汎用性の高い循環腫瘍細胞を単離するための臨床用マイクロ流体チッププラットフォーム

Summary

臨床用マイクロ流体チップは、臨床患者の血液サンプルの前処理を簡素化し、チップ上でその 場 で循環腫瘍細胞(CTC)を免疫蛍光染色し、単一のCTCの迅速な検出と同定を可能にする重要な生物医学的分析技術です。

Abstract

循環腫瘍細胞(CTC)は、がんの予後、診断、および抗がん治療において重要です。CTCの列挙は、CTCがまれで不均一であるため、患者の疾患を決定する上で不可欠です。CTCは原発腫瘍から剥離し、血液循環系に入り、離れた部位で増殖する可能性があるため、腫瘍が転移します。CTCは原発腫瘍と同様の情報を持っているため、CTCの分離とその後の特性評価は、がんのモニタリングと診断において重要な場合があります。希少CTCの列挙、アフィニティー修飾、および臨床免疫蛍光染色は、必要な要素を高感度で提供するため、CTC単離の強力な方法です。マイクロ流体チップは、患者の痛みのないリキッドバイオプシー法を提供します。この研究では、CTCの分離、分析、および早期診断に必要な一連の機能とサービスを組み込んだ、汎用性の高いCTC分離プラットフォームである臨床マイクロ流体チップのプロトコルのリストを提示し、生体分子分析と癌治療を容易にします。このプログラムには、まれな腫瘍細胞カウント、赤血球溶解を含む臨床患者の血液前処理、およびマイクロ流体チップ上でのその 場 でのCTCの分離と認識が含まれます。このプログラムでは、腫瘍細胞またはCTCの正確な列挙が可能です。 さらに、このプログラムには、汎用性の高いマイクロ流体チップによるCTC分離と、チップ上の その場での 免疫蛍光同定、それに続く生体分子分析を組み込んだツールが含まれています。

Introduction

循環腫瘍細胞(CTC)は、がんの予後、診断、および抗がん治療において重要です。CTCはまれで異種であるため、CTCの列挙は不可欠です。希少CTCの列挙、アフィニティー修飾、および臨床免疫蛍光染色は、必要な要素を高感度で提供するため、CTC単離のための強力な技術です¹。2〜3 mLの実際の患者の血液には1〜10個のCTCしか含まれていないため、正常な血液と混合されたまれな数の腫瘍細胞は実際の患者の血液を厳密に模倣します。重要な実験問題を解決するために、PBSに導入された多数の腫瘍細胞を使用するか、正常な血液と混合する代わりに、まれな数の腫瘍細胞を使用すると、実験を行う際の現実に近い血球数が少なくなります。

がんは世界の主要な死因です²。CTCは、血液およびリンパ循環系^を循環する元の腫瘍から脱落した腫瘍細胞である3。CTCが新しい生存可能な環境に移動すると、それらは2番目の腫瘍として成長します。これは転移と呼ばれ、がん患者の死亡の90%の原因です⁴。CTCは、予後、早期診断、および癌のメカニズムを理解するために不可欠です。しかし、CTCは患者の血液中では非常にまれで不均一です^5,6。

マイクロ流体チップは、腫瘍に浸潤しないリキッドバイオプシーを提供します。それらには、ポータブルで低コストであり、セルに一致するスケールを備えているという利点があります。マイクロ流体チップによるCTCの単離は、主に2つのタイプに分類されます:抗原抗体結合に依存するアフィニティベース^7,8,9であり、CTC単離のオリジナルで最も広く使用されている方法です。腫瘍細胞と血液細胞10,11,12,13,14,15のサイズと変形能の違いを利用する物理ベースのチップは、ラベルフリーで、操作が簡単です。他の技術に対するマイクロ流体チップの利点は、大きな楕円マイクロフィルターの物理ベースのアプローチが高い捕捉効率でCTCをしっかりと捕捉することです。この理由は、楕円のマイクロポストがラインラインギャップの細いトンネルに編成されているためです。ラインラインギャップは、菱形マイクロポストなどのマイクロポストによって形成される従来のポイントポイントギャップとは異なります。CTCのウェーブチップベースのキャプチャは、物理的特性ベースの分離とアフィニティベースの分離の両方を組み合わせたものです。ウェーブチップベースのキャプチャには、円形のマイクロポストに抗EpCAMの抗体をコーティングした30のウェーブ型アレイが含まれます。CTCは小さなギャップによって捕捉され、大きなギャップは流量を加速するために使用されます。見逃されたCTCは、次のアレイの小さなギャップを通過しなければならず、チップ¹⁶の内部に組み込まれたアフィニティベースの絶縁によって捕捉される。

このプロトコルの目的は、まれな数の腫瘍細胞のカウントと、マイクロ流体チップを使用したCTCの臨床分析を実証することです。プロトコルは、CTC単離ステップ、低数の腫瘍細胞を取得する方法、小楕円フィルター、大楕円フィルター、および台形フィルターの臨床的物理的分離、親和性修飾、および濃縮¹⁷について説明しています。

Protocol

患者の血液サンプルは、上海医科大学附属龍華病院から提供され、プロトコルは北京大学第三病院の人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。研究目的でサンプルを使用することについて、患者からインフォームドコンセントが得られました。

1. 培養腫瘍細胞による捕捉効率を確認するための事前実験

1. 腫瘍細胞をMCF-7、MDA-MB-231、およびHeLaで培養し、捕捉効率を測定した。腫瘍細胞懸濁液を希釈し、腫瘍細胞の数を数え、1 mLのPBS中の所望の細胞数が得られるまで繰り返します。
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した1mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の開始細胞数~1×10⁵ 細胞を有する細胞培養フラスコ内で細胞を培養する。5%_CO2 雰囲気で37°Cの加湿雰囲気中でインキュベートします。
   2. 細胞株が接着性単層として95%コンフルエントまで増殖したら、Chenらに記載されているように、0.25%トリプシン溶液で培養皿から2分間剥離します¹⁶。
   3. 腫瘍細胞をカルセインAMで染色します。培養皿に3 μLのカルセインAMを入れ、培養器内で30分間保持します。その後、トリプシンですべての細胞を消化します。
   4. 細胞計数チャンバーを用いてPBSで培養した腫瘍細胞を計数し、PBS1mLあたり100個の腫瘍細胞が得られるまで希釈する。
      注:細胞数を正確に列挙するために、得られた細胞懸濁液の50μLを採取して、その中の腫瘍細胞の数が5個であるかどうかを顕微鏡で確認します。50μLの細胞懸濁液中の実際の腫瘍細胞数に応じて、100個の腫瘍細胞を得るために採取する必要のある細胞懸濁液の量を決定します。
2. シリンジポンプ付きシリンジを使用して、PBS1 mLあたり100個の腫瘍細胞を含む細胞懸濁液を、0.5 mL/h、1 mL/h、2 mL/h、3 mL/h、4 mL/h、および5 mL/hのさまざまな流速でマイクロ流体チップに導入します。さまざまな流量の捕捉効率を取得し、最適な流量を決定します。
   1. チップ上に捕捉され、出口から流出する腫瘍細胞の数を数えます。キャプチャ効率を次のように計算します。
      捕捉効率=捕捉細胞数/(捕捉細胞数+流出細胞数)×100%
   2. 繰り返して、10〜100(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100)の異なる数の腫瘍細胞の捕捉効率を得る。
3. マイクロ流体チップの希少な数の腫瘍細胞をテストおよび検証します。マイクロピペットプラーで作った中空針を使用して、これらの10サンプル懸濁液をマイクロ流体チップに注入し、1 mLのPBSで希釈した1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10個の腫瘍細胞を吸引します。チップ上で捕捉した後の各サンプルの腫瘍細胞の数を検出して列挙します。
   注意: 中空針の長さは約3 cm、外径は1 mmです。
4. 正常な血液サンプルにスパイクされた腫瘍細胞の臨床実験前テストを実行します。
   1. 腫瘍細胞をカルセインAMで染色し、5 μLのPBS中の100個の腫瘍細胞を列挙します。これらの細胞を1mLの全正常血液サンプルにスパイクします。.これらの細胞をチップに導入し、緑色の免疫蛍光でチップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を列挙する。上記のようにチップ上で 生体内 計数を行い、捕捉後の捕捉効率を算出する。
   2. ステップ1.4.1を繰り返して、腫瘍細胞数の10から90までの9つの追加濃度(10、20、30、40、50、60、70、80、90)について繰り返します。
   3. ステップ1.3で説明したように、染色せずに1、2、3、4、5、6、7、8、9、および10個の腫瘍細胞を列挙し、1 mLの全正常血液にスパイクし、これらのサンプルをマイクロ流体チップに導入し、チップ上の腫瘍細胞を捕捉します。
   4. チップをヘキスト、CK-FITC、およびCD45-PEで染色します。3〜5μLの蛍光色素を20〜30μLのPBSに入れ、次いでこの溶液をシリンジを用いてマイクロ流体チップ上に導入する。チップ上に捕捉された腫瘍細胞の数を青と緑の両方の免疫蛍光で列挙し、捕捉効率を決定します。
5. 抗EpCAMの親和性ベースの捕捉のためにマイクロ流体チップの修飾を行う。
   メモ: Wave チップはアフィニティベースと物理的特性ベースの両方の分離を組み合わせているため、エージェントでチップを変更します。
   1. 100 μLの4%(v/v)3-メルカプトプロピルトリメトキシシランをエタノール中で室温で45分間チップの表面改質します。チップの内部構造、特に上面と基板ガラスの接着を破壊する場合に備えて、この溶液をチップに注意深くゆっくりと導入してください。
      注:チップ表面はメルカプトシランを使用して改質されています。チップ上で発生する相互作用は、化学結合によって決定されます。抗原で修飾された抗体の結合を実現するために化学結合が確立されます。チップ内では、さまざまな試薬が修飾され、互いに結合する化学結合が確立されます。修飾される最後の試薬は、抗上皮接着分子(抗EpCAM)である。EpCAMの腫瘍細胞表面抗原は、チップ内の抗EpCAMと組み合わせて、CTCの捕捉を実現します。
   2. エタノール3倍で洗浄します。カップリング剤N-y-マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS、1 μM)を100 μLチップ上に加え、30分間相互作用させます。
   3. PBS 3xで洗浄します。シリンジを使用して、洗浄するチップに1 mLのPBSを導入します。
   4. チップを30-40 μLの10 μg/mLニュートラアビジンで室温で30分間処理し、細胞をGMBSに固定化してから、PBSで洗い流して余分なアビジンを除去します。
   5. 100 μLのPBS溶液中に10 μg/mLの濃度の抗ビオチン化EpCAM抗体3 μLを1%(w/v)BSAでチップを修飾します。これを一晩保管してください。

2.循環腫瘍細胞(CTC)を列挙するためのチップ上の臨床実験

1. 赤血球溶解(RBCL)溶液を使用して臨床がん患者の血液サンプルを前処理するか、シリンジを使用して2〜3 mLの血液サンプルをマイクロ流体チップに直接導入します。
   1. 約30分かかる前処理を実行します。抗凝固チューブで全血サンプルを収集します。6〜9 mLのRBS溶解溶液を2〜3 mLの血液に加えます。111 x g で室温で5〜8分間遠心分離し、赤い透明な液体の上層を廃棄します。
2. 以下に説明するように、チップ上の細胞を捕捉、染色、認識、および列挙します。
   1. ステップ 1 の説明に従ってチップ上の細胞を捕捉します。Hoechst、CK-FITC、および CD45-PE を使用して捕捉された CTC のチップを染色します。CK-FITCは腫瘍細胞に対する特異的染色剤であり、CD45-PEは白血球に対する特異的染色剤である。
   2. 3 μL の CK-FITC を 20 μL の PBS に加えます。これをシリンジに入れ、希釈したCK-FITCをチップに送り込みます。30分間染色します。チップ上に300 μLのPBSを導入してチップを洗浄します。
   3. 3 μLのCD45-PEを20 μLのPBSに加えます。これをシリンジに入れ、希釈したCD45-PEをチップに送り込みます。30分間放置します。チップ上に300 μLのPBSを導入してチップを洗浄します。
   4. 倒立蛍光顕微鏡で20倍または40倍の倍率でCTCを同定します。CTCは青色と緑色の両方の蛍光を発し、白血球(WBC)は青色と赤色の両方の蛍光を発します。青と緑の両方の蛍光を持つCTCと、青と赤の両方の蛍光を持つWBCを特定します。
   5. 免疫蛍光画像から、チップ上に捕捉されたCTCの数を列挙する。CTC を Hoechst+/CK-FITC+/CD45- として列挙し、WBC を Hoechst+/CK-FITC−/CD45+ として列挙します。
3. シリンジを通してPBSでマイクロ流体チップに逆方向にフラッシュし、チップ上に捕捉されたCTCを入口から回収することにより、捕捉されたCTCを濃縮します。1 mLのPBSを含むシリンジを使用し、出口から導入して、2〜3分以内にチップ上に捕捉されたCTCを濃縮し、入口から収集します。洗浄ステップごとに1 mLのPBSを使用し、3回繰り返します。
4. マイクロ流体チップ上に捕捉された腫瘍細胞またはCTCを以下のように染色する。
   1. カルセインAMを使用して染色します。5 μLのカルセインAMを20 μLのPBSに加え、細胞を30分間染色した後、111 x g で室温で2分間遠心分離して腫瘍細胞を取得し、1 mLのPBSに懸濁します。
   2. 細胞核を特定するには、20 μLのDAPI溶液(20 μLのPBSに10 μLのDAPI試薬)を、大きな楕円マイクロフィルターの場合は1 mL/h、台形のマイクロフィルターの場合は1.5 mL/hの最適な流速でチップに追加します。20 μLの抗サイトケラチン原液(20 μLのPBS中に3 μLの抗サイトケラチン抗体)を通過させて、チップと30分間反応させます。
   3. チップにキャプチャされたWBCを染色します。CTCをチップ上に捕捉した後、25 μLの抗CD45抗体溶液(20 μLのPBS中に5 μLの抗CD45溶液)をチップに加え、30分間染色します。PBSで洗浄し、青色と緑色の両方の蛍光で上皮細胞を同定します。
5. 以下に述べるように蛍光顕微鏡による免疫蛍光同定を行う。
   1. 蛍光顕微鏡を使用し、青色レーザーでサンプルを励起します。核細胞である青色蛍光を発する細胞を見つけます。次の倍率のいずれかを使用します:10倍、20倍、または40倍。腫瘍細胞の明確なフィールドを見つけます。青色レーザー光源には、励起板波長420〜485 nm、発光板波長515 nmを使用します。
   2. サンプルを移動せずに、別のレーザー光源を使用します。蛍光顕微鏡を回転させ、緑色レーザーで試料を励起します。腫瘍細胞の指標である緑色の蛍光を発する細胞を見つけます。この緑色レーザー光源で同じ視野の画像を同じ倍率で撮影します。青色と緑色の両方の蛍光を発する細胞は、腫瘍細胞として認識されます。緑色レーザー光源には、励起板波長460〜550 nm、発光板波長590 nmを使用してください
   3. サンプルを移動せずに、別のレーザー光源を使用します。蛍光顕微鏡を回転させ、赤色レーザーで試料を励起します。赤色蛍光を発する細胞を見つけます。この赤色レーザー光源で同じ視野の画像を同じ倍率で撮影します。青色と赤色の両方の蛍光を発する細胞は、白血球として認識されます。
   4. 上記の各レーザー光源を使用して得られた画像を保存します。異なる色のライトで同じフィールドの複数の画像を撮ります。
   5. 励起板波長330〜400nm、発光板波長425nmの紫外線を使用してください。励起板波長395-415nm、発光板波長455nmの紫色光を使用してください。
6. 手順1.2.1のようにキャプチャ効率を計算します。

Results

セットアップ全体には、シリンジポンプ、シリンジ、およびマイクロ流体チップが含まれます。シリンジ内の細胞懸濁液をシリンジポンプに接続し、細胞懸濁液をマイクロ流体チップに導入して細胞を捕捉します。利用したすべてのマイクロ流体チップの捕捉効率は約90%以上でした。ウェーブチップでは、ギャップの異なる微細構造を設計しました。小さなギャップはCTCを捕捉するために使用され、大きなギャップは流量を加速するために使用されます。細胞懸濁液は大きなギャップ領域で素早く流れます。欠落したCTCは、後続のアレイ¹⁶の小さなギャップによって捕捉される傾向がある。楕円チップの場合、ポイントとポイントのギャップではなくラインラインギャップを設計して、キャプチャを強化するためにスリムなトンネルを形成しました。したがって、高い捕捉効率を達成した¹.生存率を維持するために、エッジとコーナーを避けるように楕円構造を設計しました。台形フィルターには、台形と円形のマイクロポストバリアが埋め込まれた2つの円形スパイラルチャネルがあります。台形フィルターの場合、MCF-7、MDA-MB...

Discussion

がんの予後と早期診断は、がん治療に大きな影響を与えます¹.マイクロ流体チップによるCTC分離は、浸潤のないリキッドバイオプシーを提供します。しかし、CTCは血液中で非常にまれで不均一であるため¹、CTCを単離することは困難です。 CTCは、それらが由来する元の腫瘍源と同様の特性を有する。したがって、CTCは癌転移において重要な役割を果たします¹。

提案されたプロトコルは、マイクロ流体チップによるCTC分離の完全な分析を可能にします。プロトコルには、CTC分離に関連するすべての主要な手順が含まれています。たとえば、このプロトコルには、細心の注意を払って記録され、さまざまなパッケージに編成されたRBCL分析、希少腫瘍細胞の取得、最適な流速の決定、捕捉効率、臨床特性評価、および列挙が含まれます。操作の慎重な管理は、臨床患者のサンプル処理を容易にします。このプロトコルは、臨床患者サンプルの前処理と処理を可能にし、臨床医に不可欠なサービスを提供しま...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
較正済みマイクロキャピラリーピペット	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	サイトケラチンモノクローナル抗体
DMEM	HyClone	SH30081.05
ウシ胎児血清 (FBS)	GIBCO、米国	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes、Solarbio Corp.、中国	C0031
ペニシリン-ストレプトマイシン	Ying 信頼性の高いバイオテクノロジー、中国
赤血球溶解 (RBCL)	Solarbio、北京	R1010