Method Article

ヒト卵胞の遺伝子発現解析

DOI:

10.3791/64807

⸱

February 17th, 2023

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1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

In This Article

Summary

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ここでは、凍結融解皮質組織からヒト卵巣卵胞を単離して遺伝子発現解析を行う方法を概説するプロトコルについて説明します。

Abstract

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卵巣は、異なる細胞型で構成される不均一な器官です。卵胞形成中に起こる分子機構を研究するために、タンパク質の局在化および遺伝子発現を固定組織上で行うことができる。しかし、ヒトの卵胞における遺伝子発現レベルを適切に評価するためには、この複雑で繊細な構造を分離する必要があります。したがって、ウッドラフの研究室によって以前に記述された適応プロトコルは、卵胞(卵母細胞および顆粒膜細胞)を周囲の環境から分離するために開発されました。卵巣皮質組織は、最初に手動で処理され、組織スライサーと組織チョッパーの2つのツールを使用して小さな断片が得られます。次に、組織を0.2%コラゲナーゼおよび0.02%DNaseで少なくとも40分間酵素消化します。この消化ステップは、37°Cおよび5%CO2 で行われ、10分ごとに培地の機械的ピペッティングを伴う。インキュベーション後、単離された卵胞は、顕微鏡倍率下で較正されたマイクロキャピラリーピペットを使用して手動で収集されます。卵胞がまだ組織片に存在する場合、手順は手動の微小解剖で完了します。卵胞は培養液中の氷上で収集され、リン酸緩衝生理食塩水の液滴で2回すすがれます。この消化手順は、卵胞の劣化を避けるために慎重に管理する必要があります。卵胞の構造が損なわれているように見えるか、最大90分後に、10%ウシ胎児血清を含む4°Cブロッキング溶液で反応を停止します。リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)のためのRNA抽出後に適切な量の総RNAを得るために、最低20個の単離された卵胞(75μm未満のサイズ)を収集する必要があります。抽出後、20個の卵胞からの総RNAの定量は5 ng / μLの平均値に達します。次に、全RNAをcDNAにレトロ転写し、RT-qPCRを使用して目的の遺伝子をさらに分析します。

Introduction

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卵巣は、皮質内の卵胞および間質を含む機能的および構造的単位からなる複雑な器官である。卵胞形成は、卵胞の活性化、成長、および原始静止状態から受精し、初期の胚発生をサポートすることができる成熟卵胞への成熟までのプロセスであり、研究1で広く研究されています。この現象を引き起こすメカニズムを解明することで、女性の不妊治療を改善する可能性があります2。固定されたヒト組織の分析により、卵巣の機能単位内のタンパク質発現と遺伝子局在の評価が可能になります3,4。ただし、卵胞内の遺伝子発現レベルを正確に評価するには、卵胞を周囲の皮質から分離するための特定の技術が必要です。したがって、以前の研究では、卵巣の機能単位から直接遺伝子発現を分析できるように卵胞分離技術が開発されました5。酵素消化および/または機械的単離、ならびにレーザー捕捉マイクロダイセクションなど、組織片内の卵胞の分離を可能にするさまざまなアプローチが開発されています6、7、8、9。

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Protocol

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このプロジェクトは、エラスメ病院倫理委員会(ベルギー、ブリュッセル)によって承認されました。このプロトコルに含まれる患者は、2000年に化学療法曝露前に生殖能力温存のための卵巣組織凍結保存(OTC)を受けました。患者は、保管期間の終わりに残りの凍結組織を研究に寄付するための書面による同意に署名しました。

1.凍結保存された卵巣組織の解凍

  1. 5つの解凍液を含む6ウェルプレートを準備します。最初のウェルには、Leibovitz-15培地、0.1 mol/Lスクロース、1.5 mol/Lジメチルスルホキシド(DMSO)、および1%ヒト血清アルブミン(HSA)からなる5 mLの凍結保護剤溶液が含まれています。次のウェルには、凍結保護剤の濃度が低下した5 mLのLeibovitz-15培地が含まれています:1 mol / L、0.5 mol / L、および2 x 0 mol / L DMSO。
    注意: 凍結保護剤溶液は、不妊治療クリニックで使用されるプロトコルによって異なる場合があります。
  2. 安全規則(極低温手袋、保護メガネ、閉じた靴)に従って液体窒素から卵巣皮質断片を含むバイアルを取り出し、チューブを室温(RT)で30秒間保ちます。
  3. バイアルをRTで2分間、穏やかに攪拌しながらバイアルに浸してから、垂直フードの下でバイアルを開き、6ウェルプレートの最初のウェル(氷上)に直接移します。

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Results

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この単離手順を使用して、実験者は間質環境から卵胞を回収し、特定の遺伝子発現分析を行うことができます。卵胞の大きさと形態に基づいて、卵胞形成のさまざまな段階を区別することが可能です。実験者は、適合したマイクロキャピラリーピペットを使用して、サイズに応じて目的の卵胞を選択できます。最大75μmのマイクロキャピラリーを使用することにより、原始卵胞と一次卵胞を二次卵胞、胞状卵胞、成熟卵胞から識別することができます。さらに、実験者は卵胞の形態に応じて卵胞の段階を確認することができます。卵胞の活性化を研究する場合、静止卵胞と一次卵胞が選択され、約5 ng / μLのRNA濃度に達するには約20個の卵胞が必要です。

同じ患者からの2つの均質化された卵巣断片(4 mm x 2 mm x 1 mm)を処理し、このプロトコルを使用して卵胞を分離しました(図2)。1.5時間の単離手順の後、RNA量を比較し、卵胞選択の関連性を強調するために、発達段階に従って2つの卵胞集団を回収しました:<75μmの20個の卵胞(チューブ1)と<200.......

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Discussion

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卵巣組織の凍結保存は、がん患者の生殖能力を維持するための有望なアプローチです。診療所では、融解した皮質組織が寛解後に患者に移植され、卵巣機能と生殖能力の再開が可能になります19,20。臨床使用に加えて、卵胞形成を調節するメカニズムを研究するために、保存期間の終わりに研究のために残留卵巣断片を提供することもできます。さらに、この組織は、in vitro培養システムや人工卵巣など、移植が不可能な場合に移植に代わるものを開発するのに特に有用です。ただし、患者内および患者間のばらつきは、実験の実現可能性と再現性、および結果の解釈を制限します。.実際、卵胞密度は年齢とともに劇的に減少し、卵胞は断片21間で均等に分布していません。利用可能な断片の数は限られているため、ヒト組織は最先端の技術で使用する必要があります。免疫組織化学および免疫蛍光法、ならびにin situハイブリダイゼーションなどの幅広い技術を固定組織上で実施して、タンパク質および遺伝子局.......

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Disclosures

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著者は競合する利益を宣言しません。

Acknowledgements

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この研究は、Excellence of Science(EOS)助成金(ID:30443682)によってサポートされました。ベルギー国立科学財団(FNRS)の准研究員。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 mmグリッドシャーレコーニング430196
2100 バイオアナライザー機器AgilentG2939BA
2100 エキスパートソフトウェアAgilentバージョン B.02.08.SI648
4 ウェルプレートSigma AldrichD6789
6 ウェルプレートカール・ロス EKX5.1
Agilent total RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513
アスコルビン酸Sigma AldrichA4403
マイクロキャピペット用アスピレーターチューブアセンブリSigma AldrichA5177
遠心分離機Eppendorf5424R
Collagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript 逆転写酵素PromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-グルタミンΣ AldrichG7513
McCoy's 5A + 重炭酸塩 + HepesLifeTechnologies12330-031
McIlwain tissue chopperStoelting51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 & マイクロ;mCooperSurgical7-72-2200/1
マイクロキャピラリーRI EZ-Tips 75 &mCooperSurgical7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c オペレーティングソフトウェアThermoFisherバージョン 1.6
NanoDrop 分光光度計ThermoFisher2000/2000c
ペニシリン Gシグマ AldrichP3032
PowerTrack SYBR グリーンマスターミックスThermoFisherA46109
プライマー: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primers: HPRTF: CCTGGCGTCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primers: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3ThermoFisherA33779
RNA水性マイクロ全RNA単離キットThermoFisherAM1931
SeleniumSigma AldrichS9133
ピルビン酸ナトリウムSigma AldrichS8636
実体顕微鏡NikonSMZ800
ストレプトマイシン硫酸塩Sigma AldrichS1277
ショ糖Sigma AldrichS1888
Thermo Scientific Forma Series II  ウォータージャケット付き CO2 インキュベーターThermoFisher3110
Thomas Stadie-Riggs 組織スライサーThomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
10652202001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z.

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Gene ExpressionHuman FolliclesFollicle IsolationOvarian TissueEnzymatic DigestionGranulosa CellsRNA ExtractionRT qPCROocyte IsolationFolliculogenesis

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