実験的に進化した集団における構造変異のダイナミクスの追跡

Summary

我々は、実験的進化凍結アーカイブに容易に適応できる非一塩基多型対立遺伝子動態を追うための費用対効果の高い方法を開発しました。トリプレットPCR技術を自動並列キャピラリー電気泳動と組み合わせて、実験的進化の過程で挿入対立遺伝子の相対頻度を定量化しました。

Abstract

構造変異(SV)(すなわち、欠失、挿入、重複、および逆位)は、表現型の変異において、そしてその結果として疾患の決定または新しい環境への適応などのプロセスにおいて重要な役割を果たすことが現在知られている。ただし、一塩基変異体は、おそらく検出が容易であり、表現型の影響が予測しやすいため、SVよりもはるかに注目されています。ショートリードおよびロングリードのディープシーケンシング技術の開発により、SVの検出が大幅に改善されましたが、プールシーケンシング(poolseq)データからの頻度の定量化は依然として技術的に複雑で高価です。

ここでは、研究者がSV対立遺伝子頻度のダイナミクスを追跡することを可能にする、かなり単純で安価な方法を紹介します。適用例として、細菌の実験進化集団における挿入配列(IS)挿入の頻度を追跡します。この方法は、野生型(WT)および誘導対立遺伝子の増幅によって産生されるアンプリコンのサイズが少なくとも5%異なり、それらの増幅効率が類似するように、構造変異境界周辺のプライマーのトリプレットの設計に基づいている。次に、各アンプリコンの量を平行キャピラリー電気泳動によって決定し、検量線に正規化します。この方法は、他の構造的変異体(欠失、重複、逆位)の頻度の定量化や、患者内の病原体集団を含む自然集団のpool-seqアプローチに簡単に拡張できます。

Introduction

構造変異体(SV)はゲノム配列の変化であり、一般に50bp以上に影響を及ぼす。説明されている SV の 4 つのカテゴリは、大きな挿入、大きな削除、反転、および重複です。最近まで、表現型の影響や疾患の遺伝的決定基としての役割、または適応への寄与の観点から、構造変異よりも一塩基変異体(SNV)に多くの注意が向けられてきました。これはおそらく、SNVの検出とその表現型効果の予測の両方が簡単だからです。しかし、ショートリードおよびロングリードのディープシーケンシング技術は、少なくとも単一の個人またはクローンゲノムにおけるSVの検出を大幅に改善しました¹。並行して、それらの表現型効果はよりよく特徴付けられており、ヒト疾患の遺伝的決定要因^2,3または新しい環境^{への適応4}としてのそれらの含意の多くの例が文書化されている。

多くの場合、移動性遺伝要素(MGE)の挿入による欠失と挿入は、一塩基多型(SNP)よりもはるかに破壊的であり、フレームシフト変異とタンパク質構造修飾につながります。遺伝子内の欠失およびMGE挿入は、ほとんどの場合、遺伝子の不活性化をもたらし、挿入配列(IS)にプロモーターまたは終結配列が含まれている場合、非コード領域への挿入は、隣接する遺伝子の抑制または構成的発現をもたらし得る⁵。必須遺伝子のノックアウトは細菌の適応度に明らかな有害な影響を及ぼしますが、非必須遺伝子の喪失は場合によっては有益です。それらの固有のコストにもかかわらず、重複も有利であり得、そしてそれらが遺伝子投与量の変化をもたらすので適応に関与する。特定のタンパク質の活性の増加は、条件に応じて有利であり得る⁶.

微生物の実験的進化集団は通常、クローンから始まります。この遺伝的多様性の最初の欠如は、試験管に特徴的な「閉鎖環境」と相まって、水平遺伝子導入および組換えによる遺伝子獲得による進化の可能性を非常に限定的にする。これらの特定の条件では、欠失、重複、およびゲノム内MGE挿入の適応への寄与が特に重要です。細菌はしばしば機能喪失変異(主に欠失またはMGE挿入による)によって適応し、安定した、しばしば栄養豊富な単一培養人工環境では役に立たない遺伝子に影響を与えます⁷。最も長く続いている 大腸菌 進化実験では、IS150の挿入は50,000世代後に進化した集団の間で特に頻繁であり、IS要素は、祖先の点突然変異率を保持している集団で高頻度に達する突然変異の35%を占めています⁸。

進化と再配列の研究は、実験的進化と次世代シーケンシング(NGS)技術を組み合わせて、細菌が表現型およびゲノムレベルで、さまざまな炭素およびエネルギー源、抗生物質、浸透圧ストレスなどのさまざまな環境条件およびストレスにどのように適応するかを調査します9,10,11.これらの研究は通常、実験終点でのみ、場合によってはいくつかの中間時点¹²、^13、14で^、進化した集団またはクローンに関するゲノム情報を取得します。これらのデータは、特定の環境への適応に関与する遺伝子と経路に関する洞察を提供しますが、研究者がde novoの出現および掃引対立遺伝子のダイナミクスを経時的に追跡することはめったにありません。

これらのダイナミクスに従う1つのアプローチは、限られた数の関心のある分離対立遺伝子を選択し(それらが影響を与える遺伝子の機能のため、独立した集団で並行してスイープするためなど)、アンプリコンシーケンシングを使用して対立遺伝子比率を定量化し、同じシーケンシング実行で多くの時点をプールすることです¹⁵。この方法は、実験¹⁶ および天然17の微生物集団における小型変異体(SNPまたは^1bp インデル)の動態を追跡するために首尾よく使用されています。ただし、より大きなインデルまたはMGE挿入の場合、アンプリコンのサイズの違いによりPCR効率の違いが誘発され、リードと対立遺伝子の比率の関係が歪められます。場合によっては、2つの対立遺伝子のサイズ差がアンプリコンの古典的な長さよりも優れています。ここでは、トリプレットPCR技術と自動並列キャピラリー電気泳動を組み合わせて、サイズ識別に基づいて挿入対立遺伝子の相対頻度を定量化しました。このアプローチにより、十分に活用されていない実験時点を利用して、新たな変異対立遺伝子のダイナミクスを決定し、費用対効果の高い方法で、その頻度を固定または喪失まで追跡することができます。この方法を適用して、IS10挿入によって変異した新たな mutS^対立遺伝子を追跡し、変異遺伝子型にハイパーミューテーター表現型を提供しました。

この方法では、サイズ差が≥5%の2つの標的対立遺伝子が必要です。第一に、プライマートリプレットは、共通のプライマーを共有する同様のサイズのフラグメントを生成するように設計されています。次に、PCR条件を最適化し、野生型(WT)と変異型gDNAの混合物を使用して検量線を作成します。最後に、サンプルをPCRで増幅し、各対立遺伝子の相対頻度を並列定量的キャピラリー電気泳動で定量します。

Protocol

このプロトコルを設定するには、祖先シーケンス内の挿入、削除、反転、または複製ポイントに関する正確な知識が必要です。この情報は通常、終点または中間点サンプルの全ゲノムシーケンス(WGS)によって取得されます。以下のプロトコールでは、大腸菌の実験進化集団におけるmutS遺伝子へのIS10挿入の頻度に従う代表的なケースと並んで、挿入変異の場合の一般原則が各ステップに示されています。この集団において、エンドポイント集団のWGSは、位置2,463と2,471の間に1,329 bp IS10の挿入を同定し、その結果、この挿入部位が重複した。この方法は他の3つのSVタイプに適用可能であり、それぞれのケースの特異性が議論で与えられています。

1. トリプレットプライマーの設計

1. 従来のプライマー設計手法(18-24 bp、40%-60%GC含量、可能な場合はG/Cペアで開始/終了_、Tm差 5°C)を使用して、プライマーFW1およびRV1を製造し<。変異対立遺伝子挿入部位の周りのWT対立遺伝子上の短いアンプリコンを増幅するプライマーを設計します(図1)。
   注:アンプリコンのサイズは、キャピラリー電気泳動で使用されるDNAサイズのはしごに沿って、100 bpから最大3,000 bpの範囲で指定できます。この例では、155 bpのアンプリコンが増幅されました。ここで選択したフラグメントサイズが小さいため、IS10挿入配列全体のオフターゲット増幅が防止されます(セクション2を参照)。
2. 挿入配列内に第2のフォワードプライマーFW2を設計し、WTアンプリコンよりも約5%大きいまたは小さい第2のアンプリコンを生成する(図1)。この5%のサイズ差は、並列キャピラリー電気泳動装置が確実に区別できる最小サイズ差です。したがって、2つのアンプリコンのサイズの違いがあり、相対的な閾値にできるだけ近いようにプライマーを設計します。
   注意_{: Tm差} とプライマーダイマーの形成を最小限に抑えるようにしてください。この例では、第2のフォワードプライマーは、WTアンプリコンよりも71bp大きい226bpアンプリコンを生成するように設計した。この代表的な例では、プライマー配列は以下の通りである:
   FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC
   RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC
   FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG

図1:mutS WT遺伝子および変異体mutS IS10挿入におけるトリプレットプライマー設計のスキーマ。黒い三角は、mutS遺伝子におけるIS10挿入部位を表す。WT遺伝子は青色で、IS10はオレンジ色です。プライマーFW1およびRV1はIS10挿入部位にフラグを立て、155 bp WTアンプリコンを生成します。RV1プライマーとIS10内プライマーFW2は、2番目の226 bpアンプリコンを生成します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. PCR条件の最適化

1. 固定WTおよび変異対立遺伝子クローンの一晩培養を増殖させる。
2. 任意のキットを使用してDNAを抽出します。
3. DNAを定量します。
4. WTおよび変異型DNAの抽出液を5 ng/μLに希釈してDNAサンプルを調製し、2つのDNAサンプルを50/50の比率で混合します。
5. 20 μLの反応容量で、すぐに使用できるPCRマスターミックス2倍、0.5 μM FW1プライマー、1 μM RV1プライマー、および0.5 μM FW2プライマーを使用して、3つのDNAサンプル(WT、変異体、50/50ミックス)のうち10 ngを増幅します。2%アガロースゲルを使用して、従来の電気泳動によってPCR産物を移行させ、最適なPCR条件を決定します。
   注:変異対立遺伝子でのFW1およびRV1アンプリコンの形成を防ぐために、伸長時間を最小限に抑える必要があります。アニーリング温度は、対立遺伝子の偏った増幅と非特異的な増幅を最小限に抑えるように調整する必要があります。
   1. この例のプログラムに従うには、次の設定を使用します:98°Cで10秒間、続いて98°Cで1秒間、58°Cで15秒間、72°Cで8秒間の25サイクル、および72°Cで1分間の最終伸びステップ。
      注:変異対立遺伝子上のフォワードプライマーおよびRV1プライマーからの>1,000 bp産物の増幅を防ぐために、伸長時間を8秒に短縮しました(IS10挿入を伴うmutS )。

3. 検量線

1. WTと変異体の2つのDNAサンプルを10/90、25/75、40/60、50/50、60/40、75/25、および90/10の比率で混合します。
   注:生物学的複製物は、独立した一晩の細菌培養から調製されます。
2. 最適化されたPCR条件を使用して増幅します(セクション2を参照)。
3. アンプリコン生成物を定量します。
4. PCR産物を0.1 ng/μLに希釈します。
5. パラレルキャピラリー電気泳動装置を準備します。
   1. 新鮮なゲルと色素を混合します(NGS定量分析キット(22、33、または55);HS NGSフラグメントは、この例では1〜6,000 bp)。
      注意: 詳細な手順については、パラレルキャピラリー電気泳動HS NGSフラグメントガイドを参照してください(材料の表を参照)。
6. キャピラリー保存液と入口バッファーを交換し、リンスバッファープレートを平行キャピラリー電気泳動装置の正しい引き出し位置に配置します。
7. 96ウェルプレートの各希釈サンプル22 μLに2 μLのHS希釈マーカーを追加します。
8. HS NGS定量分析キットのサイズラダー(DNAサイズラダー、範囲1〜6,000 bp)を96ウェルプレートの1ウェルに追加します。
9. 96ウェルプレートをパラレルキャピラリー電気泳動装置の正しい引き出しに入れ、パラレルキャピラリー電気泳動装置ソフトウェアで [実行 ]を選択します。
10. サイズラダーの各ピークを検出して識別し、サンプルの各ピークを既知の実際のサイズに割り当てるデータ分析ソフトウェアを使用して結果を分析します。
    1. 定量キットを使用する場合は、ソフトウェアを使用して、クロマトグラフィーデータ分析のように、ピーク下の面積を積分することにより、各フラグメントのDNA量を決定します。ここでも、サンプルを標準物質の既知の量と比較して、サンプルから各ピークを定量し、サンプルで検出された異なるピーク間の比率を計算します。
    2. 検量線を作成し(図2)、変異対立遺伝子(DNAミックス)の既知の割合を、平行キャピラリー電気泳動装置を使用して測定されたものにリンクします。この検量線により、メソッドの信頼性を評価し、軽微な増幅バイアスを補正することができます。

4. サンプル調製

1. 標準条件で一晩で時点のサンプルを成長させます。
2. DNAを抽出します。
3. DNAを定量します。
4. 最適化されたPCR条件を使用してサンプルを増幅します(セクション2を参照)。
5. パラレルキャピラリー電気泳動装置でサンプルを実行します(手順3.5〜3.10を参照)。

5.対立遺伝子の定量化

1. ソフトウェアを使用してパラレルキャピラリー電気泳動装置のデータから変異対立遺伝子量を抽出し、これらの値を検量線にプロットして実際の比率を計算します。

Results

第1,000世代でS2.11集団から分離された祖先クローンとハイパーミューテータークローンから抽出したDNAを用いて、 図2に示す検量線を確立した。実験室で調製されたDNAミックスから、平行キャピラリー電気泳動装置によって測定された実際の変異体比率は、傾き1.0706の線形関係によってリンクされ、R² は0.9705でした。さらに、生物学的複製の間には良好な一致がありました。標準偏差は、標準曲線の9点で0.61〜17.74でした。

図2...

Discussion

ここでは、実験進化集団における新たな適応SV対立遺伝子のダイナミクスを追跡できる費用対効果の高い方法を提案しました。この方法は、従来のPCR技術と自動化された並列キャピラリー電気泳動を組み合わせて、2つの対立遺伝子の相対量を決定することができます。一度セットアップすると、多くのサンプルの対立遺伝子比率を並行して定量化でき、WGSよりもはるかに安価です。この方法は、非SNP変異のアンプリコンシーケンシングと同等であり、大規模なSVのアンプリコンシーケンシングの技術的限界に対する解決策と見なすことができます。この方法では、PCRバイアスを克服する検量線を使用して、非SNP変異体の割合を正確に定量化できることを示しました(図2)。

SV対立遺伝子ダイナミクスの特性評価は、並行時間ダイナミクスを通じてリンクされた突然変異を特定したり、選択係数を計算して時間の経過に伴う変化を特定したりするのに役立ちます。ここで提示した適用例では、エンドポイントWGSによって、ハイパーミューテーターがさまざまな実験的進化大腸菌集団で...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Skirted PCR Plate	4titude	4Ti - 0740	PCR
アガロース分子生物学グレード	Eurogentec	EP-0010-05	アガロースゲル電気泳動
Agilent DNF-474 HS NGS フラグメントキット フラグメント分析システム用クイックガイド	Agilent		PDF 取扱説明書
バッファー TBE	Panreac appliChem	A4228,5000PC	アガロースゲル電気泳動
較正済み 使い捨て接種ループと針	LABELIANS	8175CSR40H	細菌培養
Dneasy 血液および組織キット	Qiagen	69506	DNA抽出
電気泳動電源	Amilabo	ST606T	アガロースゲル電気泳動
フラグメントアナライザー 自動CEシステム	Agilent		パラレルキャピラリー電気泳動
フラグメントDNAラダー	Agilent	DNF-396、範囲 1-6000bp	パラレルキャピラリー電気泳動
ゲンタマイシン硫酸塩バイオ試薬	Sigma-Aldrich	G1264-1G	細菌培養
高感度希釈マーカー	Agilent	DNF-373	パラレルキャピラリー電気泳動
高感度 NGS 定量分析キット	Agilent	DNF-474	パラレルキャピラリー電気泳動
ラダー クイックロード 1 kb プラス DNA ラダー	NEB	N0469S	アガロースゲル電気泳動
LB ブロス、ベジトンニュートリセレクトプラス	ミリポア	28713	細菌培養
マスターミックス PCR ハイフィデリティ フュージョンフラッシュ サー	モフィッシャーサイエンティフィック	F548L	PCR
プライマー	ユーロジェンテック		PCR
Prosize データ解析ソフトウェア v.4	Agilent	V.4	パラレルキャピラリー電気泳動
量子ビットアッセイ	Invitrogen	MAN0010876	DNA 定量
Qubit dsDNA HS Assay Kit	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	DNA 定量
サーモサイクラー	Eppendorf	EP グラジエント	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		アガロースゲル 電気泳動 視覚化
注射剤用水	Aguettant	PROAMP	PCR