本稿では,活性化好中球由来の好中球細胞外トラップ残骸の2つの成分,ミエロペルオキシダーゼ抱合型DNAと好中球エラスターゼ抱合型DNA複合体を定量的に測定するための改変サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ法のプロトコルについて紹介する。
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方法論記事
改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)
この記事について
サマリー
要約
微生物などの特定の刺激により、好中球は好中球細胞外トラップ(NET)を放出しますが、これは基本的に、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)や好中球エラスターゼ(NE)などの顆粒タンパク質を含むDNAと細胞質および細胞骨格タンパク質で構成されるウェブ様構造です。近年NETへの関心が高まっていますが、臨床現場でNETを測定するための高感度で信頼性の高いアッセイ法はありません。本稿では、NETの特定の成分であり、NETの分解産物として細胞外空間に放出される循環NETの2つの成分であるMPO-DNAおよびNE-DNA複合体を定量的に測定するための改変サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイについて説明します。このアッセイでは、捕捉抗体としてMPOまたはNEに特異的なモノクローナル抗体を使用し、DNA特異的検出抗体を使用します。MPOまたはNEは、MPO-DNAまたはNE-DNA複合体を含むサンプルの初期インキュベーション中に、捕捉抗体の1つの部位に結合します。このアッセイは、良好な直線性と高いアッセイ間およびアッセイ内精度を示します。急性呼吸窮迫症候群を伴うCOVID-19患者16例に使用したところ、MPO-DNAおよびNE-DNAの血漿中濃度が健常対照から得られた血漿中よりも有意に高いことがわかりました。この検出アッセイは、ヒト血漿および培養上清中のNETsの特性を調べるための信頼性が高く、高感度で有用な方法です。
概要
本稿では、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いてミエロペルオキシダーゼ(MPO)と好中球エラスターゼ(NE)とDNA 1,2の複合体を検出することにより、体液中の好中球細胞外トラップ(NET)形成を定量する方法について概説します。NETは、好中球顆粒に由来する抗菌プロテアーゼで装飾されたDNA骨格で構成されています3,4。MPO-DNA複合体とNE-DNA複合体はどちらもNETの重要な特異的成分であり、NETの分解産物として細胞外空間に放出されます3,4。
NETは、抗菌防御における重要な生理学的役割3に加えて、血栓形成6の促進や敗血症7の悪化など、さまざまな病理学的効果4,5も持っています。そこで、最近はNETが注目されています。それにもかかわらず、....
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プロトコル
本研究はヘルシンキ宣言に準拠して実施され、愛知医科大学の治験審査委員会(2017-H341、2019-H137)で承認されました。書面によるインフォームドコンセントは各参加者から得られた。
1. 試薬調製
注:サンドイッチELISAアッセイを実施するために、試薬は以下のように調製される。
- コーティングバッファー:
- 0.1 mol/Lの炭酸水素塩緩衝液を作るには、無水炭酸ナトリウム10.6 g(分子量106 g/mol)と重炭酸ナトリウム8.4 g(分子量84 g/mol)を秤量します。
- ビーカー内の蒸留水約900mLに加えます。
- 必要量の希塩酸または水酸化ナトリウムを加えて、緩衝液のpHを9.6に調整します。
- pHメーターでpHを確認してください。
- 次に、必要な量の蒸留水を加えて、総容量1,000mLにします。
- この0.1 mol/L炭酸水素塩バッファーを4°Cの冷蔵庫に保管してください。
- ブロッキングバッファ:
- 137 ミリモル/L NaCl、8.1ミリモル/L Na 2 HPO 4、2.68 ミリモル/L KCl、および1.47 モル/L KH2PO 4(pH
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結果
この方法では、抗MPO、抗NE、および抗DNAモノクローナル抗体を含むサンドイッチELISAを使用して、MPO関連およびNE関連DNAを測定しました(図1)。この方法では、マイクロタイタープレートのウェルをMPO特異的またはNE特異的モノクローナル抗体でコーティングして、DNA関連MPOおよびDNA関連NE、ならびに非DNA関連MPOおよびNEを捕捉した。アッセイ内変動係数(CV)を計算するために、COVID-19患者と健康な対照から収集された30サンプルについて、同じプレート内で重複測定を実行し、%CVを重複測定の平均として計算しました。アッセイ間CV(すなわち、プレート間の一貫性)を計算するために、COVID-19患者と健康な対照者からの2種類のサンプルを10の異なるプレートで4倍に測定しました。このアッセイの特異性を実証するために、MPOおよびNEに対する特異的モノクローナル抗体の代わりにISO型対照抗体でコーティングされたプレートを使用して、さまざまな濃度のMPO-DNAおよびNE-DNA複合体をアッセイしました。アッセイの感度と直線性を計算するために、単離されたヒト好.......
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ディスカッション
MPO-DNAまたはNE-DNA複合体を含むサンプルの初期インキュベーション中に、MPOまたはNEがキャプチャ抗体の1つの部位に結合するサンドイッチELISA法について説明しました。洗浄後、サンプルをペルオキシダーゼ関連抗DNAモノクローナル抗体と共にインキュベートすることによって「サンドイッチ」が完成する。未結合の二次抗体を除去した後、発色性ABTSペルオキシダーゼ基質を添加することにより結合ペルオキシダーゼコンジュゲートを検出し、405 nmで分光光度的に読み取ることができる可溶性最終生成物を生成します。良好な直線性と高いアッセイ間およびアッセイ内精度は、この論文およびその他1,2に記載されているELISAアッセイが信頼性が高く、臨床応用に実行可能であることを示しています。さらに、DNase処理したPMA刺激好中球の上清をNET標準の最大シグナルとして割り当てた場合、このELISAアッセイは半定量法として使用できます1,14,15。
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開示事項
この調査中に生成および/または分析されたすべてのデータは、この公開された記事に含まれています。著者は、競合する利益がないことを宣言します。
謝辞
著者らは、原稿のレビューを支援してくれたHuq Muhammad Aminul博士に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1ステップポリモーフィング | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | ヒトの血液からのPMNの分離。 |
| 96ウェルマイクロタイタープレート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 467466 | 平底 |
| ABTS緩衝液 | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | 過ホウ酸ナトリウム、クエン酸、リン酸水素二ナトリウムが含まれています。 |
| ABTS錠 | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | 各錠剤には、5 mgのABTS基質と60 mgのビヒクル物質が含まれています。. |
| 粘着性プラスチックカバー、Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| 抗MPO抗体 | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | 2-8 °C. 1年間安定して保管します。宿主種はウサギです。 |
| 抗NE抗体、クローンAHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | 2-8°Cで1年間安定して保存します。宿主種はネズミです。 |
| ウシ血清アルブミン | 生物医学 | BR-220700081 | シ画分V.からのアルブミン2&ndashで保存;8°C.2年間安定しています。 |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | -20 >C |
| IgG、ウサギ、アイソタイプコントロール | GENETEX, Inc. | GTX35035 | 溶液として2&ndashで保存します。8°C。 |
| IgG1、マウスアイソタイプコントロール、クローンCi4 | Merck | MABC002 | 濃縮溶液として2&ndashで保存します。8°C。 |
| リチウムヘパリン採血管 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | ||
| マイクロプレートミキサー | 一つの企業として | NS-P | |
| マイクロプレートリーダー | 分子デバイス | SpectraMax 190 | 405°Cの波長を読み取ることができるマイクロプレートリーダー。490nmが使用できます。 |
| マイクロプレートリーダーアプリケーション | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| ペルオキシダーゼ標識抗DNA抗体、細胞死検出 ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | ボトル2。2&ndashで保管します。8°C.1年間安定しています。 |
| ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | ヒト血液からのPMNの活性化。 |
| リン酸緩衝液 | タカラバイオ | T9181 | 室温で保存してください。6ヶ月間安定しています。 |
| シグマプロット v14.5 | Systat Software Inc. 米国カリフォルニア州 | ||
| アジ化ナトリウム | 富士フイルム和光ケミカルズ | 190-14901 | 室温で保存してください。 |
| t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル | 富士フイルム和光ケミカルズ | 9002-93-1 | 室温で保存してください。 |
参考文献
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B.
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再版と許可
