Method Article

自己組織化ヒト間葉系幹細胞凝集体の構築、特性評価、および再生応用

DOI:

10.3791/64697

⸱

March 24th, 2023

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1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, The Fourth Military Medical University, 2Department of Preventive Dentistry, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3College of Life Science, Northwest University

In This Article

Summary

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本研究では、ヒト間葉系幹細胞の自己組織化に基づく凝集体の構築方法を検討し、頭蓋骨欠損の再生治療のための形態学的および組織学的特性を同定する。

Abstract

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間葉系幹細胞(MSC)は、自己複製能と多系統分化能を特徴とする様々な供給源から誘導することができ、特に歯、骨、軟骨、皮膚の再生に向けた再生医療の有望な候補として浮上しています。MSC凝集の自己組織化アプローチは、特に発達中の間葉系凝縮を模倣した細胞クラスターを構築するため、高密度の幹細胞送達、保存された細胞間相互作用、および微小環境ニッチとしての細胞外マトリックス(ECM)が可能になります。この方法は、効率的な細胞生着と生存を可能にすることが示されており、したがって、組織工学における外因性MSCの最適な適用を促進し、臨床臓器の再生を保護します。この論文では、臍帯間葉系幹細胞(UCMSC)に基づく自己組織化凝集体の構築と特性評価のための詳細なプロトコルと、頭蓋骨再生アプリケーションの例を提供します。この手順の実施は、組織工学と再生医療のための効率的なMSC移植戦略の確立を導くのに役立ちます。

Introduction

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間葉系幹細胞(MSC)の凝縮は、初期の器官形成1,2、特に骨、軟骨、歯、皮膚の形成において、体の正常な成長と発達を確保するために不可欠な段階です1,3,4。過去数十年の間に、培養出生後MSCと生分解性足場を組み合わせた組織工学療法は、骨形成5と軟骨再生6において重要な進歩を遂げました。しかし、スキャフォールドの使用には、免疫拒絶反応、細胞親和性および可塑性が低いなど、いくつかの欠点がある場合がある7。この点に関して、我々は、MSCsと沈着した細胞外マトリックス(ECM)8のみを含む、発生中の縮合現象を模倣したスキャフォールドフリーの自己組織化凝集体を提供するスフェロイド細胞培養法の適用可能性を検討した。凝集体の形成は、欠陥形状に一致するように適用可塑性を高め、移植用のMSCを収穫するためのタンパク質分解酵素による足場の移植と消化を回避します....

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Protocol

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注:すべての動物処置は、第4軍事医科大学の動物管理および使用委員会によって承認され、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドに従って実施されました。本研究では、市販の供給源から得られた凍結保存されたヒトUCMSCを使用しました( 資料表を参照)。ヒト細胞の使用は、第4軍事医科大学の倫理委員会によって承認されました。UCMSC は、手順を説明するための例として取り上げられました。頭蓋欠損は、移植手順を説明するための修復の必要性を示す例として取り上げられました。すべての実験を3回繰り返しました。

1. UCMSC骨材の構築

  1. UCMSCの準備と文化
    1. 10 mLの予熱リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を、滅菌バイオセーフティキャビネット内の新しい15 mL遠心チューブに加えます。
    2. 凍結したUCMSCを含む凍結チューブを液体窒素から取り外し、すぐに37°Cのウォーターバスに入れます。チューブを静かに振って、細胞の融解を迅速かつ完全に促進します。
      注意:凍結液中のジメチルスルホキシド(DMSO)は細胞毒性を引き起こす可能性があるため、手順全体を1分以内に完了する必要があります。
    3. 凍結チューブ内の細胞をわずかに懸濁し、10mLのPBSを含む遠心分離チューブに....

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Results

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UCMSCから骨材は、実験ワークフローに従って正常に構築できます(図1)。凝集体の品質は、形態学的観察と組織学的分析 を通じて 、使用前に評価する必要があります。形成されるラメラ構造は完全で緻密であり、細胞は顕微鏡観察によって織り交ぜられたパターンを形成する必要があります(図2A)。エッジのカールは、集約中に発見できます。オーバーカールしたエッジは、細胞のギャップを残す凝集の失敗を示します(図2B)。最終的な骨材は目視検査で確認でき、簡単に取り外すことができます(図2C)。凝集体は、生/死染色剤を使用してライブで観察できます(図2D)。生細胞の細胞質はカルセインAMで染色して緑色に見えることがありますが、死んだ細胞の核はEthD-1で染色して赤色に見えることがあります。すべての細胞核はヘキストで染色され、青色に見えます。SE.......

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Discussion

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組織工学バイオテクノロジーの進歩に伴い、最適な再生を達成できる高可塑性で長期生存細胞を含む埋め込み型構造を構築する戦略は、多くの科学者の焦点となっています。現在、MSCの移植方法には、細胞のみの方法、サイトカインで補完されたスキャフォールド6,24、幹細胞とスキャフォールドの組み合わせ5など、さまざまな方法があります。この論文では、細胞の自己組織化による特定の培地による凝縮クラスターの形成を含むMSC凝集体の構築と移植の効率的な方法を提示します。これは、採取と適用に便利な豊富な細胞ECMの利点を備えています。沈着したECMは、宿主と移植された凝集体との間の生体分子の交換を促進するための天然の足場として機能し、MSCの送達と生着を促進する25,26。このようにして凝集体を得ることにより、細胞は.......

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Disclosures

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著者には、開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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この研究は、中国国家自然科学基金会(81930025、82100969、82071075)および中国国家重点研究開発プログラム(2022YFA1104400および2021YFA1100600)からの助成金によって支援されました。国立基礎医学実験教育実証センター(AMFU)のご協力に感謝いたします。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% トリプシン-EDTA (1x)SigmaT4049細胞継代
自動脱水機LEICAASP200s脱水骨材
遠心分離Eppendorf5418R遠心
分離機 遠心分離管Thermo Nunc339650遠心分離
培養皿Thermo150466UCMSCs の培養
エタノールSCR10009218脱水骨材
致命的なウシ血清Sijiqing11011-8611UCMSCs
鉗子JZJD1080収穫骨材
グルタルアルデヒドProandy10217-1骨材
ヘマトキシリンとエオシン染色キットのC0105SHE染色
ヘキサメチルジシラザンSCR80068416乾燥骨材表面
Hoechst33342Sigma14533細胞核染色
L-グルタミンSigmaG5792UCMSCの
培養 生/死生存率/細胞毒性キット InvitrogenL3224Live/dead cell stain
Masson's Staining KitZHCCD069Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTCulture of UCMSCs
ParaffinLeica39601006Tissue embedding
ParaformaldehydeSaint-BioD16013凝集
PBS (1x)MeilunbioMA0015UCMSCの再懸濁と精製
ペニシリン/ストレプトマイシンプロセルライフサイエンスPB180120UCMSCの培養
ペントバルビタールナトリウムSigmaP3761動物麻酔
ポリスポリンファイザー目の乾燥を防ぐ
走査型電子顕微鏡日立s-4800SEM観察
はさみJZY00030動物の外科的切開
6ウェルプレートUCMSCsの培養140675Stitch
JinhuanF603閉鎖創
縫合糸XY4-0閉鎖
サーモスタット装置助成金V-0001-0005ウォーターバス
UCMSCsBai'ao UKK220201商業的にUCMSCの
ビタミンCのDiyibioDY40138-25gの骨材
キシレンSCR、10023418脱水骨材
機 の培養 固定 体の固定創 はを誘発し

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hall, B. K., Miyake, T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited. The International Journal of Developmental Biology. 39 (6), 881-893 (1995).
  2. Hall, B. K., Miyake, T.

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