mLを超えてはなりません。このレベルを超える濃度は、マイクロタイタープレート上の利用可能な部位のほとんどを飽和させるからです。タンパク質コーティング溶液の一般的な濃度範囲は2〜10 μg/mLです。予備実験では、MPOに対する特異的モノクローナル抗体の代わりに、希釈したiso型対照抗体IgGウサギをコーティングに使用します。NEに対する特異的モノクローナル抗体の代わりに希釈したiso型対照抗体IgG1マウスをコーティングに使用する。
    2. サンプルの蒸発を防ぐためにプレートを接着プラスチックカバーで覆い、捕捉抗体の結合を可能にするために4°Cで一晩インキュベートします。
  2. 2日目
    1. 希釈した抗体溶液をウェルから廃棄し、ウェルあたり300 μLの洗浄液をピペットで入れ、この洗浄手順を3〜4回繰り返します。
    2. ペーパータオルでプレートを軽くたたいて乾かして、余分なPBSを取り除きます。
    3. ELISAプレートの各ウェルを200 μLのブロッキングバッファーでブロックします。
    4. プレートを粘着性のプラスチックカバーでしっかりと覆い、RTで1.5〜2時間インキュベートしてウェルを塞ぎます。
    5. ブロッキング溶液をウェルから完全に廃棄し、ウェルあたり300 μLの洗浄溶液をピペットで移動し、この洗浄手順を3〜4回繰り返します。
    6. ペーパータオルでプレートを軽くたたいて乾かして、余分なPBSを取り除きます。
    7. ブランクウェルを除く各ウェルに合計25 μLの血漿または培地を塗布し、希釈剤として75 μLのPBSを加えて、最終容量を100 μLにします。ブランクウェルに100 μLのPBSを加えます。
    8. 次に、プレートを250 rpmのシェーカーに置いて、RTで10秒間サンプルを混合します。
    9. ブランクウェルを含む各ウェルに2 μLの100倍希釈DNase I(0.03 mg/mL)を塗布します(反応液中のDNase Iの最終濃度:0.6 μg/mL)。
    10. プレートを粘着性のプラスチックカバーで密封し、プレートを250rpmのシェーカーに置いて、RTで10秒間サンプルを完全に混合します。
      注:DNA消化の最適条件を評価するために、アッセイを開発する際に、COVID-19患者のMPO関連DNAを含むサンプルを0〜0.9 μg/mLのDNase IでRTで15分間インキュベートし、MPO用の特異的捕捉抗体または種に適合したiso型コントロール抗体でコーティングされたプレートを使用しました。
    11. サンプルをRTで15分間インキュベートします。
    12. 粘着性プラスチックカバーを取り外し、各ウェルに1 μLの0.5 M EDTAを塗布してDNase反応を停止させます。
    13. プレートを粘着性のプラスチックカバーで再シールし、250rpmのシェーカーに置いてRTで15秒間振とうします。
    14. 次に、プレートを4°Cで一晩インキュベートして、NETのタンパク質成分が捕捉抗体に付着できるようにします。
  3. 3日目
    1. 粘着性のプラスチックカバーを取り外し、ウェルから溶液を廃棄します。
    2. 溶液をウェルから完全に廃棄し、ウェルあたり300 μLの洗浄溶液をピペットで移動し、この洗浄手順を3〜4回繰り返します。
    3. 希釈したペルオキシダーゼ結合抗DNA検出抗体の合計100 μLを各ウェルに塗布します。
    4. プレートを粘着性のプラスチックカバーでしっかりと密封し、RTで1.5時間インキュベートします。
    5. ウェルから溶液を完全に廃棄し、ウェルあたり300 μLの洗浄溶液をピペットで移動し、この洗浄手順を3〜4回繰り返します。
    6. 残留溶液を慎重に取り除きます。
    7. 合計100 μLのABTS基質溶液を各ウェルに塗布し、プレートを粘着性プラスチックカバーで覆います。
    8. プレートを暗所でRTで20〜30分間シェーカーで250rpmでインキュベートします。
      注意: 目的のOD測定値が得られるまで、5分間隔でプレートを監視します。
    9. 合計50 μLの2 M硫酸を加えて反応を停止します。
    10. プレートの側面を慎重に軽くたたいてウェルの液体内容物を混合します。
    11. マイクロプレートリーダーの電源を入れ、コンピューターに接続します。
    12. コンピューターでソフトウェアアプリケーションを開きます。
    13. ステータス バーから、新しい実験を作成し、名前を付けます。
    14. プレート読み取り用に次のすべてのパラメーターを設定します: 読み取りタイプ、吸光度。読み取りモード、エンドポイント。波長、2;Lm-1, 405 nm;Lm-2, 490 nm;オートミックス&ブランキング前、オフ;プリリードプレート、オフ;自動キャリブレーション、オン;ストリップ、プレート全体を読み取る。列の波長の優先順位、列の優先順位。キャリッジスピード、ノーマル;および自動読み取り、オフ。
    15. 次に、サンプルが入っている96ウェルプレートを引き出しに入れて閉じます。
    16. 最後に、[ 読み取り ]ボタンを選択して、プレートがすぐに読み取られるようにします。
    17. マイクロプレートリーダーを用いて波長405nmにおける各ウェルの吸光度を読み取る(この段階では波長490nmを基準とする)。
    18. 全ての未知サンプルからアッセイ培地単独の吸光度値の自動減算を行い、データを保存する。
      注:段階的に希釈されたNET標準から得られた標準曲線を使用して、サンプル1,14,15中のNETの相対濃度を計算します。ここでは、最終結果を「MPOまたはNE-DNA複合体(NET標準に対する%)」として提示します。検出限界(LOD)は、標準偏差(SD)と検量線の傾き(S)からLOD = 3.3(SD/S)のように算出しました。

4. 統計

  1. 適切な統計分析ソフトウェアを使用して、すべての統計分析を実行します。ここではシグマプロットv14.5を使用しました。パーセンテージと連続変数は、ほとんどのパラメータの分布が歪んでいるため、四分位範囲の中央値として表示されます。
  2. ウィルコクソンランクサムテストを使用して、COVID-19患者と健康な対照の間の血漿MPO-DNAおよびNE-DNAレベルを比較します。相関分析を使用して、光学濃度とNET標準の割合の関係を調べます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法では、抗MPO、抗NE、および抗DNAモノクローナル抗体を含むサンドイッチELISAを使用して、MPO関連およびNE関連DNAを測定しました(図1)。この方法では、マイクロタイタープレートのウェルをMPO特異的またはNE特異的モノクローナル抗体でコーティングして、DNA関連MPOおよびDNA関連NE、ならびに非DNA関連MPOおよびNEを捕捉した。アッセイ内変動係数(CV)を計算するために、COVID-19患者と健康な対照から収集された30サンプルについて、同じプレート内で重複測定を実行し、%CVを重複測定の平均として計算しました。アッセイ間CV(すなわち、プレート間の一貫性)を計算するために、COVID-19患者と健康な対照者からの2種類のサンプルを10の異なるプレートで4倍に測定しました。このアッセイの特異性を実証するために、MPOおよびNEに対する特異的モノクローナル抗体の代わりにISO型対照抗体でコーティングされたプレートを使用して、さまざまな濃度のMPO-DNAおよびNE-DNA複合体をアッセイしました。アッセイの感度と直線性を計算するために、単離されたヒト好...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MPO-DNAまたはNE-DNA複合体を含むサンプルの初期インキュベーション中に、MPOまたはNEがキャプチャ抗体の1つの部位に結合するサンドイッチELISA法について説明しました。洗浄後、サンプルをペルオキシダーゼ関連抗DNAモノクローナル抗体と共にインキュベートすることによって「サンドイッチ」が完成する。未結合の二次抗体を除去した後、発色性ABTSペルオキシダーゼ基質を添加することにより結合ペルオキシダーゼコンジュゲートを検出し、405 nmで分光光度的に読み取ることができる可溶性最終生成物を生成します。良好な直線性と高いアッセイ間およびアッセイ内精度は、この論文およびその他1,2に記載されているELISAアッセイが信頼性が高く、臨床応用に実行可能であることを示しています。さらに、DNase処理したPMA刺激好中球の上清をNET標準の最大シグナルとして割り当てた場合、このELISAアッセイは半定量法として使用できます1,14,15。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この調査中に生成および/または分析されたすべてのデータは、この公開された記事に含まれています。著者は、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、原稿のレビューを支援してくれたHuq Muhammad Aminul博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1ステップポリモーフィングAccurate Chemical and Scientific CorporationAN221725ヒトの血液からのPMNの分離。
96ウェルマイクロタイタープレートサーモフィッシャーサイエンティフィック467466平底
ABTS緩衝液Sigma-Aldrich Merck11 204 530 001過ホウ酸ナトリウム、クエン酸、リン酸水素二ナトリウムが含まれています。 
ABTS錠Sigma-Aldrich Merck11 204 521 001 各錠剤には、5 mgのABTS基質と60 mgのビヒクル物質が含まれています。.
粘着性プラスチックカバー、AxygenThermo Fisher Scientific14222348
抗MPO抗体Sigma-Aldrich Merck 07-496-I2-8 °C. 1年間安定して保管します。宿主種はウサギです。
抗NE抗体、クローンAHN-10Sigma-Aldrich MerckMABS4612-8°Cで1年間安定して保存します。宿主種はネズミです。
ウシ血清アルブミン生物医学BR-220700081シ画分V.からのアルブミン2&ndashで保存;8°C.2年間安定しています。
DNase INew England BioLabsM0303M-20 >C
IgG、ウサギ、アイソタイプコントロールGENETEX, Inc.GTX35035溶液として2&ndashで保存します。8°C。
IgG1、マウスアイソタイプコントロール、クローンCi4Merck MABC002濃縮溶液として2&ndashで保存します。8°C。
リチウムヘパリン採血管ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー
マイクロプレートミキサー一つの企業としてNS-P
マイクロプレートリーダー分子デバイスSpectraMax 190 405°Cの波長を読み取ることができるマイクロプレートリーダー。490nmが使用できます。
マイクロプレートリーダーアプリケーションMolecular DevicesSoftMax pro
ペルオキシダーゼ標識抗DNA抗体、細胞死検出 ELISARoche Diagnostics1154467500 ボトル2。2&ndashで保管します。8°C.1年間安定しています。
ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテートSigma-Aldrich MerckP8139ヒト血液からのPMNの活性化。
リン酸緩衝液タカラバイオT9181室温で保存してください。6ヶ月間安定しています。
シグマプロット v14.5 Systat Software Inc. 米国カリフォルニア州
アジ化ナトリウム富士フイルム和光ケミカルズ190-14901室温で保存してください。
t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル富士フイルム和光ケミカルズ9002-93-1室温で保存してください。
ウ濃縮サンノゼ

参考文献

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