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方法論記事

ショウジョウバエのメラノガスターにおける内在性遺伝子タグ付けのためのワンステップCRISPRベースの戦略

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DOI:

10.3791/64729

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2024年1月26日

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, 3Michigan Neuroscience Institute Affiliate, University of Michigan

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、成功した遺伝子組み換えをマーカーフリーで識別するためにPCRベースの技術を利用し、安定したノックインラインの開発を促進するショウジョウバエの簡略化された内因性遺伝子タグ付けプロトコルを紹介します。

要約

生細胞におけるタンパク質の細胞内局在、動態、および調節の研究は、内因性遺伝子のタグ付けを可能にして蛍光融合タンパク質を産生する技術の出現によって大きく変化しました。これらの方法により、研究者はタンパク質の挙動をリアルタイムで視覚化し、細胞環境内でのタンパク質の機能と相互作用に関する貴重な洞察を得ることができます。現在の多くの遺伝子タグ付け研究では、最初のステップで目の色の変化などの目に見えるマーカーを使用して遺伝子組み換え生物を同定し、2番目のステップで目に見えるマーカーを切除する2段階のプロセスを採用しています。ここでは、ショウ ジョウバエの内因性遺伝子タグを正確かつ迅速に行うためのワンステッププロトコルを提示し、目に見えるアイマーカーなしで操作された系統のスクリーニングを可能にし、従来の方法に比べて大きな利点を提供します。成功した遺伝子タグ付けイベントをスクリーニングするために、PCRベースの技術を採用して、中脚からの小さなセグメントを分析することにより、個々のハエの遺伝子型を決定します。そして、審査基準をクリアしたハエは、安定した資源を生産するために利用されます。ここでは、CRISPR編集プラスミドの設計と構築、および操作されたラインのスクリーニングと確認の方法について詳しく説明します。一緒に、このプロトコルはショウ ジョウバエ の内生遺伝子の分類の効率をかなり改善し、生体内の細胞プロセスの調査を可能にする。

概要

蛍光タンパク質は、生体内の細胞におけるタンパク質の局在、動態、およびタンパク質間相互作用を可視化するための強力なツールとして登場しました1,2。内在性遺伝子に蛍光タンパク質をタグ付けすることで、細胞内分解能で細胞プロセスの長期ライブイメージングが可能になります。さらに、これらの内在性遺伝子標識技術には、過剰発現および免疫染色アプローチと比較していくつかの利点があります。例えば、タンパク質の過剰発現は、タンパク質のミスフォールディング、非特異的なタンパク質間相互作用、および局在の誤りにつながる可能性があります3。現在までに、研究者は、効率的な相同組換えを受けることができる出芽酵母などのいくつかのモデル生物について、蛍光タンパク質に融合した内因性遺伝子の膨大なライブラリを作成することができました4。ショウジョウバエの場合、MiMICs5、トランスポゾンベースのエンハンサートラップ6、フォスミド7など、遺伝子を蛍光標識するために様々なツールが考案されている。

CRISPR-Cas9ベースのツールの開発により、幅広いモデル生物において、内在性タンパク質のタグ付けを含むゲノム編集を効率的に行うことが可能になりました8,9。Cas9は、二本鎖DNAを高効率かつ特異的に切断するRNA誘導酵素であり8、その後、点変異または欠失につながる非相同末端結合(NHEJ)経路によって修復することができます。あるいは、相同性指向性修復(HDR)経路により、異種DNAの染色体への組み込みが可能になります。

モデル生物であるショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)におけるCRISPRベースの遺伝子タグ付けの過去の方法は、2段階のプロセスに依存していた10,11,12。これには、識別可能な目の色のマーカーである Dsred を使用して、成功した HDR イベントを検出することが含まれます。その後、Cre/loxP組換えシステムを用いてDsredマーカーを切除します。このプロセスを合理化および迅速化するために、ここでは、よりシンプルで効率的な方法を紹介します。このアプローチにより、致死的なジェノタイピングの必要性が回避され、個々のハエの直接スクリーニングが可能になります。具体的には、PCRベースのアプローチを採用して、ハエの中脚の小さなセグメントからDNAを抽出し、個々のハエの遺伝子型を決定できるようにします。特に、この手順は、サンプリングされたハエの活力、運動、または繁殖能力を損なうことはありません。この方法で特定された適切な個人のみが、安定した株式にさらに開発されます。

ここでは、内因性遺伝子が蛍光レポーターで標識された蛍光タンパク質タグ付きハエを生成するための詳細なプロトコルを紹介します。この技術では、CRISPR-Cas9ゲノム編集を使用して、任意の蛍光色素タグを内因性遺伝子のN末端またはC末端に融合させます。以下では、gRNAプラスミドとドナープラスミドの設計と構築、CRISPR陽性ハエを選択するためのワンステップスクリーニング戦略、および安定した系統を確立するためのステップについて説明します。具体的には、内在性コアクロックのショウジョウバエ遺伝子periodをC末端の蛍光色素でタグ付けする戦略について述べる。また、タグ付けされたタンパク質が機能的であることを確認するために実施する必要がある対照実験と、無傷のショウジョウバエ脳内のライブクロックニューロンの周期タンパク質を視覚化するためのライブイメージング技術についても簡単に説明します13。ここで説明するプロトコルは、CRISPR-Cas9ゲノム編集によるDNAの特定のビットの欠失および挿入の候補をスクリーニングするためにも広く適用できます。

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プロトコル

1. 遺伝子編集試薬の設計・構築

注:内在性タグ付けを行うには、目的の遺伝子のさまざまなアイソフォームを同定することが不可欠です。実験の特定の目的に応じて、蛍光タグを内部に、または選択したタンパク質アイソフォームのN末端またはC末端に組み込むことができます。CRISPRを介した編集を最適に行うには、2つのsgRNAを目的のノックイン部位に適切に配置することが重要です。続いて、相同組換えによる編集を可能にするために、標的遺伝子と相同な配列を包含するドナーベクターと蛍光タグを調製する必要があります。以下は、これらのプロセスのステップバイステップガイドです(図1)。

  1. sgRNAを以下のように設計します。
    1. ショウ ジョウバエ のsgRNAは、http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ または http://www.flyrnai.org/crispr2/ のウェブサイトを使用して設計します。
    2. flycrisprのウェブサイトでは、目的のノックイン位置(N末端、C末端、または目的のゲノム遺伝子座)を囲む配列±100 bpを入力します。nos-Cas9 attP2を注入バックグラウンドとして使用する場合は、ゲノムオプション Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782)を選択してください。Nos-Cas9システムは、生殖細胞系特異的なCas9発現を保証します。
    3. sgRNAの発現効率を向上させるには、グアニンで始まるsgRNAが編集活性を高めるため、 5'GのCRISPRターゲット オプションを選択します。次に、「 CRISPRターゲットの検索 」ボタンをクリックします。可能なsgRNA配列のリストが表示されます。
    4. 各シーケンスについて、[ 評価] ボタンをクリックします。このアクションは、以前に選択されたゲノムに基づいて、各配列の潜在的なオフターゲットをチェックします。表示されたリストから、 オフターゲットが0のsgRNAを2つ選択します。1 つの sgRNA がノックイン位置に対して上流にあり、もう 1 つの sgRNA が下流にあることを確認します。理想的には、それらの位置はノックイン部位にできるだけ近い(<200 bp)であるべきですが、互いに重なり合ってはいけません(図2)。
      注:特定の標的遺伝子に適したsgRNAを見つけるのが難しい場合があります。sgRNAとノックイン位置の間のギャップは、±200 bpまで増やすことができます。Gで開始しないsgRNAを使用すると、陽性率がわずかに低下する可能性があります。
  2. 蛍光タグの選択は、以下の手順で行います。
    1. 蛍光タグにはさまざまな特性があり、それぞれに独自の長所と短所があります1,2。特定のタンパク質を標識するための理想的な蛍光タグを決定する際には、以下のステップで説明する重要な考慮事項に注意してください。
    2. 天然のタンパク質発現レベルは、通常、過剰発現実験1,2で見られるものよりもはるかに低いため、明るく光安定性があり、実験セットアップに適合するタグから始めます。一部の蛍光タグ、特にtdTomatoやDsRedなどの特定のRFPは、多量体を形成する傾向があり14、タンパク質凝集につながる可能性があります。
    3. 汎用性を高めるには、エピトープタグ(FLAGやV5など)をフレキシブルリンカーを使用して蛍光マーカーにリンクさせることで、ウェスタンブロットや共免疫沈降などの生化学的分析が可能になります。
  3. リンカーの設計については、以下の手順に従います。
    1. 最適な機能を得るには、目的の内因性タンパク質と蛍光タグの両方が別々に折りたたまれてそれぞれの機能形態になるようにします。これを達成するには、長さが2〜20アミノ酸の範囲のリンカーペプチドを使用します。例えば、ピリオドタンパク質の最後のアミノ酸とノックイン蛍光タンパク質mNeonGreenの最初のアミノ酸の間に2つのグリシン残基を配置します。
    2. これらのリンカーペプチド配列が、構造に柔軟性を付与するグリシンおよびセリンなどのアミノ酸を含むことを確実にする15。これにより、内因性タンパク質の自然な挙動と位置が変わらないことが保証されます。
  4. ドナーベクトルを以下で説明するように設計します。
    注:ドナーベクターは、CRISPR切断によって開始される相同性指向性修復のプロセスを通じて、蛍光タグを目的の内因性位置に導入します。そのため、蛍光タグの他に、ドナーベクターはタグの両面で相同な配列を有していなければならない。
    1. リンカーペプチドと蛍光タグのDNA配列を整理することからドナーベクターの設計を開始し、両末端に隣接する相同配列(相同性アーム)があることを確認します。最適な結果を得るには、ホモロジーアームが目的のノックイン部位の両側に少なくとも800ヌクレオチドを含むことを確認してください(図2)。
      注:最近の報告では、相同性アームはより短く(100-200 bp)16
    2. ドナープラスミド内のPAM配列が、得られたタンパク質のアミノ酸配列が変わらないように修飾されていることを確認してください。PAM シーケンスが UTR にある場合は、完全に削除します。
    3. STARTコドンとSTOPコドンの位置は、タグの位置によって異なります。内部タグ付けの場合は、蛍光タグが標的遺伝子のコード配列とフレーム内にあることを確認してください。N末端タグ付けでは、内因性開始コドンの前に蛍光タグを配置します。C末端のタグ付けでは、自然な終止コドンの前に蛍光タグを配置し、潜在的な翻訳の問題を回避するために、開始コドンを1つだけ保持するようにしてください。
  5. 以下に説明するように、sgRNAおよびドナープラスミドを合成します。
    1. sgRNAプラスミドの作製については、flycrispr.org/protocols/grna/ に掲載されているU6-gRNAクローニングガイドラインに従ってください。gRNA配列をpU6-BbsI-chiRNAプラスミド(Addgene、#45946)に挿入するには、代替の制限酵素ベースのクローニングアプローチ(提供リソースでは戦略Cと呼ぶ)を採用します。
    2. DH5a Eで変換します。 大腸菌 (NEB、C2987H)は 、メーカーが提供する標準的な形質転換プロトコルに従います。検証のために、T3またはT7標準シーケンシングプライマーを使用して、得られたクローンに対してサンガーシーケンシングを実施します。
    3. ドナープラスミドの作製には、市販業者(IDTなど)から目的のドナー配列を持つ二本鎖DNAを入手します。pBlueScriptII SK(-)マルチクローニングサイトに統合します。ドナープラスミドをシーケンシングして、sgRNAまたはPAM配列が正しく修飾され、プラスミドにSNPが存在しないことを確認します。
      注:pBlueScriptIIを使用した統合の代替法として、ホモロジーアームと蛍光タグセグメントを別々にPCRし、Golden Gate AssemblyやGibson Assemblyなどの手法を用いてバックボーンに統合する方法があります。
  6. 次の注入および交差スキームを使用します。
    1. 生殖細胞系で編集されたハエを取得するには、gRNAプラスミドとドナープラスミドを適切なCas9バックグラウンド(例:nos-Cas9 III、BDSC 78782)に同時注入します。市販の注入サービスを利用する場合は、ベンダーの指示に従ってプラスミド調製を行ってください。
      注:通常、gRNAプラスミド濃度は0.5 μg/μLを超え、ドナープラスミド濃度は1.0 μg/μLを超える必要があります。プラスミドサンプルの送付から注入された胚の受領までの一般的なタイムラインは約2週間です。ここでは、FM7/Lバランサー株を用いたX染色体上の遺伝子編集イベントをスクリーニングする戦略を紹介します。2番目または3番目の染色体上の遺伝子には、適切なバランサー株を使用します。
    2. 注射されたハエ(G0)の収集には、二酸化炭素で麻酔をかけ、オスのハエと処女のハエを分離します。個々の狭いCTフードバイアルで、各G0オスと少なくとも2匹のFM7 / Lバージンメスをペアにして、ハエの交配を確立します。交差したバイアルを、F1が閉じるまで25°C、~60%の湿度に維持されたベント付きインキュベーターに入れます(FM7/Lは最も一般的に使用されるX染色体バランサーです)。同様に、各G0メスとFM7/Yオスフライをペアにします。
    3. 麻酔をかけ、G10の男性と女性の両方の交配から少なくとも0匹の処女の女性の子孫(F0)を収集します。G0メスの交配から、少なくとも10匹のオスのF1バエを集めます(図3A)。各F1フライに親子関係の詳細がタグ付けされ、別々に保存されていることを確認してください。審査ステップに進みます。
  7. 以下のシングルレッグPCRプロトコールを使用します。
    1. プライマー作製:標的遺伝子の編集部位を包含するプライマーペアを設計します。理想的には、プライマーの融解温度はほぼ同じで、約55°Cである必要があります。
    2. 溶解バッファーの調製:ハエサンプルごとに10 μLの溶解バッファーを調製します。バッファーは、10 mM Tris(pH 8.2)、1 mM EDTA(pH 8.0)、25 mM NaCl、および 400 μg/mL のプロテイナーゼ K で構成されています。 溶解バッファーをマスターミックスとして調製し、10 μL を 96 ウェル PCR プレートの各ウェルに分配します。脚の解剖プロセス全体を通して緩衝液が冷たく保たれていることを確認してください(図3B)。
    3. チューブのセットアップ:ガラスキャピラリーチューブを準備し、一方の端にスクロース寒天食品(2%寒天と4%スクロース)を充填し、これらをフライホテルと呼ばれる96ウェルディープウェルプレートに入れます(図3C)。
    4. 下肢解剖:二酸化炭素麻酔パッドを実体顕微鏡下に置き、候補のハエ1匹に麻酔をかけ、中脚の1本を切断します。脚を溶解緩衝液に入れ、完全に浸漬させます。脚を浸軟させる必要はなく、直接溶解プロトコルステップに進みます(図3B)。一対の細い金属製の鉗子でフライウィングを持ち、フライをフライホテルに移動し、すぐにチューブを糸で密封します。
    5. 対照サンプル:2匹の野生型ハエを、同じ脚の解剖手順に従ってネガティブコントロールとして使用できます。希釈したドナープラスミドがポジティブコントロールとして機能します。
    6. 解剖後のケア:25°C、~60%の湿度に保たれた通気孔付きインキュベーターにハエホテルを収容します。ハエは一晩中生き延びることができますが、その後のステップと交尾を同じ日中に完了することをお勧めします。
    7. 溶解プロトコル:切断した脚を溶解緩衝液に入れ、37°Cで90分間、続いて95°Cで5分間、最後に4°Cで保持します。 これにより、各ハエの1本の脚から十分なDNAが抽出されます(図3B)。
    8. PCR反応:メーカーの指示に従い、1.5 μLのフライレッグライセートをDNA源として利用してPCR反応を整理します。
    9. ゲル電気泳動:PCR産物をアガロースゲル電気泳動にかけます。バンドサイズに基づいてゲルからの結果を解釈します。典型的には、ネガティブコントロールのハエはより低いバンドを示し、ポジティブプラスミドコントロールはより高いバンドを示します。特定のバンドサイズが元のドナープラスミドデザインと一致していることを確認してください。雌の陽性ハエはヘテロ接合体であるため2つのバンドを示し、雄の陽性は1つのバンドを示します(図3B)。
      注:通常、1日で70匹のハエのスクリーニングが可能です。特定のF1はオフターゲット変異により不妊である可能性があるため、4〜5つの異なるG0交配で少なくとも10個の陽性F1ハエを特定するようにしてください。
  8. 以下のPCR後のクロスセットアップを実施します。
    1. ゲルの結果に基づいて、フライホテルから陽性のハエを選択し、バランサーフライ(X染色体遺伝子をタグ付けするためのFM7 / L)と個別に交配してF2世代を生成します。F2世代が出現したら、兄弟交配を確立してホモ接合体の安定ストックを作成します(図3D)。
    2. 編集部位のサンガーシーケンシングにはホモ接合体ストックを使用し、正確性を確保します。野生型ハエとの戻し交配検証済みフライラインは、バックグラウンド変異を除去します。シングルレッグPCRプロトコルを使用して各世代をスクリーニングします。

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結果

私たちの実験では、すべての染色体(X、II、III)上のさまざまな内因性タグ付き遺伝子のスクリーニングにおいて、通常、20%~30%の成功率が見られました。このプロセスの効率は、gRNAの選択、遺伝子の性質、注入品質など、いくつかの要因によって異なります。ここでは、内因性周期遺伝子をmNeonGreen蛍光色素でタグ付けする戦略の結果を説明します13。D. melanogasterのX染色体上に位置する周期遺伝子は、概日時計において極めて重要な役割を果たしています。ショウジョウバエは、時計タンパク質を発現する約150個の時計ニューロンからなる、よく特徴づけられた時計ネットワークを有する17。

ピリオドタンパク質のC末端に緑色蛍光タンパク質mNeonGreenをタグ付けし、デュアルグリシン...

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ディスカッション

この結果は、 ショウジョウバエの内在性遺伝子にタグを付けるための、合理化されたシンプルなワンステップCRISPRベースの戦略を示しています。プロトコルでは、2つのgRNAを使用して、DNA二本鎖切断と相同組換えをより効率的に誘導します。gRNAとドナープラスミドをショウジョウバエの胚に注入し、ショウジョウバエの胚は生殖細胞系でCas9酵素を発現します。これらの胚は、その後、成体になるまで標準的な条件下で培養され、その時点でバランサーバエと交配して、第1世代(F1)の子孫を生み出します。PCRジェノタイピングは、遺伝子組み換えハエをスクリーニングするために、各F1検体の中央脚で実施されます。この方法は、スクリーニングの2つのステップを使用する現在のスクリーニング方法と比較して大きな利点を提供し、第1のステップは、適切な遺伝子型を識別するために眼の色などの可視マーカーを使用することに依存し、第2のステップは、眼色マーカー10の除去を含む。ここでは、個々のハエの中脚の小さなセグメントから抽出したDNAにPCRを使用して、個々のハエの非致死的なジェノタイピングを可能にする方法を提...

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開示事項

著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

プロトコル開発の初期段階で議論してくれたGeorge Watase氏とJosie Clowney氏に感謝します。この研究は、NIH(助成金番号R35GM133737、Alfred P. Sloan Fellowship(S.Y.)、McKnight Scholar Award(S.Y.)からの資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5M EDTA pH8.0InvitrogenAM9260G
5-α コンピテント 大腸菌 (高効率)NEBC2987H
96ウェルディープウェルプレートBRAND701354
寒天フィッシャーサイエンティフィックBP1423-500
BbsI-HFNEBR3539S
DreamTaq グリーン PCR マスターミックス (2X)Thermo ScientificK1081
D-スクロースフィッシャーサイエンティフィックBP220-1
EcoRI-HFNEBR3101S
塩酸フィッシャーサイエンティフィックA142-212
プロロングガラス 退色防止 封入 媒体InvitrogenP36982
プロテイナーゼ KQIAGEN19131
シュナイダーズ ショウジョウバエ 媒体Gibco21720001
塩化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS271-500
T4 DNAリガーゼNEBM0202S
トリスベースフィッシャーサイエンティフィックBP152-500
XbaINEBR0145S

参考文献

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