ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ

サマリー

この研究では、トランスジェニックコンストラクトを作成してゼブラフィッシュ胚に注入するためのゲートウェイベースのクローニング方法であるモジュラーTol2トランスジェネシスシステムのプロトコルについて説明します。

要約

胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)は、出生前のエタノール曝露によって生じる構造的欠陥および認知障害の非常に多様なセットによって特徴付けられる。FASDの複雑な病理のために、動物モデルはエタノール誘発性発達障害の現在の理解にとって重要であることが証明されています。ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュとヒトの間の遺伝学と発生の両方の高度な保存のために、エタノール誘発性発達障害を調べるための強力なモデルであることが証明されています。モデルシステムとして、ゼブラフィッシュは、遺伝的に扱いやすく半透明の多数の外部受精胚を含む、発生研究に理想的な多くの属性を持っています。これにより、研究者は複数の遺伝的状況でエタノール曝露のタイミングと投与量を正確に制御することができます。ゼブラフィッシュで利用可能な重要な遺伝的ツールの1つは、遺伝子導入です。しかし、トランスジェニック構築物の生成とトランスジェニック株の確立は複雑で困難な場合があります。この問題に対処するために、ゼブラフィッシュの研究者はトランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステムを確立しました。このモジュラーシステムは、マルチサイトGatewayクローニングアプローチを使用して、完全なTol2トランスポゾンベースのトランスジェニックコンストラクトを迅速に組み立てます。ここでは、柔軟なTol2システムツールボックスと、ゼブラフィッシュのトランスジェネシスの準備ができているトランスジェニックコンストラクトを生成するためのプロトコルと、エタノール研究におけるそれらの使用について説明します。

概要

出生前のエタノール曝露は、胎児アルコールスペクトラム障害(FASD⁾1,2,3,4と呼ばれる構造的欠損と認知障害の連続を引き起こします。複数の要因間の複雑な関係により、ヒトにおけるFASDの病因の研究と理解は困難になっています。この課題を解決するために、多種多様な動物モデルが使用されてきました。これらのモデルで利用可能な生物学的および実験的ツールは、エタノール催奇形性の機構的基礎の理解を深める上で重要であることが証明されており、これらのモデルシステムからの結果は、ヒトエタノール研究で見られるものと著しく一致しています^5,6。これらの中で、ゼブラフィッシュはエタノール催奇形性を研究するための強力なモデルとして浮上しています^7,8、部分的には、それらの外部受精、高い繁殖力、遺伝的扱いやすさ、および半透明の胚のために。これらの強みが組み合わさって、ゼブラフィッシュはトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を用いたFASDのリアルタイムライブイメージング研究に最適です。

トランスジェニックゼブラフィッシュは、胚発生の複数の側面を研究するために広く使用されています⁹。しかし、トランスジェニックコンストラクトとそれに続くトランスジェニック株を作成することは非常に困難な場合があります。標準的な導入遺伝子は、導入遺伝子を駆動するための活性プロモーター要素と、一般的なベクター維持のために安定した細菌ベクター中のポリAシグナルまたは「テール」を必要とします。多成分トランスジェニック構築物の従来の生成は、複数の時間のかかるサブクローニングステップ¹⁰を必要とする。ギブソンアセンブリなどのPCRベースのアプローチは、サブクローニングに関連する問題のいくつかを回避できます。しかしながら、固有のプライマーは、すべての固有のトランスジェニック構築物の生成のために設計および試験されなければならない¹⁰。導入遺伝子の構築を超えて、ゲノム統合、生殖細胞系列伝達、および適切な導入遺伝子統合のスクリーニングも困難でした。ここでは、トランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステム(Tol2Kit)を使用するためのプロトコルについて説明します^10,11。このモジュラーシステムは、マルチサイトゲートウェイクローニングを使用して、「エントリ」および「宛先」ベクターの増え続けるライブラリから複数のトランスジェニックコンストラクトを迅速に生成します。統合されたTol2転移因子は、導入速度を大幅に増加させ、複数の導入遺伝子の迅速な構築とゲノム統合を可能にします。このシステムを使用して、内胚葉トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の生成を使用して、FASDの根底にある組織特異的な構造欠陥を研究する方法を示します。最終的に、このプロトコルでは、モジュラーセットアップとトランスジェニックコンストラクトの構築がゼブラフィッシュベースのFASD研究に大いに役立つことを示します。

プロトコル

この手順で使用されたすべてのゼブラフィッシュ胚は、確立されたIACUCプロトコル¹²に従って飼育および飼育されました。これらのプロトコルはルイビル大学によって承認されました。

注:野生型ゼブラフィッシュ株AB、および bmp4^st72;smad5^b1100 二重変異株をこの研究で使用しました。この手順で使用した水はすべて滅菌逆浸透水であった。共焦点画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡で撮影した。内胚葉の測定は、ImageJの測定ツールを使用して行われました。すべての統計分析は、統計ソフトウェアを使用して実行されました。

1.ソリューションとメディアの作成

1. 細菌培地:製造元の指示に従ってLBブロスまたは寒天を溶解し、オートクレーブします。培地を100 mmペトリ皿に注ぐ前に、アンピシリン(50 μg / mL)、カナマイシン(50 μg / mL)、またはアンピシリン/クロラムフェニコールの組み合わせ(それぞれ50 μg / mLと30 μg / mL)を追加します。.
2. 20倍の胚培地ストックを作るには、1 Lの水に次のものを溶解します:17.5 gのNaCl、0.75 gのKCl、2.9 gのCaCl 2、0.41 gのK 2 HPO 4、0.142 gのNa 2 HPO 4、および4.9 gのMgSO ₄·7H ₂O。 0.22 μmの真空ろ過システムを使用して原液をろ過滅菌します。 4°Cで保存します。
   注意: 形成される白い沈殿物は無視してください。これはメディアに影響を与えません。
3. 19 Lの水に1.2 gのNaHCO₃ を溶解し、1 Lの20x胚培地ストックを加えて作業胚培地溶液を生成し、この溶液を28°Cに維持します。
4. 2%フェノールレッド溶液の場合、フェノールレッドナトリウム塩20 mgをRNaseフリー水1 mLに溶解し、室温で保存します。

2.胚射出成形金型

1. アガロース注入プレートを作るには、沸騰するまで加熱することにより、胚培地にアガロースを最終濃度3%まで溶解します。
2. 50 mLのアガロースを100 mmのペトリ皿に注ぎ、アガロースがまだ液体である間に、射出成形金型をアガロースにそっと置き、金型の下に気泡が形成されないようにします。
3. アガロースプレートを冷まします。アガロースが固まったら、射出成形金型を取り外し、使用できるようになるまで4°Cで保管します。

3. インジェクションピペット

1. ソレノイドを2.5に、発熱体を14.6に設定した垂直ピペットプーラーを使用して、フィラメントを含む1.0 mm(OD)キャピラリーを針に引き込みます。
   注:加熱されたプーラーは、毛細血管を2本の針にきれいに均等に引っ張れば機能しますが、一貫した注射結果を得るには、ゼブラフィッシュ胚を注入してから1週間以内に注射針を引っ張る必要があります。
   1. キャピラリーをプーラーに配置し、クランプの両端を締めてから、発熱体をアクティブにします。
   2. 毛細血管を引っ張って2本の注射針を作ります。
   3. プラーから毛細血管を取り外し、ニードルホルダーとして機能するモデリング粘土のストリップを備えた空のペトリ皿に保管します。

4. トランスポゼmRNA調製

1. トランスポザーゼを含むTol2KitプラスミドをNotI制限エンドヌクレアーゼで直線化するには、0.5 mLマイクロ遠心チューブで以下を組み合わせることで、トランスポザーゼプラスミド10 μL(150 ng/μL)、制限エンドヌクレアーゼ1.5 μL、NotIエンドヌクレアーゼ0.3 μLを組み合わせます。
2. 反応液を20 μLまでRNaseフリーの水で満たし、37°Cで一晩混合して消化します。
3. 消化反応に1 μLの0.5 M EDTA(pH 8.0)、2 μLの5 M NH₄OAc、および80 μLの100%EtOHを加えてトランスポザーゼ消化を停止し、-20°Cで一晩混合して冷却します。
4. 溶液を14,000x g で4°Cで20分間遠心分離し、上清を吸引してDNAペレットをRNaseフリーの水に再懸濁します。
5. 蛍光光度計を使用して、最初に2 μLのRNaseフリーウォーターブランクを実行し、次に2 μLの直鎖状プラスミドを実行して、直鎖プラスミド濃度をナノグラム/マイクロリットル(ng/μL)で決定します。
   注:プラスミド濃度は通常100〜200 ng / μLの範囲です
6. 0.5 mLの微量遠心チューブで次の成分を順番に組み合わせて、SP6 mRNAの生産をセットアップします:10 μLの2x NTP/CAP、2 μLの10x反応バッファー、0.1-1 μgの線状DNAテンプレート、および2 μLのSP6酵素ミックス。
7. 反応液をRNaseフリーの水で最大20 μL満たし、混合して37°Cで2時間インキュベートします。
8. 2時間インキュベートした後、1 μLのDNaseを加えてよく混合し、37°Cでさらに15分間インキュベートします。
9. SP6反応を停止するには、30 μLのLiCl沈殿溶液を反応管に加え、混合して-20°Cで一晩冷却します。
10. 溶液を14,000 x g で4°Cで20分間遠心分離してmRNAをペレット化し、上清を吸引してmRNAペレットを1 mLの80%EtOH(RNaseフリー水で希釈)で洗浄します。
11. 溶液を14,000 x g で4°Cで20分間遠心分離してmRNAをペレット化し、上清を吸引します。ペレットを風乾させます。
12. mRNAペレットを20 μLのRNaseフリー水に再懸濁し、ステップ4.5に記載されている蛍光光度計を使用してmRNA濃度をナノグラム/マイクロリットル(ng/μL)で測定し(少なくとも100 ng/μLである必要があります)、単回使用の場合はチューブあたり100 ngのmRNAを分注し、-80°Cで保存します。
    注:mRNAが分解されていないことを確認するために、2 μLのmRNAをDNA電気泳動ゲル上ですばやく実行して、1,950 bpsで単一バンドを確認することができます。

5. トランスジェネシスのエントリーベクターを作成するためのマルチサイトゲートウェイクローニング

注:このプロトコルはKwan et ^al.10から変更されており、LR反応はハーフLR反応として書かれており、総容量は5μLです。新しいエントリ要素を生成するには、5'、中間、および3'ドナーベクターを使用するBP反応を使用する必要があります^10,13。

1. 反応を行うには、p5E、pME、およびp3Eをそれぞれ10 fmol、および宛先ベクター(pDest)を20 fmol集めます。
   注:マルチサイトLR組換えは、5'エントリーベクター(p5E)、ミドルエントリーベクター(pME)、3'エントリーベクター(p3E)、および宛先ベクター(pDest)の4つの異なるプラスミドベクターを使用して、ゼブラフィッシュ胚に注入できるTol2リピートに隣接するユニークなトランスジェニック構築物を生成します。
   1. プラスミドソースから塩基対の4つのベクターすべてのサイズを特定します(表1、Tol2Kit Wikiページ¹⁴ またはAddgene¹¹; 材料表を参照)。
      注:新規ベクターの場合、市販のシーケンシング会社 を介した フルプラスミドシーケンシングにより、正確なプラスミドサイズをbpsで提供できます。
   2. ステップ4.5の説明に従って、蛍光光度計を使用して、4つのベクターすべての濃度をナノグラム/マイクロリットル(ng/μL)で決定します。
   3. DNAの重量を660 g/mol、プラスミドサイズ(bps単位)を使用して、10 fmol(エントリーベクター)または20 fmol(宛先ベクター)に到達するために必要なプラスミドの合計ナノグラム(ng)を計算します。
      
      注:コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスのMosimann研究室は、LR反応に必要なプラスミドの量(ng単位)とベクターの量(μL単位)を計算するために、無料で入手できるスプレッドシートを生成しました¹⁵。
2. 後述するコンストラクトsox17: EGFPCAAXを生成するには、以下のベクターを使用します:ゼブラフィッシュ sox17 プロモーターを含むp5Eベクター(サイズ¹⁶で6,918 bp)。プレニル化EGFPを含むpMEベクターであって、サイズ¹⁰で3,345bpであり、サイズ¹⁰で2,838 bpであるSV40後期ポリAシグナル配列を含むp3Eベクター;pDestはサイズ¹⁰で5,883 bpです。
3. ステップ5.1.2で決定したプラスミド濃度と各ベクターのナノグラム(ng)単位の量(ステップ5.1.3)を使用して、10 fmol(エントリーベクター)または20 fmol(宛先ベクター)のいずれかに到達するために必要な各プラスミドの合計マイクロリットル(μL)を計算し、これを2で割って5 μLのハーフLR反応に使用します(以下の値はすべて 表2に記載されています)。
   
   1. 10 fmolのp5E-sox17を生成するには、45.66 ng(濃度140.3 ng/μL)を使用し、滅菌水で4倍に希釈して0.65 μLを得ます。
   2. 10 fmolのpME-EGFPCAAXを生成するには、22.08 ng(濃度213.5 ng/μL)を使用し、滅菌水で10倍に希釈して0.52 μLを得ます。
   3. 10 fmolのp3E-ポリAを生成するには、15.73 ng(濃度276.1 ng/μL)を使用し、滅菌水で20倍に希釈して0.57 μLを得ます。
   4. 20 fmolの宛先ベクターに対して、77.66 ngのpDest(濃度307.3 ng/μL)を使用し、滅菌水で5倍に希釈して1.63 μLを得ます。
4. 5 μLのハーフLR反応をセットアップするには、ステップ5.3で決定したp5E、pME、p3E、およびpDestの容量を0.5 mLの微量遠心チューブに組み合わせ、滅菌水を加えて総反応容量4 μLにします。
5. LR酵素ミックスを2回ずつ1分間激しくボルテックスして適切な混合を確保し、次に反応に1 μLを加えて完全に混合します。
6. 25°Cで一晩(16+時間)インキュベートします。
7. 0.5 μLのプロテイナーゼK(2 μg/μL)を加えてLR反応を停止し、37°Cで10分間インキュベートした後、室温まで冷却します。
8. 3〜4 μLのプラスミドを解凍した化学的にコンピテントな細胞に形質転換するには、プラスミドを添加し、細胞を氷上に25〜30分間放置します。
9. 細胞を氷の上に置いた状態で、2枚のLB-アンピシリン寒天プレートを室温に温めます。
10. 細胞を42°Cの水浴中で正確に30秒間ヒートショックします。
11. ヒートショック後、抗生物質を含まないリッチな液体培地250 μLを細胞に加え、37°Cで1.5時間振とうしながらインキュベートします。
12. 1枚のアンピシリンプレートに300 μLの細菌を広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
13. 翌朝、透明と不透明の2つの表現型の存在についてコロニーをスクリーニングし、透明なコロニー(Kwan et ^al.10に記載されている)を一度に1つずつ選び、液体培養液を接種し、37°Cで一晩振とうします。
    注:透明なコロニーには、ほとんどの場合、正しいLRコロニーが含まれています(>85%の確率)。
14. 製造元の指示に従って市販のキットを使用して、各液体培養でプラスミド調製を実行し、各プラスミドを診断的に消化して、LRゲートウェイ反応が適切に機能したことを示すトランスジェニックコンストラクトの適切なサイズを確認します。
15. 0.5-1 μLのプラスミドを使用して、ステップ5.4-5.12に記載されている標準的な細菌形質転換プロトコルを使用して正しいトランスジェニックコンストラクトを再形質転換し、37°Cで1時間インキュベートします。
16. コロニーを再ストリークし、それぞれがステップ5.14のようにLRトランスジェニック構築物を有することを確認する。
17. ステップ4.5に記載されているようにプラスミド濃度を決定します(胚注射には少なくとも150 ng/μLが必要です)。

6.導入遺伝子の胚への注入

1. シングルユーストランスポザーゼmRNAサンプルとTol2トランスジェニックコンストラクトを氷上で解凍し、アガロース注射プレートを室温に事前に警告します。
2. 氷上で次のものを組み合わせます:150 ngのプラスミド、100 ngのトランスポザーゼmRNA、および2%フェノールレッド(0.3 μL)。次に、RNAフリーの水を加えて容量を3μLにします。
3. 寒天を完全に覆うEMで満たされた注入プレート(ステップ2に記載)にトランスファーピペットを使用して1つの細胞段階の胚を移し、次に注入プレートのスロットあたり約50〜75個の胚を静かに押します。
4. mRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物をキャピラリー注射針の開放端に追加し、キャピラリーニードルを射出リグアーマチュアに配置し、射出リグをオンにします。
   メモ:注入リグは、空気などの圧縮ガスを使用して、活性化時にmRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物の所望の量(ステップ6.5で説明)を胚にパルスします。
5. キャピラリーニードルを注入プレートのEMに下げ、鉗子を使用して先端を折って、少量のmRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物のみを注入リグから汲み出すことができます。
6. mRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物の小さな3 nLボーラスを胚の細胞体に注入します。
   注:3 nLボーラスは、理論的には7つのボーラスが胚の正中線全体に均等に適合するmRNA/プラスミド/フェノールレッド混合物の体積です。
7. 胚の注入が終了したら、スロットからそっと飛び出し、新鮮なEM(約40 mL)を含む100 mmのペトリ皿にトランスファーピペッティングして注入プレートから取り出し、28.5°Cでインキュベートして胚を発育させます。

7. 遺伝子導入胚のスクリーニング

1. 蛍光タンパク質の発現には、蛍光導入遺伝子を発現させる適切な発生段階を選択し、蛍光解剖顕微鏡で蛍光の存在をスクリーニングします。
   注:これらの胚は、その発現においてモザイク化され、トランスジェニック構築物のゲノム挿入を示す。
2. 異なる宛先ベクターに含まれる、遺伝子 cmlc2 またはmCherryの心臓特異的プロモーターによって駆動されるGFPなどの蛍光トランスジェニックマーカー(ステップ7.1に記載される)のスクリーニングによる非蛍光導入遺伝子のスクリーニング。
3. トランスジェニック挿入陽性の胚が成体のゼブラフィッシュ期に完全に発達するのを待ちます。
4. 潜在的なトランスジェニック魚が繁殖年齢に達したら、野生型ゼブラフィッシュに繁殖させることにより、生殖細胞系列の伝達と導入遺伝子の発現性の両方について個別にスクリーニングします。
5. 胚が正常に発達し、最も強力かつ最も適切な導入遺伝子発現を与える成虫は、将来の研究と分析のためにユニークなトランスジェニックゼブラフィッシュ系統として保持されます。
   注:トランスジェニックコンストラクトのゲノム挿入をスクリーニングするための代替アプローチとして、トランスジェニックコンストラクトのみを増幅し、野生型DNAを増幅しないPCRプライマーを設計します。

結果

トランスジェニック構築物を生成するために、我々はTol2トランスジェネシスシステムを使用した。遺伝子プロモーター/エンハンサーエレメントを保持するp5E、プロモーター/エンハンサーエレメントによって発現される遺伝子を保持するpME、および少なくともpolyAテールを保持するp3Eを含む3つのエントリーベクターを使用して、マルチサイトゲートウェイLRクローニング を介して トランスジェニック構築物を生成しました。宛先ベクターpDestは、ゼブラフィッシュ胚におけるトランスジェニック構築物のゲノム挿入のためのTol2リピートを提供し、細菌の増殖に必要なすべての遺伝情報を含んでいます(図1A)。この原稿の目的のために、我々は sox17:EGFPCAAX トランスジェニックコンストラクトを作成して注入した。内胚葉 マーカーsox17のプロモーターは、ゼブラフィッシュの発育中の内胚葉において膜タグ付きEGFPを駆動するために使用されました。非蛍光色素タンパク質を発現するトランスジェニック構築物の場合、 cmlc2:EGFP ...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、エタノール曝露が発育および病態に与える影響を研究するのに理想的です^7,8。ゼブラフィッシュは、半透明の、体外受精の、遺伝的に扱いやすい胚を大量に産生し、複数の環境状況で同時にいくつかの導入遺伝子標識組織および細胞タイプのライブイメージングを可能にします^19,20。これらの強みは、ヒトとの強力な発生的遺伝的保存と相まって、ゼブラフィッシュをエタノールの影響を画像化するための強力なモデルシステムにしています^7,8。ここでは、トランスジェニックコンストラクトを生成および注入し、将来のエタノール研究のためにトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を確立するためのモジュラーアプローチのプロトコルについて説明しました。

トランス...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Addgene Tol2ツールボックス	https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air			大学から直接提供
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760
分析天びん	VWR	10204-962
ホウ素 1.0 mm OD x 0.75 mm 内径 キャピラリー	FHC	30-30-0
塩化カルシウム	VWR	97062-590
ラムフェニコール	BioVision	2486
EDTA	フィッシャーサイエンティフィック	BP118-500
蛍光解剖顕微鏡	リンパス	SZX16
マイシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP906
レーザー走査型共焦点顕微鏡	リンパス	Fluoview FV1000
ローソンラボ ドナープラスミド調製	https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB 寒天	フィッシャーサイエンティフィック	BP9724
LB ブロス	フィッシャーサイエンティフィック	BP1426
低EEO/多目的/分子生物学グレード アガロー	フィッシャーサイエンティフィック	BP160-500
LRClonase II Plus	Enzyme Fisher Scientific	12538200
硫酸マグネシウム(七水和物)	Fisher Scientific	M63-500
マイクロピペットホルダー	Applied Scientific	Instrumentation MIMPH-M-PIP
微量遠心チューブ 0.5 mL	VWR	10025-724
微量遠心チューブ 1.5 mL	VWR	10025-716
マイクロマニピュレーター	応用科学機器	MM33
マイクロピペットチップ10 μL	フィッシャーサイエンティフィック	13611106
マイクロピペットチップ1000 μL	フィッシャーサイエンティフィック	13611127
マイクロピペットチップ200 μL	フィッシャーサイエンティフィック	13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6転写キット	フィッシャーサイエンティフィック	AM1340
モシマンラボTol2計算ワークシート	https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop分光光度計	NanoDrop	ND-1000
NcoI	NEB	R0189S
NotI	NEB	R0189S
シャーレ 100 mm	フィッシャーサイエンティフィ	FB012924
フェノールレッドナトリウム塩	シグマアルドリッチ	P4758-5G
ピペットマンLp1000Lマイクロピペット	ギルソン	FA10006M
ピペットマンLp200Lマイクロピペット	ギルソン	FA10005M
ピペットマンLp2Lマイクロピペット	ギルソン	FA10001M
塩化カリウム	ッシャーサイエンティフィ	P217-500
リン酸カリウム(二塩基性)	VWR	BDH9266-500G
圧力インジェクター	応用科学機器	MPPI-3
QIAprepスピンミニプレップキット	Qiagen	27106
炭酸ナトリウム	VWR	BDH9280-500G
塩化ナトリウム	ッシャーサイエンティフィック	S271-500
リン酸ナトリウム(二塩基性)	フィッシャーサイエンティフィック	S374-500
ステリカップ.22µm 真空ろ過システム	Millipore	SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page	http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C404010
Vertical Pipetter Puller	David Kopf Instruments	720
ゼブラフィッシュ マイクロインジェクション モールド	適応科学ツール	i34