方法論記事

げっ歯類の網膜の構造変化を評価するための画像誘導光干渉断層撮影法

DOI：

10.3791/64783

⸱

2023年2月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry, and Vision Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Department of Ophthalmology, The First People's Hospital of Guiyang

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで紹介するプロトコルは、画像誘導光干渉断層撮影法(OCT)のデータ収集とデータ分析の手順を詳しく説明し、眼疾患の複数のげっ歯類モデルでのその適用を示しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

加齢性黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症、ブドウ膜炎などの眼疾患は、常に網膜の構造変化を伴います。眼底に影響を与えるこれらの疾患は、光受容体細胞、網膜神経節細胞、網膜血管の細胞、脈絡膜血管の細胞など、網膜の特定の細胞タイプで常に典型的な異常を示します。非侵襲的で、高効率で、適応性の高いイメージング技術は、臨床診療と基礎研究の両方において必要とされています。画像誘導光干渉断層撮影法(OCT)は、眼底撮影と高解像度OCTを組み合わせて、小さな病変の正確な診断と網膜構造の重要な変化を提供するため、これらの要件を満たしています。この研究では、画像誘導OCTのデータ収集とデータ分析の手順を詳しく説明し、脈絡膜血管新生(CNV)、視神経挫傷(ONC)、光誘発性網膜変性症、および実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)のげっ歯類モデルでのその適用を実証しています。この技術は、眼科の研究者がげっ歯類の網膜構造変化を便利に、確実に、そして扱いやすく特定するのに役立ちます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

眼底に影響を与える眼疾患は、視細胞、網膜神経節細胞、網膜血管細胞、脈絡膜血管細胞など、網膜の特定の細胞型に常に典型的な異常を示し、これがその後、患者の視力に影響を与える可能性がある1。不可逆的な視覚障害を避けるためには、タイムリーな診断と適切な治療が必要です1。光干渉断層撮影法(OCT)は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、緑内障、ブドウ膜炎、網膜剥離など、さまざまな眼疾患を評価するためにクリニックで広く使用されています2,3,4。この種の非侵襲的で、高効率で、適応性のあるイメージング技術は、実験動物5,6,7,8,9,10の病態をタイムリーに評価するためにも必要です。

画像誘導光干渉断層撮影法(OCT)は、干渉法を使用して、縦方向分解能1.8μm、軸方向分解能2μmで動物の網膜の断面画像を生成します。これは、網膜の建築的変化2,3,4,5,6,7,8,9,10の調査において、少なくとも3つの利点を有する。まず、これは非侵襲的な技術であり、研究者は同じ動物の網膜5,6,7,8,9,10の関心位置を動的に追跡することができる。第二に、この形質は、各実験3のサンプルサイズを大幅に縮小します。一方、研究プロジェクト2,3,4,5,6,7,8,9,10の時間と労力を大幅に節約できます。第三に、画像誘導OCTは、OCT画像をキャプチャしながらカラフルな眼底画像を取得するため、ユーザーに正確で信頼性の高い結果を提供します。

この原稿では、画像誘導OCTの画像収集とデータ解析の手順を説明し、脈絡膜新生血管(CNV)11,12、視神経挫傷(ONC)13,14,15,16、光誘起網膜変性17,18,19,20,21のマウスおよびラットモデルでのその適用について詳しく説明します、および実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)22,23。この汎用性の高い技術により、研究者は高解像度のOCT画像だけでなく、眼底画像も便利かつ効率的に撮影することができます。

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プロトコル

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すべての動物用手順は、Association for Research on Vision and Ophthalmologyの「眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明」に準拠しており、温州医科大学(WMU)の動物施設管理および使用委員会によって承認されました。ラットとマウスには、12時間の暗/明サイクルで18ルクスの環境光強度の水と食物への自由なアクセスが与えられました。

1. 眼球動物モデルの準備

  1. マウスレーザー誘起脈絡膜新生血管(CNV)モデル11,12
    1. 4週齢の雌マウス(C57BL / 6J背景)にケタミンとキシラジンで麻酔をかけ、ステップ3.2に従ってトロピカミドフェニレフリン点眼薬で瞳孔を拡張します。つま先をつまんでも動きが検出されない場合は、マウスに適切に麻酔をかけたと考えてください。
    2. 光源ボックス、ソフトウェア、レーザーボックス(波長:532nm)を作動させ、出力エネルギーを100mWに、持続時間を100msに調整します。
    3. 実験用プラットフォームにマウスを置き、マウスの眼底がはっきり見えるまでマウスとプラットフォームの位置を調整します。
    4. レーザーボックスの画面にある レーザーON ボタンを押して、赤色レーザー基準点のピントを調整します。レーザー基準スポットを移動し、光ディスクから1〜2本の乳頭径に調整します。フットペダルを操作すると、レーザーによる損傷が発生します。
    5. ヒットの直後に気化気泡が発生し、レーザー損傷が成功した兆候であるかどうかを判断するために、すぐにチェックを行います。各眼に3〜5個のレーザースポットを生成します。
  2. マウス視神経潰傷(ONC)モデル13,14,15,16
    1. ステップ 3.2 に続いて、出生後日 (P) 21 から P35 の雌マウス (C57BL/6J 背景) に麻酔をかけます。つま先をつまんでも動きが検出されない場合は、マウスに適切に麻酔をかけたと考えてください。
    2. マウスを手術用顕微鏡下に置き、結膜切開部の大きさが約1mmになるように、スプリングハサミで片方の眼の結膜を切開します。
    3. 眼窩内視神経を露出させ、視神経乳頭から0.5mm離れた場所で細い鉗子で5秒間粉砕します。このとき、眼窩筋と他の組織をそっとそらとそらさせ、脇に置きます。手術用眼の血管の損傷を避けてください。
      注意: 白い房状の視神経に触れたり摘み取ったりすると眼球が揺れるので注意してください。
    4. 角膜の乾燥を避けるために、術後に眼科用軟膏を塗布します。.
  3. マウス光誘起網膜変性症(LIRD)モデル 17,18,19,20,21
    1. 実験前の準備:マウスケージ(30 cm x 18 cm x 13 cm)をアルミホイルと鉄メッシュカバーで囲みます。各ケージを紙箱(52 cm x 35 cm x 30 cm)に入れ、上部に白色のライトを当てます。
    2. 6週齢の雄マウス(BALB / c)を暗室で一晩暗順応させ、その後、各眼にトロピカミドフェニレフリン点眼薬を使用して眼を拡張します。角膜領域の3/4が虹彩で覆われなくなるまで、瞳孔を完全に拡張します。通常、これには 3 分もかかりません。
    3. マウスを10,000ルクスの白色光で2時間照らします。術後、マウスを一晩暗闇に置き、その後、通常の暗い明るい環境に戻します。効果的な光刺激を確保するために、常に1匹のマウスをケージに入れてください。
  4. ラット実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)モデル
    1. 実験前の準備:2.5 mg の hIRBP161-180 を完全なフロイントのアジュバント (1:1 重量/容量) で 2.5 mg/mL 結核菌 H37Ra22,23 で乳化します。
    2. 100μLのエマルジョンを各ルイス雄ラット(約180g)の左フットパッドに皮下注射する。

2. OCTモジュールのセットアップ

  1. 光ファイバーとOCT制御ケーブルをOCTスキャンヘッドとOCTエンジンの間に接続します(図1A)。ファイバーの切り込みをコネクタのスロットに合わせ、先端をゆっくりと挿入して固定します(図1B)。
    注意: 制御ケーブルを接続する前に、OCTエンジンの電源スイッチをオフにしてください。光ファイバーは非常に壊れやすいため、ファイバー先端の両端は避けてください(図1C)。このモジュールを頻繁に使用する場合は、OCTスキャンヘッドとファイバー/ケーブルの組み立てと分解は避けてください。
  2. マウスまたはラットOCT対物レンズを機械本体の前面にねじ込みます(図1A)。OCTスキャンヘッドをOCTレンズに置き、MRフォーカスインジケーターを機械本体の反対側に向けて配置します(図1A)。
  3. OCTスキャンヘッドを2本のつまみネジ(レンズとカメラ本体に1本)で固定します。スキャンヘッドをしっかりと固定します。
  4. 主電源スイッチをオンにし、次にカメラのライトをオンにし、次にOCTソフトウェアをオンにします。
    メモ: カメラが起動すると、コンピューターがカメラを見つけるのに時間がかかります。

3. OCT実験用動物調製

  1. OCT実験の10分前に、動物の目にトロピカミドフェニレフリン点眼薬を点眼し、清潔なタオルで余分な点眼薬を拭き取ります。
  2. 実験の5分前に、麻酔薬溶液200μLをマウスに注入し、ラットに2.0mLを腹腔内に注入します。つま先をつまんでも動きが検出されない場合は、マウス/ラットに適切に麻酔をかけたと考えてください。
    注:麻酔薬溶液は、生理食塩水中のケタミン(12 mg / mL)とキシラジン(マウスで1 mg / mL、ラットで2 mg / mL)で構成されていました。通常、動物の体重1gあたり10μLの麻酔薬溶液が適用されます。溶液を4°Cで最大2週間保存しました。
  3. 麻酔が投与されたら、眼球表面の乾燥を避けるために、角膜をゲル軟膏で滑らかにします。

4. 画像誘導OCTイメージング

注:ソフトウェアインターフェースは、明視野画像、OCT制御タブ、およびOCTディスプレイの3つの部分に分かれていました(図2)。

  1. 明視野画像を見るときは、必要に応じて動物情報の注釈を入力します。
  2. チェックボックスを使用して[ ビーム位置コントロール ]のオンとオフを切り替え、画像にラインオーバーレイがある場合とない場合で明視野画像をキャプチャします。
  3. スキャニングビームをより正確に配置するには、 位置ナッジ 矢印を使用して微調整し、上、下、左、または右に向けます。厚さの値と色を選択し、対象の位置をターゲットとするビームの角度 (太い、黒、0 など) を選択します。ゲイン値を 14 db までドラッグします。
  4. OCTコントロールタブに移動します。メニューから [ファイル/File_Settings]を選択し、OCTと眼底画像を保存する場所へのパスを作成します。
  5. スキャンの種類、サイズ、および動物(ラットまたはマウス)を指定します。 「Eye」または「Left」または「Right」を選択し、「 Imaging Retina」を選択します。
    注:OCTは、フル、ハーフ、クォーター、および8番目のサイズでライン、サークル、および3Dボリュームスキャンタイプをキャプチャできます。
  6. イメージコントロールを設定します。値を調整します:コントラストは60、ガンマは100、明るさは0です。
  7. 実験用プラットフォームにマウスを置き、マウスの眼底がはっきり見えるまでマウスとプラットフォームの位置を調整します。位置を微調整して、光ディスクを中央に位置合わせます。
  8. 最初にリファレンスアームをマウスで850、ラットで830に調整し、<-1または+1>ボタンをクリックして位置を微調整します。OCT画像を水平方向に調整してから、OCT画像をフルビューの上部1/3に移動します。
  9. 必要に応じて、偏光スライダーを動かして、網膜を通る信号の明るさを調整します。
  10. 眼底画像だけでなく、鮮明で安定したOCT画像を観察した後、フレーム数(通常は20、50、80、または100)を設定し、 平均を押します。
    注:OCTイメージのキャプチャには数秒かかります。フレーム数が多いほど、画像キャプチャの完了に時間がかかりますが、キャプチャされた画像の品質は高くなります。
  11. 「Save」を押してOCTと眼底の画像を保存し、「Restart」をクリックして別のサンプルを採取します。
    注:動物は、目覚める前に37°Cの加熱プレートで回復することを許されました。動物たちは、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、放置されませんでした。治療を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物の飼育システムに戻されませんでした。

5. 厚さ測定と定量分析

注:このOCTには解析ソフトウェアが組み込まれています。OCT画像は、このソフトウェアを使用してセグメント化および分析できます(図3)。

  1. 解析ソフトウェアを開き、解析が必要なOCTイメージを開きます。
  2. レイヤーの数を選択し、[ Get Initial Layers] を押します (図 3A)。ソフトウェアはレイヤーを自動的に描画します。
  3. [鉛筆]アイコンをクリックし、ターゲットレイヤー上のドットを動かしてレイヤーを微調整します(図3A、B)。すべてのレイヤーを1つずつ慎重に変更します。
    注: レイヤーを追加することは可能です。 プラスアイコンをクリックし、OCT画像上にいくつかのドットを描画してから、 チェックマークアイコンを押します。新しいレイヤーが作成されます。
  4. レイヤーの微調整が完了したら、セグメント化されたOCTの詳細値(CSV形式)とさまざまな画像タイプをエクスポートします(図3A)。
    注:レイヤー、厚さ、厚さマップ、OCTなしのレイヤー、スクリーンショットなど、さまざまな画像タイプをエクスポートすることができます。すべての画像の視神経と重なる中央の値は、網膜層がないため、放棄してゼロに設定する必要があります。

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結果

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画像誘導OCTは、マウスのレーザー誘起脈絡膜新生血管(CNV)におけるレーザースポットの発達をモニターするために使用できます。図1に示すように、新生児の血管は、レーザー損傷11,12の後、ブルッフ膜と網膜色素上皮(RPE)層を通過し、線維性瘢痕を形成した。この病変スポットは、フルサイズスキャン(図4A)またはハーフサイズスキャン(図4B)のいずれかでキャプチャできます。ハーフサイズスキャンは、画像が拡大され、レーザースポットに焦点が絞られるため、推奨されます。もちろん、研究で必要であれば、0日、3日、7日、14日など、より広い時間枠でモニタリングすることも可能です。

マウス視神経潰(ONC)モデルでは、網膜神経線維層(RNFL)、神経節細胞層(GCL)、内網状層(IPL)からなる神経節細胞...

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ディスカッション

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このプロトコルは、画像誘導OCTの画像収集と厚さ測定の指示を提供します。研究者らは、眼疾患の最も一般的な4つのげっ歯類モデルを実証することにより、画像誘導OCTが劇的な網膜構造変化の調査に優れた性能を提供することを発見しました。実際、高解像度の画像を使用すると、OCT画像でも小さな病変を簡単に見つけることができます。画像誘導OCTの助けを借りて、研究室のグループは、微小重力マウスモデルとCacna1f変異マウスモデル24,25のOPL内に異常な高反射スポットも発見しました。それを超えて、硝子体から脈絡膜26,27,28,29への他の小さな構造変化を決定することが可能です。要約すると、高解像度OCTは、...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者のいずれも、開示すべき利益相反を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、米国国立眼科・検眼・視覚科学研究所のメンバーに対し、本稿に関する技術サポートと有益なコメントをいただいたことに感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会(82101169年、81800857年、81870690年)、中国浙江省自然科学基金会(LGD22H120001年、LTGD23H120001年、LTGC23H120001年)、中国温州科学技術局プログラム(Y20211159)、貴州省科学技術支援プロジェクト(Qiankehezhicheng [2020] 4Y146)、および国家眼科重点研究所プロジェクトからの助成金によって支援されました。 検眼と視覚科学(No.K03-20220205)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BALB/cマウスBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd動物モデル調製物
C57BL/6JNifdc マウスBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd動物モデル調製物
Carbomer Eye GelFabrik GmbH Bausch&の子会社Lomb角膜を湿らせます 
完全なフロイントのアジュバントSigma F5881EAU 実験
プラットフォームフェニックス技術グループ動物模型調製
hIRBP161-180上海三公生物工学技術 &サービス株式会社EAU実験
ケタミンバサンテアニマル全身麻酔
レーザーボックスHaag-Streitグループメリラス532&アルファ;動物モデルの準備
Lewis ratBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd動物モデル製剤
結核菌H37RASigma 344289EAU実験
フォニックスミクロンIV 画像誘導OCTおよび画像誘導レーザーフェニックステクノロジーグループ動物模型製剤
組織鉗子蘇州明仁医療機器有限公司MR-F101A-5動物模型製剤
トロピカミドフェニレフリン点眼薬SANTEN OY, 日本眼拡張
バンナスハサミ蘇州Mingrenの医療機器Co.、株式会社MR-S121A動物モデルの準備
XylazineのCeva Santeの動物の全身麻酔
セ

参考文献

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