自己組織化ヒト間葉系幹細胞凝集体の構築、特性評価、および再生応用

Summary

本研究では、ヒト間葉系幹細胞の自己組織化に基づく凝集体の構築方法を検討し、頭蓋骨欠損の再生治療のための形態学的および組織学的特性を同定する。

Abstract

間葉系幹細胞(MSC)は、自己複製能と多系統分化能を特徴とする様々な供給源から誘導することができ、特に歯、骨、軟骨、皮膚の再生に向けた再生医療の有望な候補として浮上しています。MSC凝集の自己組織化アプローチは、特に発達中の間葉系凝縮を模倣した細胞クラスターを構築するため、高密度の幹細胞送達、保存された細胞間相互作用、および微小環境ニッチとしての細胞外マトリックス(ECM)が可能になります。この方法は、効率的な細胞生着と生存を可能にすることが示されており、したがって、組織工学における外因性MSCの最適な適用を促進し、臨床臓器の再生を保護します。この論文では、臍帯間葉系幹細胞(UCMSC)に基づく自己組織化凝集体の構築と特性評価のための詳細なプロトコルと、頭蓋骨再生アプリケーションの例を提供します。この手順の実施は、組織工学と再生医療のための効率的なMSC移植戦略の確立を導くのに役立ちます。

Introduction

間葉系幹細胞(MSC)の凝縮は、初期の器官形成^1,2、特に骨、軟骨、歯^{、皮膚の形成}において、体の正常な成長と発達を確保するために不可欠な段階です^1,3,4。過去数十年の間に、培養出生後MSCと生分解性足場を組み合わせた組織工学療法は、骨形成⁵と軟骨再生⁶において重要な進歩を遂げました。しかし、スキャフォールドの使用には、免疫拒絶反応、細胞親和性および可^{塑性が低い}など、いくつかの欠点がある場合がある7。この点に関して、我々は、MSCsと沈着した細胞外マトリックス(ECM)⁸のみを含む、発生中の縮合現象を模倣したスキャフォールドフリーの自己組織化凝集体を提供するスフェロイド細胞培養法の適用可能性を検討した。凝集体の形成は、欠陥形状に一致するように適用可塑性を高め、移植用のMSCを収穫するためのタンパク質分解酵素による足場の移植と消化を回避します⁹。

MSC凝集体は、骨、歯髄、歯周組織、皮膚¹⁰などの組織や臓器の再生に広く使用されています。種子細胞の候補として、骨髄MSC(BMMSC)、臍帯MSC(UCMSC)、脂肪組織由来間質細胞(ADSC)、歯科用MSC(例えば、歯髄間葉系幹細胞[DPSC]、乳歯間葉系幹細胞[SHED]¹¹、歯周間葉系幹細胞[PDLSC]⁾¹²など、多くの異なるタイプのMSCを選択することができます。.過去10年間に、アシステッドアグリゲーションや自己組織化凝集など、三次元細胞クラスターの多くの技術が開発されました。しかし、補助凝集アプローチは、ECMを産生し、均一で密集体を形成するのに弱いことが多く、したがって、生理学的条件^13、14、15を模倣するのには適していない。さらに、いくつかの補助凝集法は、安定した構造を形成するために細胞-材料相互作用を必要とするが、16,17,18,19、^一方、この自己組織化凝集法は、一般に広範囲のMSCsに利用可能である。特に、我々の最近の臨床試験では、MSC凝集体は、損傷したヒト切歯への移植後に歯髄-象牙質複合体および歯周膜を再生するために成功裏に使用されている。 これらは、生理学的構造と機能を持つde novo組織再生を達成しました^20,21。

この論文では、MSC凝集体の構築と特性評価、 およびin vivo 移植の徹底的な手順について説明します。このアプローチは、幹細胞の応用に基づいて、歯、骨、軟骨、皮膚などの組織の欠陥を修復することを目指す研究者の注目を集めます。この方法は、シンプルで便利で、追加の足場なしで細胞とECMから完全に構成されており、長期間培養して緻密で安定した凝集体^{を得ることができる22}。一方、この方法で培養された凝集体はECMを豊富に含んでおり、これはこれらの高密度細胞の発達中のニッチを模倣し、したがって組織再生^{を促進する23}。構築プロセスは、細胞の調製と培養、および細胞凝集体の自己組織化形成と収穫の2つの段階に分けることができます。凝集体の特性評価には、倒立型光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡(SEM) による 形態学的同定、ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)およびマッソン染色 による 組織学的解析が含まれます。形成された凝集体は、頭蓋骨欠損を修復するための再生移植のために実証されました。この手順の実施は、組織工学と再生医療のための効率的なMSC移植戦略の確立を導くのに役立ちます。

Protocol

注:すべての動物処置は、第4軍事医科大学の動物管理および使用委員会によって承認され、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドに従って実施されました。本研究では、市販の供給源から得られた凍結保存されたヒトUCMSCを使用しました( 資料表を参照)。ヒト細胞の使用は、第4軍事医科大学の倫理委員会によって承認されました。UCMSC は、手順を説明するための例として取り上げられました。頭蓋欠損は、移植手順を説明するための修復の必要性を示す例として取り上げられました。すべての実験を3回繰り返しました。

1. UCMSC骨材の構築

1. UCMSCの準備と文化
   1. 10 mLの予熱リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を、滅菌バイオセーフティキャビネット内の新しい15 mL遠心チューブに加えます。
   2. 凍結したUCMSCを含む凍結チューブを液体窒素から取り外し、すぐに37°Cのウォーターバスに入れます。チューブを静かに振って、細胞の融解を迅速かつ完全に促進します。
      注意:凍結液中のジメチルスルホキシド(DMSO)は細胞毒性を引き起こす可能性があるため、手順全体を1分以内に完了する必要があります。
   3. 凍結チューブ内の細胞をわずかに懸濁し、10mLのPBSを含む遠心分離チューブにすべての内容物を移します(ステップ1.1.1)。サンプルを100 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、10mLのPBSで細胞を洗浄します。
   4. サンプルを100 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、10%のウシ胎児血清(FBS)、1%のペニシリン-ストレプトマイシン、および584 mg / Lグルタミンを含む完全なα-最小必須培地(α-MEM)で細胞を穏やかに再懸 ?? します。.
   5. 再懸濁した細胞を10 cmの培養皿(遠心分離後の細胞の総量に応じて、1つのチューブに1〜2皿の皿で、皿あたり×5〜10⁶ 細胞の密度で播種します)。ディッシュに完全なα-MEM培地を合計10mLまで加えます。
   6. 皿を静かに振って細胞を分散させます。加湿チャンバー内で、5%の_CO2 を含む37°Cでディッシュをインキュベートします。一晩インキュベートした後、上清培地を廃棄し、PBS 1-2xを5 mL加えて非接着性細胞を除去します。新鮮な完全α-MEM培地10 mLを加えます。培養培地は2日ごとに交換してください。
   7. 細胞継代では、細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、上清を捨て、細胞を5mLのPBSで洗浄して培地を完全に除去します。細胞を0.25%トリプシン-1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)の2 mLに溶かし、37°Cで2分間インキュベートします。
   8. 顕微鏡下で細胞が丸くなり、細胞間結合が壊れたら、細胞構造をあまり乱さずに細胞を皿から分離します。4 mLの完全α-MEM培地を追加してトリプシンを中和します。.
   9. 新鮮な15 mLの遠心分離チューブでピペッティングすることにより、皿から細胞を繰り返し穏やかに収集します。サンプルを100 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を完全α-MEM培地で再懸濁し、新鮮な培養皿またはウェルプレートに播種します。培養培地は2日ごとに交換してください。
      注:欠陥領域のサイズに応じて、25 mm³ の欠陥は、凝集体を形成するために培養された6ウェルプレート細胞のウェルを使用する必要があります。
2. 骨材の形成と収穫
   1. 10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、および 584 mg/L グルタミンを含む α-MEM に 50 μg/mL のビタミン C を添加して、細胞凝集体誘導培地を調製します。
      注意: ビタミンCを使用すると、光にさらされるとビタミンCが酸化して効果がなくなるため、ビタミンCを使用するときは直接光にさらさないようにする必要があります。
   2. ステップ1.1.12の細胞が95%のコンフルエンスに達したら(補足図S1)、培地を細胞凝集誘導培地に変更します。新鮮な細胞凝集体誘導培地を2日ごとに交換してください。
   3. 7〜10日間の誘導後(誘導時間の長さは幹細胞の種類によって異なり、UCMSCのエッジでは~7日であることが多い)、顕微鏡下で、ディッシュの底から厚いエッジが分離された成形凝集体を探します。
   4. 培地を捨て、PBSで細胞を2回優しく洗浄します。小さな滅菌鉗子を使用して骨材を端から中央にそっと押し込み、骨材を折ります。
   5. 場合によっては、UCMSC が中心に向かって自発的にカールして、固体の結露を形成することがあります。この構造は、ステップ 1.2.4 で取得した集計と同等です。

2. 凝集体の形態学的同定

1. 一般観察と顕微鏡観察
   1. 骨材は緻密で一体化しており、剥離や移植時の引っ張りなどの機械的な力によって簡単に損傷しないことを確認します。
   2. 顕微鏡で、織り模様のある特定の厚さの膜のような構造を探します。
2. 生細胞/死細胞染色
   1. 6ウェルプレートに細胞を1ウェルあたり10個×10個の⁶ 細胞の密度で播種します。
   2. 2 μM calcein AM と 4 μM EthD-1 ワーキング溶液を調製し、PBS を使用します。
   3. 0.3%トリトンを細胞に5分間添加し、PBSで3回洗浄して細胞を死滅に誘導し、染色のコントロールとして使用します。
   4. 細胞、凝集体、および死細胞をPBSで2回洗浄します。
   5. ステップ 2.2.2 で調製した PBS 100 μL と調製した染色液 100 μL を各ウェルに加えます。
   6. サンプルを室温で30分間インキュベートし、サンプルをPBSで2回洗浄します。
   7. 各ウェルに200 μLの10 μg/mL Hoechstを加え、サンプルをRTで5分間インキュベートします。
   8. 蛍光顕微鏡で観察します。
3. SEM観察
   1. ステップ1.2.4または1.2.5で得られた凝集体をシードし、細胞に誘導します。ステップ1.2.4で凝集体が形成された後、細胞をPBSで洗浄します。または 1.2.5.
   2. グルタルアルデヒドを使用して細胞を少なくとも4時間固定します。
   3. サンプルをPBSで洗浄し、エタノールの30%、50%、70%、80%、90%、100%までの勾配濃度でそれぞれ5分間脱水します。2倍を無水エタノールで処理します。
   4. 骨材を3mLのヘキサメチルジシラザンに30分間浸します。すべての液体を吸引し、サンプルを自然に完全に乾燥させます。
      注意:ヘキサメチルジシラザンは揮発性で毒性が高いため、プロセス全体をドラフト内で実行する必要があります。
   5. 乾燥させたサンプルを両面カーボンテープでサンプルテーブルに貼り付け、表面を金属でコーティングします。サンプルを室温(RT)で数日間保存します。
   6. SEMで観察します。
      1. サンプルを交換しますampマシン内のファイル。マシン電圧を5 kに、焦点距離を~12 mmに調整します。鮮明な画像が表示されるまでフォーカスバーを調整します。
      2. 低倍率で画像を撮影します。倍率を調整してピントを合わせ直すと、より高い倍率の画像が得られます。
         注意:表面形態の破壊を避けるために、観察前に凝集体の表面に触れることはできません。

3. 凝集体の組織学的解析

1. サンプルの固定と切片化
   1. ステップ1.2.4または1.2.5で得られた凝集体を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで少なくとも24時間固定します。固定後、PBSで洗浄し、サンプルを埋め込みカセットに一晩入れて流水ですすいでください。
   2. メーカーの指示に従って、自動脱水機を使用して、グラジエントエタノール、キシレン、パラフィンを使用してサンプルを脱水します。全体のプロセスは次の通りである:RTで2時間のための85%エタノール、RTで2時間のための95%エタノール、RTで2時間のための95%エタノール、RTで2時間のための100%エタノール、RTで1.5時間のための100%エタノール、RTで45分のためのキシレン、RTで45分のキシレン、RTで30分のパラフィン、 パラフィンを室温で1.5時間、最後にパラフィンを60°Cで2時間。
   3. サンプルをパラフィンに埋め込みます。厚さ約5μmの切片を調製し、カチオン性スライドに接着し、スライドを45°Cで2時間乾燥させます。
   4. キシレンを15分、2回、100%、90%、80%、70%エタノール(それぞれ5分間)で順次脱ワックスします。
   5. スライドを流水で3回、5分間ゆっくりとすすぎます。
2. HE染色
   1. ヘマトキシリンで3〜5分間染色し、水ですすぎ、組織の周りの余分な水分を慎重に取り除きます。
   2. 1%塩酸を含むエタノールで3〜5秒間分画し、流水ですすいでください、その間に色が少し明るく青くなります。ティッシュの周りの余分な水分を取り除きます。
   3. エオシンで1分間染色し、流水ですすぎ、組織周辺の余分な水分を取り除きます。
   4. 70%、80%、90%、100%エタノールで各10秒間、キシレンで15分間、2回脱水し、ドラフト内で自然乾燥させてからシートを密封します。
   5. 中性樹脂ドロップを追加し、スライドをカバーガラスで密封します。光学顕微鏡で観察します。
3. マッソンのトリクローム染色
   1. ヴァイゲルトの鉄ヘマトキシリンで5分間染色し、水ですすぎ、拭いて乾かします。
   2. 1%塩酸を含むエタノールで3〜5秒間分画し、流水ですすいでください、その間に色が少し明るく青くなります。表面を拭いて乾かします。
   3. Lixinの赤い酸性マゼンタ溶液で5〜10分間染色し、蒸留水ですばやくすすいでください。
   4. ホスホモリブジン酸水溶液で3〜5分間処理します。
   5. アニリンブルー溶液で5分間、水洗いせずに直接再染色します。
   6. 1%氷酢酸で1分間処理します。
   7. 70%、80%、90%、100%エタノールで各10秒間、キシレンで15分間、2回脱水し、ドラフト内で自然乾燥させてからシートを密封します。
   8. 中性樹脂ドロップを追加し、スライドをカバーガラスで密封します。光学顕微鏡で観察します。

4. 移植

1. ヌードマウスに50 mg / kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で麻酔をかけます。.
   注:フットパッドを挟んだときの角膜反射と四肢の反応がないことに基づいて、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。乾燥を防ぐために目の軟膏を塗ります。
2. ヨードフォアで消毒した後、ヌードマウスの耳の後ろの皮膚に横切開(~3-4cm)を滅菌済みの小さなハサミで切り取ります。
3. 皮膚を前方に引っ張って頭蓋骨を露出させます。計画された欠損領域の端を11#ブレードで軽く描き、骨片を取り除きます。欠陥領域は直径約4mmの円形領域です。生理食塩水を使用して創傷を洗い流し、適切な止血を行います。.
4. ステップ1.2.5または1.2.6で得られた骨材を滅菌ガーゼに浸して、表面の水分を吸収してから移植します。骨材をその領域に置き、わずかに加圧して欠陥を埋めます。
5. 引っ張った後、インプラントが固定されていることを確認するために皮膚を交換してください。1/2、4、4×10の角度付きステッチと4-0縫合糸で切開部を閉じます。
6. 手術後、動物を活性化するまで温め直した毛布の上に置いてから、ケージに戻します。
   注:動物は、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、放置してはいけません。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻されません。

Results

UCMSCから骨材は、実験ワークフローに従って正常に構築できます(図1)。凝集体の品質は、形態学的観察と組織学的分析 を通じて 、使用前に評価する必要があります。形成されるラメラ構造は完全で緻密であり、細胞は顕微鏡観察によって織り交ぜられたパターンを形成する必要があります(図2A)。エッジのカールは、集約中に発見できます。オーバーカールしたエッジは、細胞のギャップを残す凝集の失敗を示します(図2B)。最終的な骨材は目視検査で確認でき、簡単に取り外すことができます(図2C)。凝集体は、生/死染色剤を使用してライブで観察できます(図2D)。生細胞の細胞質はカルセインAMで染色して緑色に見えることがありますが、死んだ細胞の核はEthD-1で染色して赤色に見えることがあります。すべての細胞核はヘキストで染色され、青色に見えます。SE...

Discussion

組織工学バイオテクノロジーの進歩に伴い、最適な再生を達成できる高可塑性で長期生存細胞を含む埋め込み型構造を構築する戦略は、多くの科学者の焦点となっています。現在、MSCの移植方法には、細胞のみの方法、サイトカインで補完されたスキャフォールド^6,24、幹細胞とスキャフォールドの組み合わせ5など、さまざまな方法^{があります。}この論文では、細胞の自己組織化による特定の培地による凝縮クラスターの形成を含むMSC凝集体の構築と移植の効率的な方法を提示します。これは、採取と適用に便利な豊富な細胞ECMの利点を備えています。沈着したECMは、宿主と移植された凝集体との間の生体分子の交換を促進するための天然の足場として機能し、MSCの送達と生着を促進する^25,26。このようにして凝集体を得ることにより、細胞は...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% トリプシン-EDTA (1x)	Sigma	T4049	細胞継代
自動脱水機	LEICA	ASP200s	脱水骨材
遠心分離	Eppendorf	5418R	遠心
分離機 遠心分離管	Thermo Nunc	339650	遠心分離
培養皿	Thermo	150466	UCMSCs の培養
エタノール	SCR	10009218	脱水骨材
致命的なウシ血清	Sijiqing	11011-8611	UCMSCs
鉗子	JZ	JD1080	収穫骨材
グルタルアルデヒド	Proandy	10217-1	骨材
ヘマトキシリンとエオシン染色キット	の	C0105S	HE染色
ヘキサメチルジシラザン	SCR	80068416	乾燥骨材表面
Hoechst33342	Sigma	14533	細胞核染色
L-グルタミン	Sigma	G5792	UCMSCの
培養 生/死生存率/細胞毒性キット	Invitrogen	L3224	Live/dead cell stain
Masson's Staining Kit	ZHC	CD069	Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Culture of UCMSCs
Paraffin	Leica	39601006	Tissue embedding
Paraformaldehyde	Saint-Bio	D16013	凝集
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	UCMSCの再懸濁と精製
ペニシリン/ストレプトマイシン	プロセルライフサイエンス	PB180120	UCMSCの培養
ペントバルビタールナトリウム	Sigma	P3761	動物麻酔
ポリスポリン	ファイザー		目の乾燥を防ぐ
走査型電子顕微鏡	日立	s-4800	SEM観察
はさみ	JZ	Y00030	動物の外科的切開
6ウェルプレート	UCMSCs	の培養	140675Stitch
	Jinhuan	F603	閉鎖創
縫合糸	XY	4-0	閉鎖
サーモスタット装置	助成金	V-0001-0005	ウォーターバス
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	商業的にUCMSCの
ビタミンC	のDiyibio	DY40138-25g	の骨材
キシレン	SCR	、10023418	脱水骨材