汎用性の高い循環腫瘍細胞を単離するための臨床用マイクロ流体チッププラットフォーム

Summary

臨床用マイクロ流体チップは、臨床患者の血液サンプルの前処理を簡素化し、チップ上でその 場 で循環腫瘍細胞(CTC)を免疫蛍光染色し、単一のCTCの迅速な検出と同定を可能にする重要な生物医学的分析技術です。

Abstract

循環腫瘍細胞(CTC)は、がんの予後、診断、および抗がん治療において重要です。CTCの列挙は、CTCがまれで不均一であるため、患者の疾患を決定する上で不可欠です。CTCは原発腫瘍から剥離し、血液循環系に入り、離れた部位で増殖する可能性があるため、腫瘍が転移します。CTCは原発腫瘍と同様の情報を持っているため、CTCの分離とその後の特性評価は、がんのモニタリングと診断において重要な場合があります。希少CTCの列挙、アフィニティー修飾、および臨床免疫蛍光染色は、必要な要素を高感度で提供するため、CTC単離の強力な方法です。マイクロ流体チップは、患者の痛みのないリキッドバイオプシー法を提供します。この研究では、CTCの分離、分析、および早期診断に必要な一連の機能とサービスを組み込んだ、汎用性の高いCTC分離プラットフォームである臨床マイクロ流体チップのプロトコルのリストを提示し、生体分子分析と癌治療を容易にします。このプログラムには、まれな腫瘍細胞カウント、赤血球溶解を含む臨床患者の血液前処理、およびマイクロ流体チップ上でのその 場 でのCTCの分離と認識が含まれます。このプログラムでは、腫瘍細胞またはCTCの正確な列挙が可能です。 さらに、このプログラムには、汎用性の高いマイクロ流体チップによるCTC分離と、チップ上の その場での 免疫蛍光同定、それに続く生体分子分析を組み込んだツールが含まれています。

Introduction

循環腫瘍細胞(CTC)は、がんの予後、診断、および抗がん治療において重要です。CTCはまれで異種であるため、CTCの列挙は不可欠です。希少CTCの列挙、アフィニティー修飾、および臨床免疫蛍光染色は、必要な要素を高感度で提供するため、CTC単離のための強力な技術です¹。2〜3 mLの実際の患者の血液には1〜10個のCTCしか含まれていないため、正常な血液と混合されたまれな数の腫瘍細胞は実際の患者の血液を厳密に模倣します。重要な実験問題を解決するために、PBSに導入された多数の腫瘍細胞を使用するか、正常な血液と混合する代わりに、まれな数の腫瘍細胞を使用すると、実験を行う際の現実に近い血球数が少なくなります。

がんは世界の主要な死因です²。CTCは、血液およびリンパ循環系^を循環する元の腫瘍から脱落した腫瘍細胞である3。CTCが新しい生存可能な環境に移動すると、それらは2番目の腫瘍として成長します。これは転移と呼ばれ、がん患者の死亡の90%の原因です⁴。CTCは、予後、早期診断、および癌のメカニズムを理解するために不可欠です。しかし、CTCは患者の血液中では非常にまれで不均一です^5,6

Protocol

患者の血液サンプルは、上海医科大学附属龍華病院から提供され、プロトコルは北京大学第三病院の人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。研究目的でサンプルを使用することについて、患者からインフォームドコンセントが得られました。

1. 培養腫瘍細胞による捕捉効率を確認するための事前実験

1. 腫瘍細胞をMCF-7、MDA-MB-231、およびHeLaで培養し、捕捉効率を測定した。腫瘍細胞懸濁液を希釈し、腫瘍細胞の数を数え、1 mLのPBS中の所望の細胞数が得られるまで繰り返します。
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した1mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の開始細胞数~1×10⁵ 細胞を有する細胞培養フラスコ内で細胞を培養する。5%_CO2 雰囲気で37°Cの加湿雰囲気中でインキュベートします。
   2. 細胞株が接着性単層として95%コンフルエントまで増殖したら、Chenらに記載されているように、0.25%トリプシン溶液で培養皿から2分間剥離します¹⁶。
   3. 腫瘍細胞をカルセインAMで染色します。培養皿に3 μLのカルセインAMを入れ、培養器内で30分間保持します。その後、トリプシンですべての細胞を消化します。
   4. 細胞計数チャン....

Results

セットアップ全体には、シリンジポンプ、シリンジ、およびマイクロ流体チップが含まれます。シリンジ内の細胞懸濁液をシリンジポンプに接続し、細胞懸濁液をマイクロ流体チップに導入して細胞を捕捉します。利用したすべてのマイクロ流体チップの捕捉効率は約90%以上でした。ウェーブチップでは、ギャップの異なる微細構造を設計しました。小さなギャップはCTCを捕捉するために使用され、大きなギャップは流量を加速するために使用されます。細胞懸濁液は大きなギャップ領域で素早く流れます。欠落したCTCは、後続のアレイ¹⁶の小さなギャップによって捕捉される傾向がある。楕円チップの場合、ポイントとポイントのギャップではなくラインラインギャップを設計して、キャプチャを強化するためにスリムなトンネルを形成しました。したがって、高い捕捉効率を達成した¹.生存率を維持するために、エッジとコーナーを避けるように楕円構造を設計しました。台形フィルターには、台形と円形のマイクロポストバリアが埋め込まれた2つの円形スパイラルチャネルがあります。台形フィルターの場合、MCF-7、MDA-MB.......

Discussion

がんの予後と早期診断は、がん治療に大きな影響を与えます¹.マイクロ流体チップによるCTC分離は、浸潤のないリキッドバイオプシーを提供します。しかし、CTCは血液中で非常にまれで不均一であるため¹、CTCを単離することは困難です。 CTCは、それらが由来する元の腫瘍源と同様の特性を有する。したがって、CTCは癌転移において重要な役割を果たします¹。

提案されたプロトコルは、マイクロ流体チップによるCTC分離の完全な分析を可能にします。プロトコルには、CTC分離に関連するすべての主要な手順が含まれています。たとえば、このプロトコルには、細心の注意を払って記録され、さまざまなパッケージに編成されたRBCL分析、希少腫瘍細胞の取得、最適な流速の決定、捕捉効率、臨床特性評価、および列挙が含まれます。操作の慎重な管理は、臨床患者のサンプル処理を容易にします。このプロトコルは、臨床患者サンプルの前処理と処理を可能にし、臨床医に不可欠なサービスを提供しま.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
較正済みマイクロキャピラリーピペット	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	サイトケラチンモノクローナル抗体
DMEM	HyClone	SH30081.05
ウシ胎児血清 (FBS)	GIBCO、米国	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes、Solarbio Corp.、中国	C0031
ペニシリン-ストレプトマイシン	Ying 信頼性の高いバイオテクノロジー、中国
赤血球溶解 (RBCL)	Solarbio、北京	R1010