方法論記事

蛍光共鳴エネルギー移動による 生体内 におけるヒストン修飾酵素と転写因子の相互作用の解明

DOI：

10.3791/64656

⸱

2022年10月14日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、生細胞におけるタンパク質相互作用を検出するためのイメージング技術です。ここでは、ヒストン修飾酵素と、植物組織における遺伝子発現のエピジェネティックな調節のためにそれらを標的プロモーターに動員する転写因子との関連を研究するためのFRETプロトコルが提示されています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、転写抑制または活性化のためにそれぞれヘテロクロマティックまたはユークロマティックヒストンマークを生成するヒストン修飾酵素(HME)によって一般的に影響を受けます。HMEは、転写因子(TF)によって標的クロマチンにリクルートされます。したがって、HMEとTFの間の直接的な相互作用を検出して特徴付けることは、それらの機能と特異性をよりよく理解するために重要です。これらの研究は、生体組織内で in vivo で実施された場合、生物学的により関連性があります。ここでは、植物ヒストンデユビキチナーゼと植物転写因子との間の植物葉における相互作用を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて可視化するためのプロトコルを記述し、互いに<10nm以内にあるタンパク質分子間の複合体の検出を可能にする。FRET技術の2つのバリエーションが提示される:SE-FRETおよびAB-FRET(アクセプター漂白)は、エネルギーがドナーからアクセプターに非放射的に伝達されるか、アクセプターの光退色時にドナーによって放射的に放出される。SE-FRETとAB-FRETの両方のアプローチは、 プランタ内の他のタンパク質間の他の相互作用を発見するために容易に適応させることができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物ヒストンデユビキチナーゼは、ヒストンの翻訳後修飾、特にモノユビキチル化マークを消去することにより、遺伝子発現を制御する上で重要な役割を果たします1。これまでのところ、OTLD1はシロイヌナズナ2,3において分子レベルで特徴付けられる数少ない植物ヒストンデユビキチナーゼの1つである。OTLD1は、H2Bヒストン分子からモノユビキチン基を除去し、それによって標的遺伝子クロマチン4,5におけるH3ヒストンのユークロマティックアセチル化およびメチル化修飾の除去または付加を促進する。さらに、OTLD1は、別のクロマチン修飾酵素であるヒストンリジン脱メチル化酵素KDM1Cと相互作用して、標的遺伝子の転写抑制に影響を及ぼす6,7。

ほとんどのヒストン修飾酵素はDNA結合能力を欠いているため、標的遺伝子を直接認識することはできません。1つの可能性は、これらの酵素に結合し、それらをクロマチン標的に導くDNA結合転写因子タンパク質と協力することです。具体的には、植物では、いくつかの主要なヒストン修飾酵素(すなわち、ヒストンメチルトランスフェラーゼ8,9、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ10、ヒストンデメチラーゼ11、およびポリコーム抑制複合体12,13,14)が転写因子によってリクルートされることが知られている。この考えと一致して、最近、OTLD1と転写因子LSH1015との特異的なタンパク質間相互作用に基づく、標的プロモーターへのOTLD1リクルートメントの1つの可能なメカニズムが提案された。

LSH10は、中枢発生調節因子として機能する植物ALLOG(シロイヌナズナLSH1およびOryza G1)タンパク質のファミリーに属する16、17、18、19、20、21、22。ALOGタンパク質ファミリーのメンバーにDNA結合モチーフ23が含まれ、転写調節22、核局在19、およびホモ二量体化24の能力を示すという事実は、LSH10を含むこれらのタンパク質が転写のエピジェネティック調節中に特異的転写因子として作用する可能性があるという考えをさらに裏付けるものです。in vivoでのLSH10-OTLD1相互作用の特性評価に使用される主な実験技術の1つは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)15です。

FRETは、生細胞内のタンパク質同士25<10nm以内の近距離相互作用を直接検出するイメージング技術です。FRETアプローチ26には、増感発光(SE-FRET)(図1A)とアクセプター漂白(AB-FRET)(図1B)の2つの主要なバリエーションがあります。SE-FRETでは、相互作用するタンパク質(一方はドナー蛍光色素(例えば、緑色蛍光タンパク質、GFP)でタグ付けされ、もう一方はアクセプター蛍光色素(例えば、単量体赤色蛍光タンパク質、mRFP27,28)でタグ付けされ、励起状態エネルギーをドナーからアクセプターに非放射的に伝達する。この転送中に光子が放出されないため、アクセプターと同様の放射発光スペクトルを持つ蛍光シグナルが生成されます。AB-FRETでは、アクセプターが光退色によって永久に不活性化され、ドナーから伝達された非放射エネルギーを受け取ることができない場合、ドナーの放射放出の上昇に基づいてタンパク質相互作用が検出され、定量化されます(図1)。重要なことに、FRET蛍光の細胞内位置は、細胞内の相互作用タンパク質の局在を示すものである。

FRETを生体組織に展開し、相互作用タンパク質の細胞内局在を決定すると同時にこの相互作用自体を検出することができるため、FRETはin vivoでのタンパク質間相互作用の研究および初期特性評価に最適な技術となっています。同等のインビボ蛍光イメージング方法論である二分子蛍光相補(BiFC)29,30,31,32は、良好な代替アプローチであるが、FRETとは異なり、BiFCは自己蛍光BiFCレポーター33の自発的な集合により偽陽性を生じる可能性があり、そのデータの定量化はそれほど正確ではない。

本稿では、SE-FRETとAB-FRETの両方の技術の実装における成功事例を共有し、植物細胞におけるOTLD1とLSH10の相互作用を調査するための展開のプロトコルを紹介します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ニコチアナベンサミアナ、 アグロバクテリウムツメファシエンス 株EHA105、またはGV3101を本研究に使用しました。

1. FRETベクトル構築

  1. ドナー/アクセプターFRETペアの蛍光タグを選択します。
    1. pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28(材料表参照)からのEGFPを使用して、ドナーベクターを生成します。
    2. pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1( 材料表参照)からのmRFPを使用して、アクセプターベクターを生成します。
  2. Gateway組換えクローニングシステム35などの部位特異的組換えクローニング技術34を使用して、ドナー/アクセプターFRET構築物を生成する。
    1. 目的のタンパク質36 (すなわち、シロイヌナズナ OTLD1 および LSH10)のコード配列を増幅する15。
      注:相互作用するタンパク質の1つのホモログを表すが、相互作用を示すとは予想されないネガティブコントロールを利用することもお勧めします。OTLD1-LSH10相互作用研究では、OTLD1を認識しないLSH10、LSH4のホモログを使用しています。OTLD1、LSH10、およびLSH4 cDNAは、 表1にリストされているプライマーを用いたPCRによって増幅されます。
    2. 部位特異的組換えクローニング技術34によってOTLD1、LSH10、およびLSH4をエントリーベクターpDONR207にクローニングする。
    3. ゲートウェイLRクローナーゼII(材料表を参照)を使用して、LSH10およびLSH4をpDONR207からバイナリ宛先ベクターpPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1に転送し、バイナリドナーコンストラクトp35S::LSH10-GFP(テスト済みコンストラクト)およびp35S::LSH4-GFP(ネガティブコントロール)を生成します。
    4. 同じ市販の酵素(ステップ1.2.3)を使用して、 OTLD1 をpDONR207からバイナリ宛先ベクターpPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1に転写し、バイナリアクセプターコンストラクトp35S::OTLD1-mRFP(テスト済みコンストラクト)を生成します。
    5. 表1に記載のプライマーを用いてpPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1から36 mRFPをPCR増幅し、組換えクローニング技術によりpDONR207にクローニングし、次いでLRクロナーゼIIを用いてmRFPをpPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1に転写し、バイナリ融合コンストラクトp35S::mRFP-GFP(ポジティブコントロール)を生成します。
  3. ドナーおよびアクセプター構築物のアグロバクテリウムへの形質転換を行う。
    1. 標準プロトコル37を使用して調製した、または市販品を入手した アグロバクテリウム・ツメファシエンス 株EHA105またはGV3101のコンピテントセルの培養液100 μLに、ステップ1.2.3-1.2.5の各プラスミド1 μgを追加し、37 °Cで5分間インキュベートします。
    2. 1 mLのLB培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、および1%NaCl; 材料表を参照)をコンピテントセル混合物に加え、200rpmおよび28°Cで1.5時間攪拌します。室温で1分間、3,000 × g で遠心分離して細胞を回収します。
    3. ピペッティングにより細胞を0.1 mLのLB培地に再懸濁し、適切な抗生物質(0.01%スペクチノマイシンおよび0.005%リファンピシンなど)を添加したLB寒天上に広げ ます。28°Cで2日間生育させる。
    4. 個々のコロニーを選び、適切な抗生物質を添加した1 mLのLBブロスにそれぞれ別々に接種します。
    5. 細胞を28°Cで24時間増殖させ、培養液0.2 mLを新しいチューブに移します。室温で30秒間、10,000 × g で遠心分離して細胞を回収します。
    6. アグロバクテリウム菌細胞38 からプラスミドを単離するための標準プロトコルによってプラスミドDNAを抽出し、抽出したDNAを30 μLの水に再懸濁します。目的のプラスミドを保持するコロニーを特定するには、 表1にリストされている遺伝子特異的プライマーを使用したPCRの鋳型として2 μLのDNA調製物を使用します。同定した培養液0.7 mLをグリセロール0.3 mLと混合し、-80°Cで保存します。

2.アグロインフィルトレーション

  1. ニコチアナベンサミアナ植物を育てます。
    注:実験全体を通して、すべての植物は健康でなければなりません。
    1. 湿った土を高密度で含む鉢に N.ベンサミアナ の種をまき、育てます。
    2. 植え付けた種子を、真正植物の直径が0.5 cmに達するまで、150〜170 μmol / m2秒の光強度で16時間の光と8時間の暗サイクルで23°Cに設定された成長チャンバーに保管します。
    3. 苗をより大きな鉢に移し、それらが同じパラメータで同じ部屋で成長することを可能にする。
      注:植物は、最大の葉の直径が5〜7 cmの場合、通常は4〜5週間以内に、農業浸透の準備ができています。若すぎる小さな植物では、アグロインフィルトの影響はFRET分析には深刻すぎます。
  2. アグロ浸潤のために細菌細胞を準備します。
    1. FRETコンストラクトを含む各アグロバクテリウムコロニーを、適切な抗生物質(ステップ1.3.3)と150 μMアセトシリンゴンを添加した5 mLのLB培地で28°Cで一晩増殖させます( 材料の表を参照)。
    2. 細胞を3,000 × g で室温で5分間遠心分離します。
    3. 細胞をアグロイン浸潤バッファー(10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μMアセトシリンゴン)にOD600 = 0.5まで再懸濁します。
    4. 適切なコンストラクトを保持するセル間で、再懸濁されたセルを1:1 v / v比で結合します(ステップ2.2.5)。
    5. 二重構築物の農業浸透の場合は、2つの培養物のアリコートを混合し、単一構築物の農業浸透の場合は、同じ培養物のアリコートを混合します。
      1. 試験タンパク質:OTLD1-mRFP + LSH10-GFP(p35S::OTLD1-mRFPおよびp35S::LSH10-GFPコンストラクトを有する細菌)。
      2. 陰性対照:OTLD1-mRFP + LSH4-GFP(p35S::OTLD1-mRFPおよびp35S::LSH4-GFPコンストラクトを保持する細菌)。
      3. ネガティブコントロール:LSH10-GFP + 遊離mRFP(p35S::LSH10-GFPおよびpPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1コンストラクトを保持する細菌)。
      4. ポジティブコントロール:mRFP-GFP(p35S::mRFP-GFPコンストラクトを有する細菌)。
    6. 細胞を28°Cで0.5〜1時間インキュベートします。
  3. アグロ浸潤を行います。
    1. 細菌培養物を1 mLのニードルレスシリンジに入れます。
    2. シリンジのノズルを、完全に拡張した N. benthamiana の葉の腹軸側にそっとしっかりと押し付け、手袋をはめた指で葉をアダキシャル側に保持します。
    3. 葉の上に最大4つのスポット、植物ごとに3つの葉、細菌培養ごとに2つまたは3つの植物を浸透させます。クロスコンタミネーションを防ぐために、サンプル間で手袋を交換してください。
    4. アグロ浸潤植物を、ステップ2.1.2で説明したのと同じ条件下で、同じ成長チャンバー内で24時間から36時間維持します。農業浸潤植物を36時間以上保持すると蛍光シグナルが低下するため、保管しないでください。

3. 共焦点顕微鏡

  1. 蛍光可視化用の顕微鏡スライドを準備します。
    1. 浸潤の24〜36時間後、かみそりの刃を使用して、各農業浸潤葉を静脈間の小片(2 mm x 4 mm)に切ります。
    2. 葉片をスライドガラスの上に置き、葉の表面を上に向けて置きます。葉の部分に水滴を置き、カバーガラスで覆います。カバーガラスを軽くたたいて気泡を取り除きます。
    3. 顕微鏡とレーザーの電源を入れます( 材料表を参照)。スライドを顕微鏡ステージホルダーに配置して、特定のFRETパラメータでイメージングします(手順3.2および3.3)。
    4. 10倍の対物レンズを使用して観察を開始し、GFPとmRFPの両方のシグナルを示す細胞を特定し、その後の詳細な観察に40倍の対物レンズを使用します。
      注:重要なことに、SE-FRETとAB-FRETは通常同じ組織サンプルに対して実行され、SE-FRETおよびAB-FRET観察でそれぞれオン/オフを切り替えるFRETチャネルを除いて、同じチャネル設定(ステップ3.2)を使用できます(ステップ3.2.2.3および3.3.1)。
  2. SE-FRETのパラメータを設定します(図1A)。
    1. 多次元取得 (MDA) ツールを開きます。
    2. 同じ視野内に3つの共焦点チャネルのセットを確立します(補足図1)。
      1. 405 nm励起レーザーと400-597 nm発光フィルターを使用して、ドナー蛍光色素の励起と発光のためのドナーチャネル(GFPチャネル)を設定します。
      2. 561 nm励起レーザーと400-597 nm発光フィルターを使用して、アクセプター蛍光色素の励起と発光のアクセプターチャネル(mRFPチャネル)を設定します。
        注:mRFPの発光フィルタは、mRFP信号を597〜617nmのFRET信号から分離し(ステップ3.2.2.3)、FRETに依存しないmRFP放射を低減するために400〜597nmに設定されました。
      3. 405 nm励起レーザーと597-617 nmの発光フィルターを使用して、ドナーの励起とアクセプター蛍光色素の発光用のFRETチャネルを設定します。
    3. ドナー励起強度を最小レベルに設定して、光退色を回避しながらFRETを観察し、SE-FRET効率を低下させます。
      注意: この励起強度は、光退色を避けるためにFRET手順を実行する前に実験的に選択されます。葉の厚さ、年齢、過剰発現後の時間によって異なります。
    4. ドナーを励起し、アクセプターの予想される蛍光シグナルを含む細胞をスキャンします。
    5. 目的の蛍光シグナルを含む領域を選択します。
    6. スナップボタンを押してSE-FRET画像シーケンスを取得します。
      1. 画像 mRFP-GFP構築物を発現する細胞(ポジティブコントロール)を最初に10-15細胞;フォーカス、ズーム、およびスマートゲインのパラメータを調整して、キャプチャする対象領域に焦点を合わせます(補足図2)。
      2. 同じ設定を用いて、それぞれがOTLD1−mRFP、遊離mRFP、LSH10−GFP、またはLSH4−GFPを別々に発現する10〜15個の細胞を画像化する。
        注:これらの画像は、アクセプターとドナーのスペクトルブリードスルー(SBT)値を決定するためにFRETデータ分析(ステップ3.4.1)に使用されたImageJの「PixFRET」プラグイン( 材料表を参照)によって取得されます。これらの画像は、OTLD1-mRFP + LSH10-GFP、OTLD1-mRFP + LSH4-GFP、およびLSH10-GFP + 遊離mRFPタンパク質ペアのSE-FRET画像を生成するためにソフトウェアによって使用されます(ステップ3.2.6.3)。
      3. また、同じ設定を用いて、OTLD1-mRFP + LSH10-GFP、OTLD1-mRFP + LSH4-GFP、およびLSH10-GFP + 遊離mRFPタンパク質ペアを共発現する10-15細胞を画像化した。
  3. AB-FRETのパラメータを設定します(図1B)。
    1. SE-FRETに設定されたドナーおよびアクセプターチャネルパラメータを使用しますが(ステップ3.2.2)、FRETチャネルをオフにします。
    2. アクセプターの光退色(mRFP)のパラメータを設定します(補足図3)。
      1. 漂白が5枚の画像の後に開始されることを確認してください。各領域ブリーチに対して200回の反復を許可します。561nmで100%のレーザー強度を維持します。
      2. 45秒の漂白時間を維持します。400 Hzで512 x 512ピクセルのスキャン速度を確保してください。
    3. 漂白する細胞の領域を描画します。例えば、核相互作用の場合、関心領域は細胞核39の全領域の周りに描かれる。
    4. [実験の開始]ボタンを押して漂白をアクティブにします。この機能を有効にすると、光退色が実行され、AB-FRET画像シーケンスが取得されます。
  4. FRET データを分析します。
    1. SE-FRETデータを解析するには、ImageJソフトウェア用の「PixFRET」プラグインを使用して、SBT40 を差し引いた後のSE-FRET効率の補正画像を生成します(ステップ3.2.6.2)。
    2. AB-FRETデータを解析するために、下記式41を用いて、mRFP光退色後のGFP放出の増加率として%AB-FRETを計算する:%AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre)/GFPpre] x 100(ここで、GFPポストはmRFP光退色後のGFP放出、GFPpreはmRFP光退色前のGFP放出である)。
    3. FRET画像を確認するときは、FRETシグナルの細胞内局在に注意してください。
      注:多くの場合、これらの細胞コンパートメント(核、葉緑体、ERなど)は簡単に識別でき、FRET技術の追加の利点として、相互作用するタンパク質の生物学的機能への重要な手がかりを提供します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図2 は、細胞核を3つのチャネル(すなわち、ドナーGFP、アクセプターmRFP、およびSE-FRET)に同時に記録したSE-FRET実験の典型的な結果を示しています。これらのデータは、擬似カラースケールでコード化されたSE-FRET効率の画像を生成するために使用されました。このスケールでは、青から赤への移行は、0%から100%へのタンパク質間近接性の尺度であるFRET効率の増加に対応します。この代表的な実験では、SE-FRETシグナルを細胞核で記録し、LSH10とOTLD1の共発現後の強度は、mRFP-GFPの発現後に観察されたものと同等でした(すなわち、ポジティブコントロール)。陰性対照(すなわち、OTLD1-mRFPとLSH4-GFPの共発現または遊離mRFPとLSH10-GFPの共発現)ではSE-FRETは観察されなかった。

LSH10-OTLD1相互作用は、AB-FRETを用いて定量化した。この目的のために、ドナーGFP蛍光を、ドナーおよびアクセプター蛍光測定値のフォトブリーチング時系列としてアクセプターmRFPの...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このFRETプロトコルはシンプルで再現が簡単です。また、最小限の供給投資を必要とし、多くの近代的な研究所で標準装置を利用しています。具体的には、5つの主要な技術的特徴がこの手順の多様性を区別します。まず、FRETコンストラクトは、従来の制限酵素ベースのクローニングと比較して使いやすく、正確な結果を生成し、時間を節約するクローニングアプローチである部位特異的組換えを使用して生成されます。第二に、 N. benthamiana 植物は成長が簡単で、比較的大量の組織を生産し、ほとんどの実験室で利用可能です。第三に、アグロインフィルトは、送達された構築物の一時的な発現をもたらし、したがって、トランスジェニック植物の生産に必要な数ヶ月と比較して、比較的短い期間(すなわち、24〜36時間)以内にデータを生成する。第四に、共アグロインフィルトレーションによって目的のコンストラクトの異なる組み合わせを送達する能力は、任意のタンパク質間の相互作用の試験を可能にする。最後に、SE-FRETとAB-FRETの両方は、レーザーチャネル設定の1つをオン/オフするだけで、同じ組織サンプルに対して順番に実行できます。しかしながら、マイクロボンバード...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利益相反は宣言されていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VCの研究室での作業は、NIH(R35GM144059およびR01GM50224)、NSF(MCB1913165およびIOS1758046)、およびBARD(IS-5276-20)からVCへの助成金によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトシリンゴン (3′,5′-ジメトキシ-4&プライム;-ヒドロキシアセトフェノン)Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto AgarBD Biosciences#214010
Bacto tryptonBD Biosciences#211705
Bacto yeast extractBD Biosciences#212750 
共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)ツァイスLSM900同様の機能を備えた任意のCLSMが適しています
EHA105VWR104013-310私たちは、シトフスキー細菌ラボのストックコレクション
ゲートウェイBPクローナーゼII のInvitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296I.Citovsky bacteria labのストックを使用しています
ストック ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana seedsHerbalistics PtyRA4 or LAB私たちは、Citovsky seed labのストックコレクション
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 N/A参考文献 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1該当なしpPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 コンストラクト (参考文献 15, 28 参照) に基づいて生成
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 N/ApPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 コンストラクト
RifampicinSigma-Aldrich#R7382-5G
SpectinomycinSigma-Aldrich#S4014-5G
注射器(針なしBD309659
CLSM イメージング用ソフトウェアZeissZEN 3.0 バージョンソフトウェアは、使用する CLSM と互換性がある必要があります
在庫を使用しています。)

参考文献

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