虚血性脳卒中のウサギモデルにおける血圧のリアルタイムモニタリングと調節

サマリー

継続的な動脈血圧記録により、さまざまな血行動態パラメータの影響を調査できます。このレポートは、脳卒中の病態生理学、さまざまな血行動態因子の影響、および新しい治療アプローチの評価を決定するための虚血性脳卒中の大型動物モデルにおける継続的な動脈血圧モニタリングの適用を示しています。

要約

絶対値とその変動性の両方の観点からの血圧の制御は、虚血性脳卒中患者の転帰に影響を与えます。しかし、人間のデータに固有の法外な制限のために、悪い結果につながるメカニズムを特定したり、これらの影響を軽減できる対策を評価したりすることは依然として困難です。このような場合、動物モデルを利用して、疾患の厳密で再現性のある評価を行うことができます。ここでは、血圧に対する調節の影響を評価するために、継続的な血圧記録で増強された、ウサギの虚血性脳卒中の前述のモデルの改良を報告します。全身麻酔下では、大腿動脈は外科的切断によって露出し、動脈鞘を両側に配置します。透視視覚化とロードマップガイダンスの下で、マイクロカテーテルは脳の後循環の動脈に進められます。血管造影は、対側椎骨動脈を注入して標的動脈の閉塞を確認することによって行われる。閉塞カテーテルが一定の持続時間所定の位置に留まると、血圧が継続的に記録され、機械的または薬理学的手段による血圧操作の厳密な滴定が可能になります。閉塞間隔の完了時に、マイクロカテーテルを取り外し、動物を全身麻酔下で所定の長さの再灌流の間維持する。急性期研究では、動物は安楽死させられ、斬首されます。脳を採取して処理し、光学顕微鏡下で梗塞体積を測定し、さらにさまざまな組織病理学的染色または空間的トランスクリプトーム解析で評価します。このプロトコルは、虚血性脳卒中中の血圧パラメータの影響に関するより徹底的な前臨床試験に利用できる再現可能なモデルを提供します。また、虚血性脳卒中患者のケアを改善する可能性のある新しい神経保護介入の効果的な前臨床評価を促進します。

概要

虚血性脳卒中(IS)は、世界中の主要な死因および長期障害であり、その有病率は社会の高齢化とともに増加すると予測されています¹。急性期介入と二次予防戦略は大幅に進歩しましたが、補助的な神経保護療法は急速に進んでいません2,3,4,5,6,7。脳卒中の病態生物学については、治療法が有効であることが証明されるかどうかのメカニズムが十分に理解されていないため、さらなる研究が必要です。これは主に脳卒中患者集団の不均一な性質によるものであり、その多くは分析を混乱させる多数の併存疾患を持っています¹。研究における限界の1つの要因は、ヒトの中枢神経系から組織をサンプリングすることの法外な罹患率のために、生物医学研究のゴールドスタンダードである組織レベルのデータがないことです。具体的には、生きている人間の血管組織の採取は脳卒中を引き起こすため、血管組織は通常、剖検でのみ得られますが、これは一般集団の代表性が低く、診断が伴う高齢患者のより進行した疾患に偏っています。

そのような場合、十分なヒトデータを活用できない場合、動物モデルはデータのギャップを埋めることができます。研究に使用されるほとんどの大型動物は、脳動脈への直接血管内アクセスを妨げるレテミラビルを有する有蹄動物であるため、脳卒中の大型動物モデルは限られています8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.ウサギは、頭蓋内病理⁸、^9、10、11、12、¹³、^14、15、^16、17を含む心血管疾患の調査に長い使用歴を有する。ウサギは血管内カテーテル法に十分な大きさであり、他の大型哺乳類の頭蓋内アクセスを妨げるレテミラビルを欠いているため、脳血管疾患の理想的なモデルを提示します9,15,16,17。それらは以前、マイクロカテーテル¹⁸による頭蓋内動脈の正確で適切に制御された閉塞によるISの調査に特に使用されてきました。

血圧(BP)コントロールは、絶対BPまたはBP変動性(BPV)の調節の両方を介して、動脈血圧が平均BPを中心に変動する程度であり、BPまたはBPVの制御が不十分な患者の転帰が悪化したと報告された後、IS患者の新たな潜在的な治療標的です19,20,21,22.変化がIS患者の転帰不良にどのようにつながるかについての機構的調査は不足しています。これは、組織レベルのデータを取得し、ヒトで適切に制御された分析を実行することが難しいことに一部起因しています。BPまたはBPVを調節する介入をテストするには、動物モデルを利用してこれらの制限を克服する必要があります。この報告では、^BP18の継続的な動脈内測定と組み合わせて後大脳動脈の制御された閉塞を使用して、以前に検証されたISのウサギモデルのペアリングの成功について説明します。ここで紹介する方法は、BPの正確な測定と制御を達成できるシステムに検証され再現可能な脳卒中モデルを適用することにより、脳卒中病態生理学への以前のアプローチを改善します。この洗練されたモデルでは、梗塞の負担は、採取された脳の手続き後の組織病理学的染色で評価することができ、さまざまな染色や空間的トランスクリプトミクスなどのより高度な分析にも適しています。さらに、閉塞した後循環動脈は、生存手順後の罹患率分析のために評価されるように選択することもできます。

プロトコル

このプロトコルは、施設動物管理および使用委員会(ユタ大学IACUCプロトコル番号21-09021)によって承認されています。成熟したニュージーランドの白ウサギは商業ベンダーから入手します。

1.動物の獲得

1. 施設のプロトコルに従って到着後必要な期間動物を順応させ、標準的なチャウチャウ食でビバリウムに動物を社会的に収容します。当院での順応期間は2週間です。

2.麻酔とモニタリング

1. ブプレノルフィン(0.03 mg / kg)の筋肉内注射で全身気管内麻酔を誘発し、約30分後にケタミン(25-35 mg / kg)とキシラジン(3 mg / kg)の筋肉内注射を行います。.気管内チューブを介して投与される酸素中の1%〜5%イソフルランで麻酔を維持します。.誘導中は、100%FiO 2を使用し、100%SpO₂を維持する最も低いFiO₂まで滴定します。
   注:脳卒中が脳卒中誘発プロセスの唯一の混乱になるように、動物による動きを防ぐために中断のない麻酔が必要です。これはまた、不十分な麻酔から生じる可能性のある興奮に起因するBPのスパイクを防ぎます。一貫した酸素化は、同等の脳卒中を達成するために制御するためにも重要です。これらの施策は、以下の代表的な結果に計上しています。
2. 足の指に有害な刺激を加えて、適切な麻酔深度を確認します。乾燥を防ぐために目に獣医の目の軟膏を塗ります。
3. 耳に置いたパルスオキシメータで酸素飽和度を監視します。耳介静脈の血管カテーテルで静脈内アクセスを取得します。縫合糸または接着剤の透明フィルムドレッシングで固定されていることを確認してください。血管れん縮を軽減するには、麻酔導入後、0.25インチの経皮ニトログリセリンを耳の内側に置きます。
4. メンテナンス液に生理食塩水を1 cc / kg / hの速度で供給します。食道温度プローブを配置して体温を監視します。動物の下に暖かい毛布を置いて、必要に応じて正常温熱療法(33-37°C)を維持します。

3.手術の準備

1. ウサギを透視検査と互換性のある手術台の上に仰臥位に置きます。ヘッドを伸ばして、後続の血管造影ビューの位置決めを最適化します。ウサギは、計装後に血管痙攣を起こしやすい絶妙に敏感な動脈を持っています。
2. 電気バリカンを使用して両方の鼠径部から毛皮を取り除きます。次に、両側大腿動脈パルスを触診し、両側にトリミングして適切なクリアランスを確認します。クロルヘキシジンとアルコールのスクラブで皮膚を準備してから、通常の滅菌方法で皮膚をドレープします。
3. 両側鼠径部に2 mLの1%リドカインを皮下注射することにより、局所麻酔を投与します。.リドカインが注射された部位に10番の刃で5cmの外科的切開を行います。鈍的解離を使用して神経血管束を露出させます(図1A)。必要に応じて、切開部を伸ばして、アクセスに十分な大きさの動脈セグメントを適切に露出させます。
4. 神経血管束を単離したら、血管痙攣を防ぐために動脈に1%リドカインを数滴滴下します。鉗子を使用して動脈を静脈および隣接する神経から穏やかに分離します。静脈の薄い壁と比較した筋肉壁の特徴的な外観によって動脈を識別します。動脈はより明るい血液を含み、静脈はより暗い血液を含むでしょう。

4.動脈アクセス

1. 動脈が分離されたら、直角鉗子を血管の下に通します。器具で2つの血管ループをつかみ、動脈の下にそっと通します。露出した容器の上流端と下流端にそれぞれ1つずつ配置します。
2. 血管ループを引っ張って動脈を穏やかな牽引にさらします。この時点で、血管に残留組織がないか検査し、穏やかな解剖で血管を取り除きます(図1B)。これにより、アクセスが成功する可能性が高くなります。
3. アクセスには22G血管カテーテルを使用してください。カテーテル自体を内側の針の上に少し進めると、完全に装着されたときにくっつくことが多く、アクセスの試行中にデバイスが外れる可能性があります。
4. 血管を解剖し、血管カテーテルを準備した後、再び血管にリドカインを滴下します。動脈は目に見えて拡張し、セルディンガー技術を使用してシースへのアクセスと配置が成功する可能性が高くなります。
5. 下流の血管ループに穏やかな牽引力を加え、流出を減らして動脈を充血させます。これにより、アクセス試行のために船舶も安定します。血管カテーテルの針を露出した動脈セグメントの中央にゆっくりと進めます(図1C)。血管カテーテルとそのハブのチャンバーに閃光が見られたら、カテーテルを針を越えて動脈内腔に進めます。
6. アクセスの試みが失敗した場合は、上流の血管ループに牽引力を加えて止血を実現します。血管カテーテルを生理食塩水で洗い流し、追加の試みのために導入針に交換します。
7. 血管カテーテルが血管内のハブに正常に配置されたら、Copeマイクロワイヤーを血管カテーテル内腔を通って大動脈に進めます(図1D)。ワイヤー上の血管カテーテルを取り外し、5フレンチスリムな親水性シースと交換します(図1E)。
8. 三方弁を開いて、サイドアームチューブを介した動脈血の戻りを確認します。シースを0.9%生理食塩水で洗い流し、フラッシング中にバルブを閉じロックします。
9. 追加の3-0シルク縫合糸でシースハブを隣接する皮膚に固定します。反対側の大腿動脈に対してこのプロセスを繰り返します。より高い効率を達成するために、2人のオペレータがそれぞれ1つの動脈に焦点を合わせながら同時に作業することができます。

5.頸部脳血管造影と頭蓋内アクセス

1. 透視下で、左大腿骨シースに挿入された0.035インチのグライドワイヤーの上に4フレンチグライドカテーテルを進めます。グライドカテーテルの先端を左椎骨動脈近位に配置します。ワイヤーを取り外し、カテーテルをヘパリン化0.9%生理食塩水で洗い流します。
2. 低倍率でヨード化造影剤を左椎骨動脈に注入し、頭頸部全体を可視化して血管造影を行います(図2A)。血管系全体を視覚化するためにクレッシェンドする低圧注射から始めて、造影剤溶液の注入を調整します。
   注:この血管造影画像は、適切な椎骨動脈を効率的に選択するためのロードマップガイダンスに使用されるため、右椎骨動脈への逆流を視覚化するのに十分な注射が必要です。血管痙攣またはより深刻な傷害を最小限に抑えるには、穏やかな注射が必要です。さらに、過度の力や体積は、深い麻酔下でも動物から一時的な動きを引き起こす可能性があります。
3. 左椎骨注射の場合は、通常の生理食塩水で希釈した50%の造影剤を、3 ccシリンジからの穏やかなクレッシェンドで注入します。通常、1〜2 ccの希薄なコントラストを注入するだけで十分です。右椎骨動脈から右鎖骨下動脈への逆流をチェックして、適切な注射量を決定します。この注射の間、後大脳動脈と上小脳動脈にも注意してください、そのうちの1つはマイクロカテーテルで閉塞するターゲットになります。
4. 2.4インチのマイクロワイヤーを備えた0.010フレンチフロー指向マイクロカテーテルを準備します。マイクロワイヤーの先端にC字型を作ります。ロードマップのガイダンスの下で、4フレンチグライドカテーテル内のマイクロカテーテルを右大腿骨シースからワイヤーを越えて右椎骨動脈に進めます。カテーテル誘発血管れん縮の傾向があるため、デバイスの操作時間と実行されるカテーテルの試行回数を最小限に抑えます。
5. マイクロカテーテルを右椎骨動脈の頸部を通して進めます。V2セグメントからV3セグメントへの急旋回を最適に通過させるには、マイクロワイヤーがその先端の近位に戻った状態で、マイクロカテーテルを単独で進めます。この時点でマイクロワイヤーでリードすると、椎骨動脈の小さな側枝が選択されることが多く、実質的な血管れん縮の原因となる可能性があります。
6. V2からV3への急旋回を通過した後、マイクロカテーテルはしばしば近位脳底動脈に容易に通過する。この時点で、マイクロワイヤーを進め、目的の後大脳動脈または上小脳動脈を選択します。マイクロカテーテル注射は、頭蓋内動脈の脆弱な性質を考えるとお勧めしません。
7. マイクロカテーテルをマイクロワイヤーを介してターゲット動脈に進めます。近位位置は、その原点での角度のために、通常、後方で最も安全に通信できるため、選択してください。上小脳動脈では、より深い位置が可能です(図2B)。
8. 左椎骨動脈カテーテルを高倍率で頭部に注入して血管造影を繰り返し、標的動脈の閉塞を確認します(図2B-C)。最適なイメージングのために、3 ccシリンジに全強度のコントラストを注入します。通常、すべての頭蓋内動脈の適切な混濁に必要なのは1cc以下です。
9. 透視下でマイクロカテーテルからマイクロワイヤーをそっと取り外し、安定した位置を確認します。マイクロカテーテルのハブに活栓を置き、活栓を閉じて逆行性血流による失血を防ぎます。左椎骨カテーテルを取り外して、左大腿骨アクセスシースを使用できるようにします。
10. その後の閉塞期間中に、断続的な透視画像を取得し、閉塞マイクロカテーテルの安定した位置を確認します。60〜240分の範囲の後大脳動脈閉塞期間の結果は、以前に発表されている¹⁸。

6.血圧の測定と変調

1. 閉塞性頭蓋内マイクロカテーテルには1つの大腿骨アクセス部位が使用されますが、BP測定には反対側シースを使用します。
2. 3フレンチゲージのピエゾ抵抗センサーで連続動脈血圧測定値を記録し、大腿骨シースを通して配置し、センサーの先端が下部胸部大動脈に入るまで進めます。このセンサをデータ収集ハードウェアに接続し、関連するソフトウェアで測定された圧力を視覚化します。圧力可視化ウィンドウでBPを観察します。BP記録は、統計ソフトウェアで視覚化するためにスプレッドシートにエクスポートできます。
3. あるいは、バルーンカテーテルを使用してBPの機械的操作が必要な場合は、利用可能な大腿骨シースを通して4フレンチ5mmフォガティバルーンカテーテルを進めます。バルーンを腎下大動脈に配置します。圧力トレースに0.025インチの内側ルーメンを使用して、バルーンの上流のBPを継続的に監視し、バルーンの4フレンチ直径を使用して、バルーンの下流のBPを継続的に監視するためにシースに接続する2番目のBPトレースラインを使用します。

7.安楽死と組織採取

1. 3時間後に閉塞マイクロカテーテルを取り外し、さらに所望の期間、動脈血圧の測定と調節を続けます。3時間の標準的な回復期間は、その後の組織学で完了した梗塞の視覚化に使用されます。
2. 処方された閉塞および回復時間を完了した後、動物が麻酔の手術面にあることを確認し、安楽死(リン酸緩衝溶液による灌流固定、続いて心臓活動の欠如を確認した後に断頭)を行う。あるいは、大腿骨鞘に灌流液を注入し、頸静脈、下大静脈、または右心房を横断することにより、灌流固定を行います。
   注:遺伝子発現またはバイオマーカー値が溶液の影響を受ける可能性があるため、一部の死後分析では灌流が望ましい場合があります。どちらの技術も私たちのグループによって成功裏に実行されています。
3. 脳の即時収穫を伴う急性処置では、安楽死を確認し、動物を斬首します。頭蓋骨をロンジュールで少しずつ取り除き、後頭の尾根から始めて、脳が無傷で収穫できるようになるまで前方に働きます。脳をホルマリンまたは最適な切断温度溶液に入れ、目的の組織分析の種類に応じてフラッシュフリーズします。

結果

このモデルを用いた最初の実験では、私たちのグループは、14匹中12匹(85.7%)で後大脳または上小脳動脈閉塞の望ましい結果を達成することに成功しました。実験のために、7人の男性と7人の女性が研究されました。動物の平均体重は3.6 kg(± 0.46 kg)でした。成功しなかった2匹の動物では、重度のカテーテル誘発血管れん縮により頭蓋内循環への安全なアクセスが妨げられました。1匹のウサギでは閉塞性血管れん縮により頭蓋内アクセスが得られず、もう1匹ではカテーテル挿入の試み中に頭蓋内動脈穿孔が発生しましたが、これはマイクロカテーテルを後大脳動脈の遠位に配置しすぎたためと考えられます。

すべての動物において、脳の採取に成功し、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色または2%トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)のいずれかによる組織病理学的分析を行った。以前に発表された閉塞モデルの結果と一致して、より大きな梗塞体積は、より長い閉塞持続時間で発生し、60分から240分に首尾よく実行されました¹⁸。120分の再灌流を伴う90分の...

ディスカッション

ISの管理は、特に急性介入と二次予防戦略の進歩を考慮して、大幅な進歩が見られました。しかし、IS患者のケアを改善するためには、より多くの作業を行うことができます。IS治療の他の側面、特に神経保護の領域における限られた進歩は、組織および分子レベルでの機構プロセスの病態生理学的理解の限界に起因する可能性があります。人間からの影響力のあるデータは非現実的であり、取得することはおそらく不可能です。このような状況では、動物モデルからの組織レベルのデータは、知識のギャップを埋め、意味のある変化に影響を与える可能性があります。

上で詳述したように、ウサギは、脳血管の病状の調査のためにサイズ、生理学、および解剖学の最適な組み合わせを提供します¹⁸。レテミラビルがないため、頭蓋内動脈に構造的な障壁はありません。さらに、頭蓋内血管は血管内装置を収容するのに十分な大きさであり、これはげっ歯類モデルでは同様に実現可能ではない。頭蓋内組織からのデータは、確立された組織病理学的および免疫組織化学的染色、または単一細胞RNAシーケンシングまたは無...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-0 シルク縫合	Ethicon	A184H
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	B9275
カテーテル	テルモ	CG415	4F グライドカテーテル
内圧センサー	ミラー	SPR-524
ユータゾール	ビルバック	PVS111
ガイドワイヤー	テルモ	GR1804
Iohexol	ThermoFisher	466651000	Iodinated Contrast
Ketamine	Biorbyt	orb61131
LabChart Software	ADInstruments
Lidocaine	Spectrum	LI102
Microcatheter	Medtronic	EV3 105-5056	Marathon Microcatheter
Microwire	Medtronic	EV3103-0608	Mirage Microwire
PowerLab	ADInstruments
ウサギの脳 2mm コロナル カッティング マトリックス	テッド ペラ	15026
生理食塩水	フィッシャーサイエンティフィック	23-535435
シース	メリット メディカル	PSI-5F-11
キシラジン	サーモフィ	ッシャーJ61430.14

糸 血管