確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する

サマリー

3次元コロノイドの発生のためのマウス結腸陰窩の単離を詳述するプロトコルについて説明します。その後、確立されたコロノイドは、炎症性チャレンジを受ける前、または上皮単層を確立するように指示される前に、宿主上皮の細胞組成を反映するように最終分化され得る。

要約

腸上皮は人間の健康に不可欠な役割を果たし、宿主と外部環境の間に障壁を提供します。この非常に動的な細胞層は、微生物集団と免疫集団の間の最初の防衛線を提供し、腸の免疫応答を調節するのに役立ちます。上皮バリアの破壊は炎症性腸疾患(IBD)の特徴であり、治療標的化に関心があります。3次元コロノイド培養系は、IBDの病態における腸幹細胞動態と上皮細胞生理を研究するための非常に有用な in vitro モデルです。理想的には、動物の炎症を起こした上皮組織からコロノイドを確立することは、疾患に対する遺伝的および分子的影響を評価するのに最も有益であろう。しかし、我々は、急性炎症マウスから樹立されたコロノイドにおいて 、in vivo 上皮変化が必ずしも保持されないことを示した。この制限に対処するために、IBD中に通常上昇する炎症メディエーターのカクテルでコロノイドを治療するためのプロトコルを開発しました。このシステムはさまざまな培養条件に遍在的に適用できますが、このプロトコルは、分化したコロノイドと確立されたコロノイドに由来する2次元単層の両方の処理に重点を置いています。従来の培養環境では、コロノイドは腸幹細胞が豊富であり、幹細胞ニッチを研究するのに理想的な環境を提供します。しかし、このシステムでは、バリア機能などの腸管生理の特徴を分析することはできません。さらに、伝統的なコロノイドは、炎症誘発性刺激に対する最終分化上皮細胞の細胞応答を研究する機会を提供しない。ここで紹介する方法は、これらの制限に対処するための代替実験フレームワークを提供します。2次元単層培養システムは、 ex vivoでの治療薬スクリーニングの機会も提供します。この細胞の分極層は、細胞の基底側の炎症メディエーターで治療することができ、IBD治療におけるそれらの有用性を決定するために、頂端的に推定治療薬と併用することができる。

概要

炎症性腸疾患(IBD)は、炎症と臨床的静止のエピソードを特徴とする慢性の寛解型および再発性疾患です。IBDの病因は多因子性ですが、この疾患の重要な特徴には、上皮コンパートメント内で活性化される炎症誘発性シグナル伝達カスケードに加えて、バリア機能の欠陥と腸上皮の透過性の増加が含まれます^1,2。IBD中の上皮応答を再現するために、細胞培養および炎症のマウスモデルを含むいくつかのインビトロおよびインビボモデルが使用されてきた³。しかしながら、これらのシステムはすべて、IBD⁴中の上皮変化を再現する能力を制限する重要な欠点を有する。IBDの研究に使用されるほとんどの細胞株は形質転換され、単層を形成する能力を有し、^分化することができるが3、宿主における非形質転換腸上皮細胞とは異なる性質の増殖を行う。炎症のいくつかの異なるマウスモデルがIBDの研究に使用され、そのうちのいくつかには、ノックアウトモデル、感染モデル、化学炎症モデル、およびT細胞移植モデル^{が含まれます5}、⁶、^7、8。それぞれが遺伝的素因、バリア機能障害、免疫調節解除、微生物叢など、IBDの特定の病因学的側面を研究することができますが、病気の多因子性を研究する能力には制限があります。

エンテロイドやコロノイドを含む腸管オルガノイドは、腸幹細胞の動態だけでなく、腸管上皮のバリア完全性と機能が腸の恒常性と疾患に果たす役割を研究するための有用なin vitroモデルとして過去10年間にわたって確立されてきました。これらのエンティティは、IBD⁹の病因の理解に大きく貢献し、個別化医療の新しい機会を開きました。コロノイド、または結腸からの幹細胞由来の自己組織化組織培養物は、腸陰窩内にある幹細胞が増殖し、無期限に維持されることを可能にするプロセスにおいて、マウスとヒトの両方の組織から開発されました¹⁰。in vivoの幹細胞ニッチは、その成長をサポートするために細胞外因子、特に標準的なWntシグナル伝達および骨形態形成タンパク質シグナル伝達経路に依存しています¹¹。これらの因子の添加は、コロノイドの健康と寿命を促進するだけでなく、自己複製細胞と最終分化細胞の両方で構成されるin vivo上皮細胞構造を反映しない幹細胞様状態に向けて培養を推進します^12,13。腸上皮の機能は、幹細胞コンパートメントと分化細胞との間の継続的なクロストークに依存しているが、コロノイド培養系において両方を有する能力はかなり限られている。これらの制限にもかかわらず、オルガノイド培養システムは、ex vivoで上皮の固有の特性を研究するためのゴールドスタンダードであり続けています。それにもかかわらず、目前の科学的質問に答えるために、代替文化戦略を検討する必要があるかもしれません。

デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の連続7日間レジメンのマウスは、上皮性炎症とバリア機能障害の両方を発症することが示されています¹⁴。さらに、ヒトIBDで明らかであることが示されている腸上皮内のミトコンドリア生合成障害および代謝リプログラミングも、この大腸炎のDSSモデルで捕捉されています¹⁵。しかし、我々の予備データは、ミトコンドリア生合成障害の特徴がDSS処理動物の陰窩に由来するコロノイドでは保持されていないことを示しています(補足図1)。したがって、マウス腸の炎症中に炎症がどのように上皮の変化を引き起こすかを調べる際には、代替培養法を使用する必要があります。ここでは、1)マウスコロノイドの樹立のために結腸組織全体から陰窩を分離する方法、2)この細胞集団をin vivoでの細胞集団を反映するように最終分化させる方法、および3)この in vitro モデルで炎症を誘発する方法を説明する、私たちが開発したプロトコルの概要を説明します。炎症上皮内の薬物相互作用を研究するために、炎症メディエーターで基本的に治療し、薬物療法で根尖的に治療できるマウスコロノイドから2次元(2D)単層を確立するためのプロトコルを開発しました。

プロトコル

ここに記載されているマウス組織を使用したすべての実験は、ピッツバーグ大学の治験審査委員会によって承認され、ピッツバーグ大学の動物研究およびケア委員会およびUPMCによって定められたガイドラインに従って実施されました。

1.文化の準備

注:すべての試薬は 材料 表セクションにリストされており、すべての溶液組成は溶液組成表(表1)に記載されています。

1. 表1に記載のようにマウス洗浄培地を調製する。4°Cで最長2ヶ月間保管してください。
2. 表 1 の説明に従って、暗号分離バッファー 1 (CIB1) を準備します。4°Cで最長2ヶ月間保管してください。
   注意: ジチオスレイトール(DTT)は、摂取すると急性毒性が起こり、これらの領域にさらされると皮膚や目に損傷を与える可能性があるため、OSHAハザードコミュニケーション基準では危険と見なされています。この化学物質を取り扱うときは、保護手袋、目の保護具、および顔の保護具を使用する必要があります。
3. 表 1 の説明に従って、暗号分離バッファー 2 (CIB2) を準備します。4°Cで最長2ヶ月間保管してください。
4. 以前に公開されたプロトコル¹⁶に従ってL-WRN馴化培地を調製する。
5. 表1に記載のように完全なコロノイド培地を調製する。完全なコロノイド増殖培地は、活性を失うことなく、4°Cで最大5日間保存できます。
6. 表1に記載の分化培地を調製する。このプロトコルは、以前に発表された論文¹⁷から修正された。分化培地は、活性を失うことなく、4°Cで最大5日間保存できます。
7. 表1に記載のように炎症メディエーター培地を調製する。このプロトコルは、以前に発表された論文¹⁸から修正された。炎症メディエーター培地は、活性を失うことなく、4°Cで最大5日間保存できます。
8. マウス単層培地を調製する。炎症因子および/または薬物で単層に挑戦する場合は、Y-27632を省略してください。マウス単層培地は、活性を失うことなく、4°Cで最大5日間保存できます。
9. 炎症メディエーター単層培地を調製する。炎症メディエーター単層培地は、活性を失うことなく、4°Cで最大5日間保存できます。

2.マウス結腸組織からの陰窩分離

注意: 組織を氷の上に移します。-20°Cの貯蔵庫から適切な量の基底膜マトリックスを取り出し、氷上で解凍します。各24ウェルに15 μLの基底膜マトリックスをメッキします。CIB1、CIB2、およびセクション1に記載のように完全なコロノイド増殖培地を調製する。

1. 施設動物管理使用委員会が承認したプロトコルに従ってC57BL / 6Jマウス(6〜8週齢)を安楽死させ、きれいなピンセットとはさみを使用して結腸の遠位端(約5〜7 cm)を抽出します。
   注:この研究では、被験者は二酸化炭素室のインキュベーションを使用して安楽死させられました 2〜3分間、その後頸部脱臼が続きました。
   1. このためには、マウスを背中に置き、胸郭のすぐ下に水平方向の切開を行い、次に水平方向の切開の中央から尾の付け根に向かって垂直方向に切開して腹腔を露出させます。
   2. ピンセットで小腸をフィールドから外し、結腸を特定し、尾の付け根までたどります。必要に応じて、ハサミで骨盤を壊して遠位結腸を完全に露出させます。はさみを使用して、結腸の最も遠位の5〜7 cmを切ります。
2. 結腸組織をきれいな表面に置きます。結腸を囲む余分な漿膜脂肪を取り除きます。18 G 1 1/2針に取り付けられた注射器を使用して、結腸の内腔内容物をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗い流して、糞便を取り除きます。.次に、10 mLの氷冷DPBSを含む50 mLの円錐管に結腸を置き、氷の上に置きます。
   注意: 複数の動物から結腸を分離する場合は、次の動物に進む前に組織を氷の上に置きます。
3. 結腸組織を10 mLの氷冷DPBSを含むペトリ皿に移し、P1,000ピペットを使用してDPBSで内腔を2回洗浄します。
4. はさみを使用して結腸を縦方向に開き、DPBSでピンセットを使用して~30秒間静かに振って、残っている糞便内容物を取り除きます。
5. 組織を10 mLの氷冷DPBSを含む新しいペトリ皿に移し、ピンセットを使用して再び穏やかに振ってから、はさみを使用して結腸を2 cmの小片に切断し、7 mLの氷冷CIB1を含む50 mLの円錐管に入れます。CIB1中の組織を氷上で20分間インキュベートします。
   注意: 残りの手順は、生物学的安全キャビネット内で実行されます。
6. ピンセットを使用して組織を7 mLのCIB2を含む予め温めた50 mLのコニカルチューブに移し、37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。
7. 組織をコニカルチューブの底に沈降させてからCIB2をピペッティングオフすることにより、50 mLコニカルチューブからCIB2を取り外します。次に、同じ円錐管に10 mLの氷冷マウス洗浄培地を加えます。
8. 新しい50 mLコニカルチューブを入手し、開いたチューブの上に70 μmのフィルターを置きます。
9. 結腸の内容物を入れたチューブを持ちながら、手を約45°回転させます。チューブを揺れながら激しく45秒間振って、地下室を解放します。次に、クリプト懸濁液を70 μmセルストレーナーを通して新しい50 mLコニカルチューブに注ぎます。
10. ピンセットを使用して、結腸組織を空の50 mLコニカルチューブに戻し、10 mLの氷冷マウス洗浄培地を追加します。新しい70 μmセルストレーナーを入手し、前のろ過溶液を含む50 mLコニカルチューブの上に置きます。
11. もう一度、陰窩の破片が入っている50mLのチューブを手に取り、手順2.9と同じ方法で振とうします。70 μmのセルストレーナーを通して培地を50 mLのコニカルチューブにろ過し、以前にろ過した陰窩と結合します。
    注:陰窩の収量が低い場合は、10 mLのマウス洗浄培地を入れた空の50 mLコニカルチューブに組織を入れて、結腸組織をさらに振とうします。組織を45〜50秒間振って、陰窩を解放します。また、陰窩の収量が低い場合は、振とうの勢いを強めます。最後に、全体的な陰窩の収量が低い場合は、ピペットとチューブの両方をウシ胎児血清(FBS)でコーティングして、組織がプラスチックに付着するのを防ぐことができます。
12. ろ過した陰窩を含む50 mLの円錐形チューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    注意: ペレットは、50mLの円錐管の底で観察する必要があります。
13. ピペッティングによって培地をデカントし、10 mLの氷冷マウス洗浄培地で上下にピペッティングして陰窩を再懸濁し、15 mLのコニカルチューブに移します。300 x g で 4°C で 5 分間遠心分離します。
14. よりクリーンな調製物を得るには、さらに10 mLのマウス洗浄培地で陰窩を洗浄します。前の培地をデカントし、10 mLのマウス洗浄培地中で上下にピペッティングして陰窩を再懸濁します。15 mL コニカルチューブを使用して、300 x g で 4°C で 5 分間遠心分離します。
    注:培地をピペッティングするときは、ペレットがしっかりと遠心分離されないことがあるため、注意が必要です。ペレットがきつくない場合は、培地の大部分をピペットで取り除き、500 μLを1 mLに残します。次いで、ペレットを10mLのマウス洗浄培地にピペッティングして再懸濁し、溶液を15mLのコニカルチューブに移した。小さな円錐形のチューブで遠心分離すると、ペレットの気密性を向上させることができます。
15. 培地をデカントし、10 mLの氷冷マウス洗浄培地で上下にピペッティングして陰窩を再懸濁します。再懸濁したら、明視野顕微鏡下で陰窩をカウントし、直ちに10 μLの培地をスライドガラス上にピペッティングします。
    1. スライドの別々の端に2つの10μL滴を置き、各液滴中の陰窩の数を数えます。2滴の間の数を平均して、10 μLあたりの陰窩の数を決定します。 この数に100を掛けると、1mLの陰窩の数が得られます。
       注:正確なカウントを行うには、再懸濁後すぐに10 μLの陰窩懸濁液を除去する必要があります。そうでない場合、地下室はチューブの底に落ち、カウントが不正確になります。
16. ウェルあたり300〜500個の陰窩をプレーティングすることを目標に、マウス洗浄培地に再懸濁された適切な量の陰窩を新しい15 mLコニカルチューブに移し、氷冷マウス洗浄媒体で10 mLにします。チューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 チューブの底に小さなペレットが見えるはずです。
17. パワーピペットで上清を除去します。P200ピペットを使用して、ペレットのみを残して残留培地を慎重に除去します。
18. ペレットを適切な量の氷冷基底膜マトリックスにゆっくりと上下にピペッティングして再懸濁します。クリプトペレットを再懸濁するときは、気泡が発生しないように注意してください。プレートの各ウェルに300-500クリプト/15μLの基底膜マトリックスをプレートします。メッキ後、組織培養プレートを反転させ、37°Cのインキュベーターに10〜20分間入れます。
19. プレートを元に戻し、500 μLのマウスコロノイド培地全体を各ウェルに加えます。合格の準備ができるまで、一日おきに培地を交換してください。3〜5日ごとにコロノイドを継代します。

3.コロノイドの継代

注:各ウェルは通常、元のウェルの密度に応じて1:4から1:6に継代できます。-20°Cから適量の基底膜マトリックスを取り出し、氷の上に置いて解凍します。コロノイドは、2回の継代後の実験に使用できます。コロノイドを継代する場合、ステップは汚染を防ぐために生物学的安全キャビネット内で実行されます。

1. 継代するウェルから培地を取り出す。
   1. 基底膜マトリックス内に破片がある場合(初期分離中に発生する可能性がある)、次のプロトコルを使用して破片をクリーンアップできます。
      1. Ca² + または Mg²⁺ を含まない DPBS 中の氷冷した 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) 1 mL を各ウェルに加えます。生物学的安全キャビネットに5分間置いておきます。
      2. P1000ピペットを使用して3〜7回ピペットで上下にピペットして基底膜マトリックスを破壊し、ウェルの内容物を15mLのコニカルチューブに集めます。コロノイドを合計5〜10 mLの0.1%BSAで、^Ca2+ または^Mg2+を含まないDPBSで遠心分離します。0.1%BSAで適切なボリュームにします。
      3. 150 x g で4°Cで5分間遠心分離して、結腸をペレット化しますが、破片はペレット化しません。
      4. ピペッティングによってDPBSをデカントし、ペレットを残します。室温(RT)酵素解離試薬1 mLを加え、3〜5回ピペットで入れます。
      5. 酵素解離試薬と破砕コロノイドを入れた15 mLのコニカルチューブを37°Cの水浴に3〜4分間入れます。
      6. チューブを水浴から取り出し、3〜5回ピペットで、マウス洗浄媒体で10mLにします。手順 3.6 に進みます。
2. 500 μLのRT酵素解離試薬を各ウェルに入れ、約1分間静置してから、3〜7回上下にピペッティングして基底膜マトリックスを破壊します。
3. プレートを37°Cのインキュベーターに3〜4分間置きます。
4. プレートをインキュベーターから取り出し、P1000ピペットを使用して3〜7回上下にピペットでコロノイドを解離させた。
5. 内容物を15 mLの円錐形チューブに移し、氷冷マウス洗浄媒体で最大10 mLにします。
6. サンプルを300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
7. 必要に応じてパワーピペットとP200ピペットを使用して培地を除去し、ペレットのみが円錐管に残るようにします。
8. 適切な量の氷冷基底膜マトリックスに再懸濁し、プレーティングするウェルの数に応じてゆっくりと上下にピペッティングします。ピペッティング時に気泡を入れないでください。コロノイド断片をウェルあたり15 μLの基底膜マトリックス滴に入れます。
9. 陰窩をプレートし、組織培養プレートを反転させてから、プレートを37°Cのインキュベーターに10〜20分間置きます。
10. 最後に、プレートを元に戻し、500 μLの完全なマウスコロノイド培地を各ウェルに加えます。培地が約3〜5日で再び継代できるほど大きくなるまで、1日おきに培地を交換してください。

4. 結腸細胞の最終分化

1. 上記のようにコロノイドを継代し、500μLの完全マウスコロノイド培地を各ウェルに加える。
2. 継代後少なくとも48時間で、完全なマウスコロノイド培地を除去し、500μLの分化培地を各ウェルに追加します(セクション1を参照)。
3. コロノイドを分化培地で48時間インキュベートした後、RNAおよびタンパク質の収集を含む実験に使用することができる。
   注:コロノイドは、RNAを収集し、定量的逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を介して、幹細胞マーカーおよび細胞増殖マーカーであるLgr5およびKi67の発現をそれぞれ評価することにより、分化について評価できます。最終分化細胞は、細胞がより幹細胞様である従来のコロノイド培地で増殖したコロノイドと比較して、Lgr5およびKi67の発現が比較的低いはずです。コロノイドが分化培地中でインキュベートするのに必要な時間は、個々の検査室ごとに最適化する必要があるかもしれません。プライマーのリストについては、補足表1を参照してください。

5.炎症メディエーターによる分化型コロノイドの炎症誘発

1. コロノイドを分化培地で2〜3日間インキュベートした後、既存の培地を取り除き、500μLの炎症メディエーター培地を各ウェルに追加します。
2. RNAとタンパク質を収集する(または他の下流パラメータを評価する)前に、ウェルを24〜72時間インキュベートします。毎日培地を交換してください。

6.確立されたマウスコロノイドに由来する腸上皮単層

注:マウス腸上皮単層は、最低2回継代されたマウスコロノイドに由来します。.3〜5日で単層形成を成功させるためには、コロノイドを単一細胞に分離しないことが不可欠です。酵素的に細胞クラスターに解離された断片化されたオルガノイドは、増殖に理想的です。

1. 実験を開始する前に、すべての試薬を準備してください。基底膜マトリックスを氷上で解凍します。セクション1に記載されているようにマウス単層培地を調製します。解凍した基底膜を冷たいマウス単層培地で1:20に希釈します。氷の上に保管してください。
2. 滅菌鉗子を使用して、0.4 μmの透明な細胞培養インサートを24ウェル組織培養プレートの1つのウェルに配置します(材料表)。インサートのコーナープロングをつかみ、ウェルに移します。適切な数の細胞培養インサートが培養に使用可能になるまで繰り返します。
   注意: 追加のコントロールウェルは、基底膜マトリックスのみでコーティングしてください。この細胞培養インサートは、後続のステップ(ステップ6.3)で説明するように、細胞が存在しない細胞培養インサートのバックグラウンド抵抗を測定するために使用されます。
3. P200ピペットを使用して、各細胞培養インサートの頂端(上面)を150 μLの希釈基底膜マトリックスで覆います。インサートのメンブレンに触れずにピペットチップをインサートの中央に置き、溶液を静かに排出します。プレートを5%_CO2 を含む滅菌済みの37°Cインキュベーターに少なくとも1時間置きます。
4. 使用前に基底膜マトリックスを静かに取り外し、細胞培養インサートを生物学的安全キャビネットで最低10分間乾燥させます。
   1. 基底膜マトリックスを除去するには、24ウェルプレートを45°の角度で回転させます。プロングの角に1本の指を置き、インサートを安定させ、P200ピペットを使用して、ピペットチップをインサートの底面に沿ってそっと置き、マトリックスを取り外します。
   2. 各細胞培養インサートを^Ca2+ または^Mg2+を含まない150 μLの滅菌DPBSで洗浄することにより、余分な残留物を取り除きます。
5. 10分間の乾燥後、マウス単層培地400 μLを細胞培養インサートの底部に、75 μLを上部に加えます。すべての細胞培養インサートが浸るまで繰り返します。プレートを生物学的安全キャビネットに入れたままにするか、必要になるまでインキュベーターに戻します。
6. 成熟した(成長の3〜5日目にオルガノイド)腸コロノイドの24ウェルプレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターから取り出し、生物学的安全キャビネットの下に置きます。滅菌チップを使用して培地を取り出し、各ウェルを1 mLのRT滅菌DPBS(^Ca2+ または^Mg2+なし)で洗浄します。
   注:75〜125個の成熟コロノイドの個々のウェルを1:4の比率で分割します。
7. 滅菌チップを使用して^Ca2+ または^Mg2+ を含まないDPBSを除去し、継代する各ウェルに500 μLのRT酵素解離試薬を入れて基底膜マトリックスの各プラグを消化します。
8. プラグを壊すために、それぞれを約6〜10回上下にピペットします。プラグを取り外すためにプレートの底を傷つけないでください。代わりに、24ウェルプレートを45°の角度で回転させ、ピペットの先端をプラグの端に置き、ゆっくりと外します。
9. 24ウェルプレートを滅菌済みの37°C、5%_CO2 インキュベーターに3〜4分間戻します。
10. プレートを取り外し、生物学的安全キャビネットの下の各ウェルに対して酵素解離試薬を5〜7回上下にピペットで移します。解離したコロノイドを各ウェルから滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移します。氷冷マウス洗浄媒体で10 mLの容量まで持ってきます。
11. 部分的に消化されたコロノイドを300 x g で4°Cでスイングバケット遠心分離機で5分間遠心分離します。
12. 生物学的安全キャビネットの下で、10 mLピペットを使用してペレットから上清を取り除きます。P200ピペットを使用して残りの培地をすべて取り出します。コロノイドペレットをマウス単層培地に再懸濁する。プレーティングする断片化されたコロノイドの各細胞培養インサートごとに75 μLの培地を追加します。
13. 75 μLのコロノイド懸濁液を各細胞培養インサートの中央に加えます。コロノイド懸濁液を各ウェルに添加する前に、75 μLを除去する前に1回または2回静かに上下にピペッティングすることで、より均一なプレーティングが可能になります。
14. 細胞培養インサート付きの24ウェルプレートを回転プラットフォームに10分間置き、細胞培養インサート全体に均一に分散させます。
15. プレートを滅菌済みの37°C、5%_CO2 インキュベーターに入れます。
16. 翌日(1日目)に、P200ピペットで培地を3〜5回上下にピペッティングすることにより、付着していない結腸片を取り除きます。付着した腸細胞を破壊しないように、細胞培養インサートの内側の横に先端をそっと置きます。付着していないすべての破片の除去を妨げるため、媒体に気泡を導入しないでください。
17. 直ちに培地とコロノイドの混合物を取り除きます。すべての細胞培養インサートが洗浄されるまで繰り返します。
18. 予め温めたマウス単層培地150 μLを各細胞培養インサートの頂端側に静かに加えます。400 μLの加温マウス単層培地を新しい24ウェルプレートの各ウェルに加えます。滅菌鉗子を使用してプロングをつかんで、細胞培養インサートを新しいプレートに移します。コンフルエントになるまで一日おきに培地を交換してください。
    注:コロノイド断片は、メッキ後3〜5日でコンフルエントな単層を形成するはずです。

7.単層培養の3〜5日目にボルトオームメーターを使用して上皮単層の正味抵抗を測定する

注:箸電極は鉗子に似ており、長さは非対称です。プローブの長い方のアームは基底外側電極であり、短い方のアームは頂端電極です。プローブは、細胞培養インサートの内部と外部の間に挿入することが困難な場合があります。挿入時にプローブをわずかな角度で配置した後、プローブを垂直方向にまっすぐにすると、プローブが動かなくなるのを防ぐことができます。各細胞培養インサートの正味抵抗は、値に影響を与える可能性があるため、必ず同様の角度で読んでください。

1. ボルトオーム計とすべての試薬を生物学的安全キャビネット内に置きます。
   1. ボルトオームメーターを最も近いACコンセントに差し込み、電極プローブのプラスチック製モジュラーコネクタをフロントディスプレイ の入力ジャックに 差し込みます。
   2. ボルトオーム計を45°の角度で配置するには、機器の背面にある金属アームを所定の位置にロックされるまで振り出します。
   3. 次に、フロントディスプレイの電源スイッチを上にして、ボルトオームメーターをオンにします。最後に、スイッチをOHMSに向かって上に切り替えて、このメトリックの読み取り値を表示します。
2. 37°C、5% CO₂ インキュベーターから24ウェルプレートを取り出し、プレートを生物学的安全キャビネットに平らに置きます。経上皮電気抵抗(TEER)は温度に敏感です。TEERを読み取る直前にのみプレートを取り外してください。
3. 電極プローブをあらかじめ温めた70%エタノールで30秒から1分間滅菌します。プローブを取り外し、反転させ、1〜2回フリックして余分なエタノールを取り除きます。プローブを約30秒間風乾させます。
4. プローブに残っているエタノールを、あらかじめ温めたマウス洗浄媒体で洗浄します。
   注意: プローブ上の高い位置に残っているエタノール液滴を細胞培養インサートに落とさないでください。エタノールを培地で洗い流すときは、培地を滅菌エタノールフィールドの上に行かせないでください。これにより、汚染された培地が細胞培養インサートに入る可能性があります。
5. プローブを細胞培養インサートに対して垂直に保持します。基底外側電極(プローブの長い方の端)を、24ウェルプレートのベースに触れるまで細胞培養インサートの外側に挿入します。頂端電極(プローブの短い方の端)を細胞培養インサートにスライドさせます。2つの電極の距離をウェルからウェルに変えないでください。これはTEER測定に影響します。
6. TEERを読み取る前に、頂端電極が細胞培養インサートのベースに触れていないことを確認してください。バックグラウンドコントロール細胞培養インサートから開始し、値を記録します。値は、ボルトオームメータの前面に自動的にデジタル表示されます。
7. 細胞培養インサートごとに手順7.5〜7.6を繰り返します。
   注:細胞培養インサート間に異なる実験条件が存在する場合は、新しい条件ごとにプローブを滅菌してください。ステップ 7.1 から開始し、ステップを数値順に進めます。
8. すべてのTEER測定値が記録されたら、24ウェルプレートをインキュベーターに戻します。
9. 350 Ω以上の正味値は単層形成を示しています。単層形成が達成されるまで、次の日にもう一度繰り返します。
   注: 通常、1,000 Ω 以上の値は 3 日目にキャプチャできますが、時間が経つにつれて、それらはすべて 350 Ω前後の小さい数値に収束します。

8.ボルトオームメータからの正味抵抗測定値を使用したTEERの計算

注:コロノイドの単層形成が成功すると、115 Ω・cm²を超えるTEER測定値が得られます。

1. 個々の正味抵抗値を取得し、バックグラウンドウェルから正味抵抗を引きます。基底マトリックス膜でコーティングされた細胞培養インサートは、約100 Ωの正味の読み取り値を提供します。
2. バックグラウンドで差し引かれた正味抵抗測定値を取得し、それらに細胞培養インサートの表面積を掛けます。24ウェル細胞培養インサートの表面積は0.33cm2です。
3. 値が115 Ω・^cm2 以上の場合は、下流の実験アッセイに進みます。

9.炎症メディエーターによる上皮単層への炎症の誘発

1. 成功した単層が形成されたら、培養の基底側の培養物に炎症メディエーターを追加します。ステップ1.9で説明したように炎症メディエーター単層培地を調製し、新しい24ウェルプレートの各ウェルに400 μLを加えます。
2. 細胞培養インサートの頂端側から培地を取り出し、Y-27632を含まないマウス単層培地を150 μL加えます。この側に炎症性メディエーターを補給しないでください。ただし、細胞死が過剰であると思われる場合は、Y-27632を培地に残してください。これは、エンド ユーザーが決定する必要があります。
3. 細胞培養インサートを新しい24ウェルプレートに移し、炎症メディエーター単層培地を添加したウェルに入れます。
4. 実験に応じて、炎症メディエーターで単層を24〜72時間刺激します。
5. この炎症モデルを使用して薬物反応をテストするには、細胞培養インサートの頂端側にある単層培地に選択した薬物を補充します。薬物は、薬物の作用機序および評価されるべき下流パラメータに応じて、実験の任意の時点で添加することができる。

結果

3D腸コロノイド培養システムは、腸粘膜恒常性に対する上皮の固有の寄与を研究するための非常に貴重なツールです。記載されたプロトコルは、8週齢でC57BL/6J(WT)マウスから陰窩を単離し、複数の下流アプリケーションのために操作できる長期のコロノイド培養システムを確立する方法に関する詳細な指示を提供する。基底膜マトリックス中の陰窩を単離してめっきすると、明視野顕微鏡で視覚化すると、陰窩は高密度で多細胞構造に見えます。それらは球形または細長い円筒形であり、 in vivo 腸構造内で通常観察される単一の陰窩のような構造に似ています(図1A)。1日目までに、陰窩の大部分はコンパクトな球形構造を形成し、いくつかの結腸ノイドが上皮細胞のない内部内腔(空の空間)を発達させ始めます(図1B)。それらが次の数日間にわたって成長し続けるにつれて、コロノイドの直径は増加し続け、コロノイドの内腔はより明確になります(図1C)。5日目までに、各コロノイドの直径は約1...

ディスカッション

オルガノイドの開発は、科学界がin vitro で臓器系を研究する方法に革命をもたらし、皿の中の動物または人間の細胞構造と機能を部分的に再現する能力を備えています。さらに、疾患を持つヒトに由来するオルガノイドシステムは、治療上の意思決定を導く可能性のある個別化医療のための有望なツールを提供します。ここでは、適切に機能する暗号分離プロトコルについて説明し、メッキ前に分離内の余分な破片をクリーンアップできる重要な手順を紹介します。さらに、プロセスで見過ごされがちな重要な詳細、つまりメッキ用のクリプトを正確にカウントする機能について説明します。コロノイドが確立されると、IBD中の腸上皮の変化を研究する能力を高める可能性のある細胞分化または単層形成を可能にする重要な操作の概要を説明します。

哺乳類の結腸上皮の陰窩-絨毛軸は、異なる機能を持つ異なる細胞型からなる複雑な構造である。この軸の維持は、内因性および外因性の両方の細胞因子に依存しており、これらが一緒になって上皮恒常性を維持するのに役立ちます¹⁸。従来の培地で増殖したマウ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.4-μM 透明トランズウェル、24 ウェル	Greiner Bio-one	662-641
15 mL コニカルチューブ	Thermo Fisher	12-565-269
50 mLコニカルチューブ	サーモフィッシャー	12-565-271
70-μM細胞ストレーナー	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	ストック濃度 (1x);最終濃度(1x)
B-27サプリメント	Invitrogen	12587-010	ストック濃度 (50x);最終濃度 (1x)
World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%)用チョップスティック電極セット。最終濃度(100%)
ジチオスレイトール(DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	ストック濃度(1 m);最終濃度(1.5 mM);溶剤(超純水)
DMEM高グルコース	モフィ	ッシャー11960-069	ストック濃度(1x);最終濃度 (1x)
カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	Gibco	14190-144	ストック濃度(1x);最終濃度 (1x)
エチレンジアミン四酢酸 (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	ストック濃度 (0.5 m);最終濃度 (30 mM)
シ胎児血清	バイオテクネ	S11150H	ストック濃度 (100%);最終濃度 (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	最終濃度 (400 µg/µL)
ゲンタマイシン試薬	Gibco / Fisher	15750-060	ストック濃度(50 mg / mL);最終濃度 (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	ストック濃度 (100x);最終濃度 (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	ストック濃度 (1 m);最終濃度(10 mM)
hIFN&γ;	R&Dシステム	ズ285-IF	原液濃度(1000 ng/µL);最終濃度(10 ng / mL);溶剤(超純水)
hIL-1&β;	R&D Systems	201-LB	ストック濃度 (10 ng/µL);最終濃度(20 ng / mL);溶剤(超純水)
hTNF&α;	R&D Systems	210-TA	原液濃度 (10 ng/µL);最終濃度(40 ng / mL);溶剤(超純水)
過酸化水素	シグマ	H1009	ストック濃度(30%);最終濃度(0.003%);溶媒(マウス洗浄培地)
ハイグロマイシン B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	最終濃度 (400 & micro;g/µL)
L-WRN 細胞株	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	ストック濃度 (0.5 µg/µL);最終濃度(50 ng / mL);溶媒 (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x);最終濃度(1x)
N-アセチル-L-システイン	シグマ	A9165-5G	ストック濃度(500 mM);最終濃度(1 mM);溶剤(超純水)
Noggin	Peprotech	250-38	原液濃度 (0.1 ng/µL);最終濃度(100 ng / mL);溶媒 (超純水 + 0.1% BSA)
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	ストック濃度 (100x);最終濃度 (1x)
ペトリ皿 (滅菌済み; 100 mm x 15 mm) ポリスチレンディスポーザブル	VWR	25384-342
ポリスチレンマイクロプレート、24ウェル組織培養処理済み、滅菌済み	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	ストック濃度 (0.25 & micro;g/µL);最終濃度(500 ng / mL);溶媒 (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	ストック濃度 (10x);最終濃度(1x);溶剤(1 mM EDTA)
超純水	Invitrogen	10977-023	ストック濃度 (1x);最終濃度 (1x)
Y-27632 二水素塩化物	Abcam	ab120129	ストック濃度 (10 mM);最終濃度(10 & micro;M);溶剤(超純水)