実験的に進化した集団における構造変異のダイナミクスの追跡

Summary

我々は、実験的進化凍結アーカイブに容易に適応できる非一塩基多型対立遺伝子動態を追うための費用対効果の高い方法を開発しました。トリプレットPCR技術を自動並列キャピラリー電気泳動と組み合わせて、実験的進化の過程で挿入対立遺伝子の相対頻度を定量化しました。

Abstract

構造変異(SV)(すなわち、欠失、挿入、重複、および逆位)は、表現型の変異において、そしてその結果として疾患の決定または新しい環境への適応などのプロセスにおいて重要な役割を果たすことが現在知られている。ただし、一塩基変異体は、おそらく検出が容易であり、表現型の影響が予測しやすいため、SVよりもはるかに注目されています。ショートリードおよびロングリードのディープシーケンシング技術の開発により、SVの検出が大幅に改善されましたが、プールシーケンシング(poolseq)データからの頻度の定量化は依然として技術的に複雑で高価です。

ここでは、研究者がSV対立遺伝子頻度のダイナミクスを追跡することを可能にする、かなり単純で安価な方法を紹介します。適用例として、細菌の実験進化集団における挿入配列(IS)挿入の頻度を追跡します。この方法は、野生型(WT)および誘導対立遺伝子の増幅によって産生されるアンプリコンのサイズが少なくとも5%異なり、それらの増幅効率が類似するように、構造変異境界周辺のプライマーのトリプレットの設計に基づいている。次に、各アンプリコンの量を平行キャピラリー電気泳動によって決定し、検量線に正規化します。この方法は、他の構造的変異体(欠失、重複、逆位)の頻度の定量化や、患者内の病原体集団を含む自然集団のpool-seqアプローチに簡単に拡張できます。

Introduction

構造変異体(SV)はゲノム配列の変化であり、一般に50bp以上に影響を及ぼす。説明されている SV の 4 つのカテゴリは、大きな挿入、大きな削除、反転、および重複です。最近まで、表現型の影響や疾患の遺伝的決定基としての役割、または適応への寄与の観点から、構造変異よりも一塩基変異体(SNV)に多くの注意が向けられてきました。これはおそらく、SNVの検出とその表現型効果の予測の両方が簡単だからです。しかし、ショートリードおよびロングリードのディープシーケンシング技術は、少なくとも単一の個人またはクローンゲノムにおけるSVの検出を大幅に改善しました¹。並行して、それらの表現型効果はよりよく特徴付けられており、ヒト疾患の遺伝的決定要因^2,3または新しい環境^{への適応4}としてのそれらの含意の多くの例が文書化されている。

多くの場合、移動性遺伝要素(MGE)の挿入による欠失と挿入は、一塩基多型(SNP)よりもはるかに破壊的であり、フレームシフト変異とタンパク質構造修飾につながります。遺伝子内の欠失およびMGE挿入は、ほとんどの場合、遺伝子の不活性化をもたらし、挿入配列(IS)にプロモーターまたは終結配列が含まれている場合、非コード領域への挿入は、隣接する遺伝子の抑制または構成的....

Protocol

このプロトコルを設定するには、祖先シーケンス内の挿入、削除、反転、または複製ポイントに関する正確な知識が必要です。この情報は通常、終点または中間点サンプルの全ゲノムシーケンス(WGS)によって取得されます。以下のプロトコールでは、大腸菌の実験進化集団におけるmutS遺伝子へのIS10挿入の頻度に従う代表的なケースと並んで、挿入変異の場合の一般原則が各ステップに示されています。この集団において、エンドポイント集団のWGSは、位置2,463と2,471の間に1,329 bp IS10の挿入を同定し、その結果、この挿入部位が重複した。この方法は他の3つのSVタイプに適用可能であり、それぞれのケースの特異性が議論で与えられています。

1. トリプレットプライマーの設計

1. 従来のプライマー設計手法(18-24 bp、40%-60%GC含量、可能な場合はG/Cペアで開始/終了_、Tm差 5°C)を使用して、プライマーFW1およびRV1を製造し<。変異対立遺伝子挿入部位の周りのWT対立遺伝子上の短いアンプリコンを増幅するプライマーを設計します(図1)。
   注:アンプリコンのサイズは、キャピラリー電気泳動で使用されるDNAサイズのはしごに沿って、100 bpから最大3,000 bpの範囲で指定できます。この例では、155 ....

Results

第1,000世代でS2.11集団から分離された祖先クローンとハイパーミューテータークローンから抽出したDNAを用いて、 図2に示す検量線を確立した。実験室で調製されたDNAミックスから、平行キャピラリー電気泳動装置によって測定された実際の変異体比率は、傾き1.0706の線形関係によってリンクされ、R² は0.9705でした。さらに、生物学的複製の間には良好な一致がありました。標準偏差は、標準曲線の9点で0.61〜17.74でした。

図2.......

Discussion

ここでは、実験進化集団における新たな適応SV対立遺伝子のダイナミクスを追跡できる費用対効果の高い方法を提案しました。この方法は、従来のPCR技術と自動化された並列キャピラリー電気泳動を組み合わせて、2つの対立遺伝子の相対量を決定することができます。一度セットアップすると、多くのサンプルの対立遺伝子比率を並行して定量化でき、WGSよりもはるかに安価です。この方法は、非SNP変異のアンプリコンシーケンシングと同等であり、大規模なSVのアンプリコンシーケンシングの技術的限界に対する解決策と見なすことができます。この方法では、PCRバイアスを克服する検量線を使用して、非SNP変異体の割合を正確に定量化できることを示しました(図2)。

SV対立遺伝子ダイナミクスの特性評価は、並行時間ダイナミクスを通じてリンクされた突然変異を特定したり、選択係数を計算して時間の経過に伴う変化を特定したりするのに役立ちます。ここで提示した適用例では、エンドポイントWGSによって、ハイパーミューテーターがさまざまな実験的進化大腸菌集団で.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Skirted PCR Plate	4titude	4Ti - 0740	PCR
アガロース分子生物学グレード	Eurogentec	EP-0010-05	アガロースゲル電気泳動
Agilent DNF-474 HS NGS フラグメントキット フラグメント分析システム用クイックガイド	Agilent		PDF 取扱説明書
バッファー TBE	Panreac appliChem	A4228,5000PC	アガロースゲル電気泳動
較正済み 使い捨て接種ループと針	LABELIANS	8175CSR40H	細菌培養
Dneasy 血液および組織キット	Qiagen	69506	DNA抽出
電気泳動電源	Amilabo	ST606T	アガロースゲル電気泳動
フラグメントアナライザー 自動CEシステム	Agilent		パラレルキャピラリー電気泳動
フラグメントDNAラダー	Agilent	DNF-396、範囲 1-6000bp	パラレルキャピラリー電気泳動
ゲンタマイシン硫酸塩バイオ試薬	Sigma-Aldrich	G1264-1G	細菌培養
高感度希釈マーカー	Agilent	DNF-373	パラレルキャピラリー電気泳動
高感度 NGS 定量分析キット	Agilent	DNF-474	パラレルキャピラリー電気泳動
ラダー クイックロード 1 kb プラス DNA ラダー	NEB	N0469S	アガロースゲル電気泳動
LB ブロス、ベジトンニュートリセレクトプラス	ミリポア	28713	細菌培養
マスターミックス PCR ハイフィデリティ フュージョンフラッシュ サー	モフィッシャーサイエンティフィック	F548L	PCR
プライマー	ユーロジェンテック		PCR
Prosize データ解析ソフトウェア v.4	Agilent	V.4	パラレルキャピラリー電気泳動
量子ビットアッセイ	Invitrogen	MAN0010876	DNA 定量
Qubit dsDNA HS Assay Kit	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	DNA 定量
サーモサイクラー	Eppendorf	EP グラジエント	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		アガロースゲル 電気泳動 視覚化
注射剤用水	Aguettant	PROAMP	PCR