原発性月経困難症ラットにおける液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法を用いた生および加工されたCyperi根腫サンプルの分析

Summary

ここでは、原発性月経困難症のラットを対象に、超高速液体クロマトグラフィー-高分解能タンデム質量分析(UPLC-MS/MS)を使用して、生および処理されたCyperi根腫(CR)サンプルの比較分析を示します。CR処理ラットと酢処理CR(CRV)ラットの血中濃度および試料成分の変化を調べた。

Abstract

サイペリ根腫(CR)は婦人科で広く使用されており、中国の女性の病気を治療するための一般薬です。酢で処理するとCRの鎮痛効果が高まるため、酢で処理したCR(CRV)が臨床で使用されるのが一般的です。しかし、酢加工によって鎮痛効果が高まるメカニズムは不明である。本研究では、超高圧液体クロマトグラフィータンデム質量分析(UPLC-MS/MS)技術を用いて、月経困難症のCR治療ラットとCRV治療ラットの外因性成分および代謝物の血中濃度の変化を調べました。結果は、これらのラットの血液中の15の成分と2つの代謝産物の異なるレベルを明らかにしました。なかでもCRV群の(-)-ミルテノールと[(1R,2S,3R,4R)-3-ヒドロキシ-1,4,7,7-テトラメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2-イル]酢酸のレベルはCRV群よりもかなり高かった。CRVは、炎症促進性、血小板凝集性、血管収縮性を有する2系列プロスタノイドおよび4系列ロイコトリエンのレベルを低下させ、アラキドン酸およびリノール酸代謝および不飽和脂肪酸の生合成を調節することにより鎮痛効果をもたらした。本研究により、酢加工がCRの鎮痛効果を高めることが明らかになり、CRVの作用機序の理解に貢献できることが明らかになりました。

Introduction

原発性月経困難症(PD)は、臨床婦人科で最も一般的な状態です。それは、生殖器系における骨盤病理を伴わない月経前または月経中の腰痛、腫脹、腹痛、または不快感を特徴とする¹。その有病率に関する報告は、学生の85.7%がPD²に苦しんでいることを示しました。低用量経口避妊薬が標準治療ですが、深部静脈血栓症などの副作用への悪影響が注目されています³。経口避妊薬使用者の深部静脈血栓症の有病率は女性1,000人あたり>1人であり、リスクは最初の6〜12か月と40歳以上のユーザーで最も高くなります⁴。

伝統的な漢方薬(TCM)で長い間使用されているCyperi根腫(CR)は、カヤツリグサ科のCyperus rotundus L.の乾燥した根茎に由来します。CRは月経障害を調節し、うつ病や痛みを和らげます⁵。CRは婦人科で広く使用されており、女性の病気を治療するための一般薬と見なされています⁶。酢で処理されたCR(CRV)は、通常、臨床的に使用されます。CRと比較して、CRVは月経の調節と痛みの緩和の増強を示します。現代の研究は、CRがシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)およびそれに続くプロスタグランジン(PG)の合成を阻害し、したがって抗炎症効果を達成することを示した。一方、CRは副作用のない鎮痛効果を示し⁷、月経困難症患者に適しています。しかし、CRVによる月経調節や疼痛緩和のメカニズムは不明である。CRの研究は、主にその活性化学成分の変化と、抗炎症、抗うつ、鎮痛効果などの薬理学的活性に焦点を当てています8,9,10,11,12。

TCMの成分は複雑ですが、血液に吸収され、効果を発揮するには特定の血中濃度に達する必要があります¹³。TCMの有効成分をスクリーニングする範囲は、血液中の成分決定の戦略を利用することによって狭めることができる。失明はin vitroで化学成分を研究することで回避することができ、個々の成分を研究することで一方的なことを避けることができます¹⁴。血液中のCRとCRVの組成を比較することにより、処理されたCRの有効成分の変化を効果的かつ迅速に検出することができる。薬効は、薬が体に影響を与えるプロセスです。薬物の作用機序に関連している可能性のある、体の代謝反応による薬物成分の変化は、メタボノミクスで決定することができます。メタボノミクスは、全体的かつ動的な代謝反応を測定することを目的としており、これは伝統的な漢方薬の全体的な有効性を決定することと一致しています¹⁵。さらに、代謝産物は遺伝子発現の最終産物であり、表現型¹⁶と最も密接に関連しています。したがって、メタボノミクスは、PDの治療におけるCRとCRVの間の代謝経路の違いを探索するのに適している可能性があります。 液体クロマトグラフィー-高分解能タンデム質量分析(LC-MS/MS)ベースの非標的メタボロミクスは、ハイスループット、高感度、高分解能を特徴とし、多くの異なる低分子成分の測定に使用できます^17,18.この方法は、血液中に吸収される内因性代謝物および外因性成分を同時に決定することができる。メタボノミクスは、TCM¹⁹、薬物毒性学20、健康管理21、スポーツ^{22、食品23}などの分野で広く使用されています。

本研究では、CR治療とCRV治療の月経困難症モデルラットで、血中に吸収される外因性成分と内因性代謝物の違いをLC-MS/MSベースのノンターゲットメタボロミクスを用いて測定し、CRVの鎮痛効果のメカニズムを明らかにしました。

Protocol

すべての動物関連実験は、重慶中医薬研究所の実験倫理委員会の承認を得て実施した。この実験では、8〜10週齢で体重200 g±20 gの24匹の雌のSprague Dawleyラット(SD)を使用しました。

1.抽出の準備

1. 計算
   1. CRまたはCRV抽出物を6匹の治療グループに投与することを計画します スプレイグ・ドーリーラット (10 g /[kg∙日])3日間。1 g / mLのCRまたはCRV抽出物濃度を使用してください(抽出物の1 mLは1 gのハーブから得られます)。
      注:CRの投与量は6〜10 gです。この研究では、投与量として最大用量10 gを使用しました。.成人の平均体重は60kgであるため、成人の投与量は0.1667g / kgです。体重変換アルゴリズム²⁴によれば、ヒトとラットとの間の用量変換係数が6.3であるので、ラットに対する投与量は1.05g/kgである。ラットの投与量は10倍の10.5 g / kgに増加しました。.投与量は、計算と実際の実験の便宜のために10 g / kgに設定されました。たとえば、計算では、合計36 gのCRまたはCRVが必要な場合は、漢方薬を少なくとも2回準備する必要があります。したがって、200gのCRが必要であり、CRとして100gのCRを使用し、100gのCRをCRVに加工した。
   2. 式 (1) を使用して、ラットあたりに適用されるCRまたはCRVの体積を計算します。
      V = 10 g/(kg∙day) × 200 g/(1 g/mL) = 2 mL (1)
2. CRVの処理
   1. CR100 gと酢20 g(酢酸>5.5 g / 100 mL)を完全に混合し、12時間インキュベートします。
      注:12時間後にCRの内部が酢で湿らされるように、CRと酢を混合し、よく攪拌してから、内部が湿るまで再度攪拌しました。
   2. 混合物を鉄鍋で110〜120°Cで10分間炒めます。 次に、混合物を取り出し、室温で冷まします。
      注意: CRの焦げ付きを防ぐために、加熱しながら継続的に攪拌する必要があります。処理されたCRVが湿りすぎている場合は、60°Cで乾燥させることができます。 CRの表面がセピア色の場合、炒め物を止めることができます。
3. 抽出
   1. CR抽出物
      1. CRに10倍(CR量)の純水を加え、2時間浸漬します。浸すときは、薬用材料が液面より下にあることを確認してください。
         注:CRは、抽出する前に半分にカットするだけで済みます。浸漬の目的は、有効成分をより効果的に抽出することです。浸漬のプロセスは不可欠です。
      2. 水と薬の混合物を強火で沸騰させ、弱火で20分間沸騰させます。ろ布(100メッシュ)で濾過し、濾液を回収する。
         注:デココクするときは、沸騰する前に高熱を使用し、沸騰を維持するために弱火を使用しました。
      3. ステップ1.3.1.2を1回繰り返し、ろ液を混ぜ合わせます。
      4. ロータリーエバポレーターで抽出物を1 g / mLまで濃縮します(元の薬に基づいて、濃縮温度は60°C未満でなければなりません)。
         注意: CRの有効成分は揮発性であるため、濃縮温度は60°Cを超えてはなりません。
   2. CRV抽出物
      1. CR 抽出方法と同じ手順 (1.3.1.1-1.3.1.3) を実行します。
   3. テスト用のCR抽出物
      1. 500 μLのCR抽出物と500 μLのメタノールを1.5 mLのマイクロ遠心チューブにピペットで入れ、30秒間ボルテックスして混合します。
         注:メタノールと水の混合物は、活性成分をよりよく抽出します。抽出は、テストのために直接フィルタリングしないでください。
      2. 各サンプルを4°Cで1,6502 × g で15分間遠心分離します。 上清をろ過し、テストのためにサンプルバイアルに移します。
         注:メタノールと抽出物の混合物を高速遠心分離した後、上清をサンプルボトルに直接移して、ろ過せずに測定することができます。遠心分離工程で発生する熱があるため、極低温遠心分離機を用いることが好ましい。
   4. テスト用のCRV抽出物
      1. 手順 1.3.3.1-1.3.3.2 を実行して、テスト用の CRV 抽出を準備します。

2.動物

1. 計算
   1. 安息香酸エストラジオール50 mgを取り、それをオリーブオイル50 mLに加えて1 mg / mL溶液を調製します。50 mgのオキシトシンを取り、50 mLの生理食塩水に加えて1 mg / mL溶液を調製します。
      注:安息香酸エストラジオールとオキシトシンの腹腔内注射の用量は10 mg /(kg∙day)です。.安息香酸エストラジオールはオリーブオイルに溶解し、オキシトシンは通常の生理食塩水に溶解します。安息香酸エストラジオールはオリーブオイルに溶解することが容易ではなく、溶解を促進するために超音波で治療することができます。エストラジオールベンゾエートとオキシトシンの両方の溶液を毎日調製する必要があります。
   2. ラットごとに適用されるエストラジオール安息香酸溶液の量を計算します(つまり、V = 10 mg / [kg∙day] × 200 g / [1 g / mL] = 2 mL)。.ラットごとに適用されるオキシトシン溶液の量を計算します(つまり、V = 10 mg / [kg∙day] × 200 g / [1 g / mL] = 2 mL)。.
2. 動物のグループ化と投与
   注:管理^25,26には10日が割り当てられました。治療中、ラットは標準的な飼料と水に無制限にアクセスできました。オキシトシン投与から30分以内に、各ラットの身もだえ活動を追跡した。PDラットモデルは、子宮収縮、片肢回転、後肢伸展、中空幹、腹部収縮を含むモデルラットのねじれ反応によって証明されるように、首尾よく開発されました²⁶。
   1. 24匹の雌のSprague-Dawleyラット(SDラット、8〜10週齢、体重200 g±20 g)をランダムコントロール、モデル、CR、CRVの4つのグループに割り当て、7日間給餌します。
   2. 動物投与
      1. モデル群、CR群、CRV群のラットに2mLのエストラジオールベンゾエート溶液を毎日腹腔内注射します。対照群のラットに2mLの生理食塩水を腹腔内注射する。
      2. 8 日目から、ステップ 2.2.2.1 を完了します。次いで、CRV群のラットにCRV抽出物2 mL、CR群のラットにCR抽出物2 mL、対照群およびモデル群のラットに2 mLの生理食塩水を胃内投与する。
      3. 10 日目に、ステップ 2.2.2.2 を完了します。次に、モデル群のラット、CR、およびCRV群に2mLのオキシトシン溶液を腹腔内注射し、対照群のラットに2mLの生理食塩水を注射します。
   3. オキシトシン注射から30分以内のラットの身もだえ時間を記録します。
3. サンプル収集
   1. 腹部大動脈の血液サンプルを収集し、子宮を迅速かつ完全に切除し、子宮壁に付着している結合組織と脂肪を注意深く分離します。
      注:血液は最終投与後1時間以内に採取されました。
   2. 微量遠心チューブを使用して子宮組織を保存し、液体窒素に移します。組織サンプルは-80°Cで保存します。
   3. 血液サンプルを4,125 × gで10分間遠心分離します。血清含有上清を除去し、16,502 × g で4°Cで10分間遠心分離する。 血清を遠心分離し、チューブに入れて-80°Cで保存します。
      注:血液サンプルは、再処理のために室温で1時間放置する必要があります。
4. サンプル処理
   1. 血清サンプル
      1. 400μLのメタノールと200μLの血清をマイクロ遠心チューブに入れ、30秒間ボルテックスして混合します。各サンプルを4°Cで16,502 × g で15分間遠心分離します。 サンプルボトルに回収・ろ過後の上清を充填します。各サンプルのすべての上清を同じ容量で混合して、テスト用の品質管理サンプルを準備します。
   2. 子宮組織サンプル
      1. 同側セグメントから100 mgの子宮組織を取り出し、9倍の量の生理食塩水で粉砕します。ホモジネートを4,125 × gで10分間遠心分離し、上清を回収します。上清を冷蔵庫に入れます 4°C テストの場合は、または同じ日にテストしない場合は-80°Cで。
      2. 通常の生理食塩水、組織、および鋼球を2 mLの微量遠心チューブに入れ、微量遠心管を液体窒素に3〜5秒間入れてから、組織をティッシュグラインダーに入れて粉砕します。
5. サンプルテスト
   1. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、ラットサンプルの子宮組織中の_PGF2α および_PGE2 含有量を測定します。
      注:ラットPGE 2 ELISAキットを使用してPGE₂含有量を測定し、ラットPGF 2α ELISAキットを使用してPGF_2αレベルを測定しました。詳細な手順は、製造元の指示に記載されています。キットの詳細は、材料表に記載されています。
   2. UPLC-MS/MSを使用して、血清サンプル、CR抽出物、およびCRV抽出物を評価します。
      1. UPLC には、C18 カラム (2.6 μm、2.1 mm x 100 mm) を使用し、0.1% ギ酸を含む移動相 A とアセトニトリルを含む移動相 B のバイナリ グラジエント法を使用します。溶出勾配を次のように設定します:0分から1分、15%B;1分から8.5分、15%から85%B。8.5分から11.5分、85%B;11.5分から11.6分、99%から1%B。11.6分から15分まで、15%B.流量を0.35 mL/分、注入量を2 μLに設定します。
      2. MSの場合、温度を600°C、カーテンガス(CUR)流量を0.17MPa、シースと補助ガスの両方の流量を0.38MPaに設定します。正イオンモードとマイナスイオンモードのイオンスプレー電圧をそれぞれ5.5kVと−4.5kVに、デクラスタリング電位(DP)電圧を80Vまたは−80Vに、衝突エネルギー(CE)を40eVまたは−25eVに、衝突エネルギー重ね合わせ(CES)を35eV±15eVに設定する。
      3. UPLC-MS/MSを使用してメーカーのプロトコルに従ってテストを実行します。 50〜1,000 m / zの質量範囲でMSを実行します。
      4. マッチングワークステーションプログラムと、検出モードの情報依存型集録、複数の質量欠陥フィルタ、ダイナミックバックグラウンド控除を組み合わせて、UPLC-MS/MSの結果を取得します。プール血清の品質管理サンプルを使用して、UPLC-MS/MS装置の再現性と安定性をテストし、従来のアプローチを検証します。研究サンプルの前に、品質管理サンプルを4回連続して注入し、5つの血清サンプルごとに注入します。

3. データ処理

1. データ準備
   1. 変換ソフトウェアを使用して、生データをmzXML形式に変換します。各サンプルの総イオン電流(TIC)データを正規化します。
      注:XCMS上に構築された内部Rベースのアプリケーション(www.lims2.com)を使用して、統合、アライメント、抽出、およびピーク検出のための情報を分析しました²⁷。
   2. 独自のMS² データベースを使用して代謝物アノテーションを実行します(www.lims2.com)。アノテーションのしきい値を 0.3²⁸ に設定します。
      注:内因性代謝産物は各グループで同定されました。.
2. 主成分分析と直交偏最小二乗判別分析
   1. 解析ソフトウェアを使用して、主成分分析(PCA)とモデリングを実行します。代謝物の標準化データを解析ソフトウェアにインポートします。次に、 自動調整 を使用して解析モデルを構築します。最後に、スコアを使用してPCAの スコア 散布図を取得します。
      注:各グループのクラスタリングは、PCAのスコア散布図を使用して取得されました。PCAは、介入なしで寸法削減によってサンプルを主にグループ化する教師なし分析モードです。
   2. 解析ソフトウェアを使用して、直交偏最小二乗判別分析(OPLS-DA)を実行します。
      1. CRおよびCRVグループの代謝物に関する標準化データを分析ソフトウェアにインポートします。
      2. CRグループから作成したCRグループにデータをインポートし、CRVグループのデータを作成したCRVグループにインポートします。
         注:OPLS-DAは教師あり分析モードであり、サンプルのグループ化が必要です。
      3. 次に、 自動調整 を使用して分析モデルを構築し、スコアを使用してOPLS-DAの スコア 散布図を取得します。最後に、 VIP を使用して、OPLS-DA の射影 (VIP) 値の変数有意性を取得します。
         注:CRおよびCRVグループの代謝物の予測(VIP)値の可変有意性は、OPLS-DAを通じて取得されました。
3. 潜在的な代謝差のある同定
   1. ステップ3.2.2.3でVIP値が1より大きい代謝物を選別します。
   2. 統計ソフトウェアを使用して、ステップ3.3.1でスチューデントのt検定によって選別された代謝物のP値を計算します。
      注:CRグループとCRVグループの潜在的な差別的代謝物の有意差は、スチューデントの t検定によって決定されました。潜在的な差次的代謝物は、スチューデント のt検定 p値が0.05<、投影(VIP)の変動有意性が1より大きい代謝物でした。表現は火山プロットを使用して達成されました。
4. 代謝差のある同定
   1. ステップ3.3で潜在的な差別的代謝物を選別します。ステップ3.1.2の結果を使用して、これらの異なる代謝物を特定します。
      注:少数の潜在的な分化代謝物が同定され、それらは候補の差動代謝物になりました。
   2. KEGGデータベースで照合する差分代謝物をスクリーニングします。ヒートマップを描画して、CRおよびCRVグループの異なる代謝物の変化を示します。
      注:少数の候補の差分代謝物がマッチングされ、それらは差分代謝物になりました。
5. 潜在的な代謝経路の検討
   1. さまざまな代謝物をメタボアナリスト(www.metaboanalyst.ca)データベースにアップロードします。
   2. 経路 分析 を使用して、潜在的な代謝経路を取得します。
      注:潜在的な代謝経路は、CRおよびCRVグループで得られました。 P 値とインパクト値は、クリティカルパスの選択において非常に重要な2つの指標でした。 P 値は衝撃値よりも重要でした。有意性は0.05< P 値で定義した。影響値が大きいほど、相関関係が良好でした。
   3. さまざまな代謝物をKEGG(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)データベースにアップロードして、潜在的な代謝経路を分析します。
      注:代謝経路の機能とPDの関係も考慮する必要があります。重要な代謝経路が得られた。
6. 血液に吸収された成分の同定
   1. 社内のMS² データベース(www.lims2.com)、ヒトメタボロームデータベース(HMDB)、およびマスバンクおよびケムスパイダーデータベースを使用して、CRおよびCRV抽出物の化学成分を特定します。
   2. CR群とCRV群の血液に吸収された成分を決定し、CR群とCRV群の成分を比較します。
      注:血液に吸収された成分は、CRまたはCRVグループで検出する必要がありますが、コントロールグループでは検出できません。
7. 統計解析
   1. 単変量分析(UVA)と分散分析(ANOVA)やスチューデント のt検定などの多変量統計手法を使用してデータを分析します。
      注:実験情報は、統計ソフトウェアを使用して平均±標準偏差(±SD)として提示されました。 P < 0.01は非常に有意な差と見なされ、 P < 0.05は有意差を表しました²⁸。

Results

月経困難症モデル実験の解析
対照群では、これらのラットにオキシトシンと安息香酸エストラジオールを腹腔内注射して痛みを引き起こしなかったため、30分以内に身もだえする反応はありませんでした。.モデル群、CR群、CRV群のラットは、オキシトシン注射後に実質的な身もだえ反応を示した。これらの結果は、月経困難症を誘発するためのエストラジオール安息香酸塩とオキシトシンの組み合わせの有効性を示しています。モデル群と対照群の間のPGF 2α、PGE 2_、およびPGF_2α/PGE₂レベルの差は有意であり(P < 0.001、P < 0.05)、モデルの有効性を実証しました(図1)。

Discussion

TCMの多種多様で性質が異なるため、これらのハーブは臨床診療で機能しないことがあり、これはTCMの不適切な処理とデコッキングが原因である可能性があります。TCMのメカニズムは、現代の科学技術の使用により明らかになりつつあります^29,30。この研究は、CRとCRVの両方がPDモデルラットで治療効果があり、CRVの治療効果がより重要であることを示しています。CRVの作用機序は、酢処理が血液に吸収されるCRの成分に影響を与え、リノール酸代謝と不飽和脂肪酸の生合成に関連している可能性があるという事実に関連している可能性があります。図10は、疼痛緩和におけるCRVの作用の潜在的な経路を示しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アセトニトリル	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20	Beckman コールター株式会社
エストラジオール安息香酸	上海マックリン生化学Co.、株式会社	C10042616
ギ酸	フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバ	177799
LC 30Aシステム	島津製作所、京都、日本	228-45162-46
オリーブオイル	上海元業バイオテクノロジー株式会社	H25A11P111909
オキシトシン合成	浙江省ペプチド生物学有限公司
ラットPGF2α ELISAキット	Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd	202101 ラット
PGFE2 ELISAキット	Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd	EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd	認証番号 SCXK (湖南省) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
Triple TOF 4600 system	SCIEX, Framingham, MA, USA	BK20641402
water	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	152720