方法論記事

マイクロ流体混合で調製したmRNA-脂質ナノ粒子のin vitro および in vivo 効率の試験

DOI：

10.3791/64810

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2023年1月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、ホタルルシフェラーゼをコードするmRNAをカプセル化する脂質ナノ粒子(LNP)を製剤化するためのプロトコルが提示されます。これらのLNPは、in vitro でHepG2細胞で、in vivo でC57BL/6マウスでその効力を試験しました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂質ナノ粒子(LNP)は、モデルナ社とファイザー/ビオンテック社によるCOVID-19 mRNAワクチンの開発に成功したことで、最近広く注目を集めています。これらのワクチンは、mRNA-LNP治療薬の有効性を実証し、将来の臨床応用への扉を開きました。mRNA-LNPシステムでは、LNPはmRNAカーゴをヌクレアーゼによる分解から保護し、細胞内送達を媒介する送達プラットフォームとして機能します。LNPは通常、イオン化脂質、リン脂質、コレステロール、脂質アンカー型ポリエチレングリコール(PEG)複合体(脂質-PEG)の4つの成分で構成されています。ここで、ホタルルシフェラーゼをコードするmRNAを内包したLNPは、LNP脂質成分を含む有機相とmRNAを含む水相をマイクロ流体混合することにより製剤化される。次に、これらのmRNA-LNPをin vitroで試験し、生物発光プレートベースのアッセイを用いてHepG2細胞におけるトランスフェクション効率を評価します。さらに、mRNA-LNPは、外側尾静脈からの静脈内注射後のC57BL/6マウスのin vivoで評価されます。全身生物発光イメージングは、in vivoイメージングシステムを用いて行われる。代表的な結果として、mRNA-LNPの特性、HepG2細胞におけるトランスフェクション効率、およびC57BL/6マウスにおける全発光束が示されています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂質ナノ粒子(LNP)は、近年、非ウイルス性遺伝子治療の分野で大きな期待が寄せられています。2018年、米国食品医薬品局(FDA)は、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシス1,2,3,4の治療薬として、史上初のRNA干渉(RNAi)治療薬であるOnpattro by Alnylamを承認しました。これは、脂質ナノ粒子とRNAベースの治療にとって重要な一歩でした。最近では、モデルナとファイザー/ビオンテックがSARS-CoV-2に対するmRNA-LNPワクチンのFDA承認を取得しました4,5。これらのLNPベースの核酸療法のそれぞれにおいて、LNPはヌクレアーゼによる分解から貨物を保護し、強力な細胞内送達を促進する役割を果たします6,7。LNPはRNAi療法やワクチンへの応用で成功を収めていますが、mRNA-LNPは、タンパク質補充療法8や、Cas9 mRNAとガイドRNAの同時送達、遺伝子編集のためのCRISPR-Cas9システムの送達9なども検討されています。しかし、すべての用途に適した特定の製剤はなく、LNP製剤パラメータの微妙な変化は、in vivoでの効力と生体内分布に大きな影響を与える可能性があります8,10,11。したがって、個々のmRNA-LNPを開発および評価して、各LNPベースの治療法に最適な製剤を決定する必要があります。

LNPは一般的に、イオン化脂質、リン脂質、コレステロール、脂質アンカー型ポリエチレングリコール(PEG)複合体(脂質-PEG)の4つの脂質成分で配合されています11,12,13。LNPによって促進される強力な細胞内送達は、部分的には、イオン化脂質成分12に依存している。この成分は、生理的pHでは中性であるが、エンドソーム11の酸性環境では正に帯電する。このイオン電荷の変化は、エンドソーム脱出の主な原因であると考えられている12,14,15。イオン化脂質に加えて、リン脂質(ヘルパー脂質)成分はカーゴのカプセル化を改善し、エンドソーム脱出を助け、コレステロールは安定性を提供し、膜融合を促進し、脂質-PEGは循環中のLNP凝集とオプソニン化を最小限に抑えます10,11,14,16.LNPを調合するには、これらの脂質成分を有機相(典型的にはエタノール)に結合し、核酸カーゴを含む水相と混合する。LNP製剤プロセスは、多数の物理化学的特性を持つ多くのLNP製剤を製剤化するために、さまざまな成分を簡単に置換してさまざまなモル比で組み合わせることができるという点で非常に用途が広い10,17。しかし、この多種多様なLNPを探索する際には、特性評価と性能の違いを正確に測定するために、標準化された手順を使用して各配合を評価することが重要です。

ここでは、mRNA-LNPの調製と、細胞および動物におけるmRNA-LNPの性能評価のための完全なワークフローについて概説します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:mRNA-LNPを調製する際には、RNaseおよびDNAの表面除染剤で表面および装置を拭き取り、常にRNaseフリーの状態を維持してください。RNaseフリーのチップと試薬のみを使用してください。

すべての動物実験は、ペンシルベニア大学の実験動物のケアと使用に関するガイドラインと、ペンシルベニア大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従って行われました。

1. 製剤前の準備

  1. 清潔な4Lビーカーに200〜300mLの新鮮な10xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を入れます。
    1. ビーカー内の10倍のPBSを超純水で10倍に希釈し、1倍のPBSのビーカーを得る。1x PBSの最終容量が2〜3Lであることを確認してください。
    2. LNP製剤に適した容量の透析カセット(分子量カットオフ[MWCO]20 kDa)を充填ビーカーに入れ、水和させます。
      注意: 透析カセットは、使用前に水分補給に最低2分かかります。
    3. ビーカーに攪拌子を入れ、ビーカーをアルミホイルで覆います。
    4. 蓋をしたビーカーを磁気攪拌プレートの上に置きます。攪拌板の電源を入れ、300〜400rpmで回転するように設定します。
  2. 100 mM クエン酸バッファーストック(pH 3)を超純水で 10 倍希釈して、mRNA 希釈に使用する 10 mM クエン酸バッファーを作成します。
  3. C12-200 イオン化脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、脂質アンカー型 PEG(脂質-PEG)ストック溶液を、各脂質を 100% エタノールに溶解して作成します。脂質成分の濃度を 表1に詳述する。
    1. 原液を37°Cで加熱・混合し、完全に溶解します。

2. 脂質と核酸の混合物の調製

  1. イオン化脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、脂質-PEGの必要量を、所望のモル比とイオン化脂質とmRNAの重量比に基づいて計算します(表1)。製剤化中のシリンジ内のデッドボリュームを説明するために、有機相の10%余分に容量を調製します。
    1. 異なる脂質成分の計算された体積を円錐形のチューブに組み合わせます。
    2. 脂質を100%エタノールで希釈し、最終容量 V(LNPの最終容量の25%)にします。
  2. イオン化脂質とmRNAの重量比と必要なmRNA-LNPの総量に基づいて、製剤に必要なmRNAの量を計算します(表1)。
    1. ホタルルシフェラーゼをコードするmRNAを氷上で解凍します。
    2. mRNAを10 mMクエン酸緩衝液中で、有機相の3倍の容量である最終容量の3Vに希釈します。
      注:各脂質容量( V)には、3V で希釈した mRNA に十分なイオン化脂質が含まれている必要があります。これは、所望のイオン化脂質とmRNAの重量比に相当します。

3. mRNA-LNPのマイクロ流体製剤化

  1. デリケートなタスクワイプにRNaseとDNAの表面除染剤をスプレーし、マイクロ流体機器の内部を完全に拭きます。
    1. 新しいマイクロ流体カートリッジを開き、インレットチャネルを下に向けて反対側に挿入します。
    2. コニカルチューブアームに15 mLのコニカルチューブが2本あり、右端の位置にあることを確認します。
    3. キャップを外した状態で、ホルダーに滅菌済みの15 mLコニカルチューブを2本構成します。
  2. 5 mL シリンジに、10 mM クエン酸バッファーで希釈した mRNA を含む mRNA 溶液を充填します。
    1. 純粋な100%エタノールで希釈した脂質を含む脂質溶液を3 mLシリンジに充填します。
    2. マイクロ流体デバイスのカートリッジホルダーを跳ね上げます。
    3. mRNAを含む5 mLシリンジを針なしでカートリッジの左入口に挿入します。
    4. 脂質を含む3 mLシリンジを、針なしでカートリッジの右側の入口に挿入します。
    5. カートリッジホルダーを裏返し、マイクロ流体機器の蓋を閉めます。
  3. マイクロ流体機器の電源を入れるには、機器の背面にあるスイッチを使用します。
    1. [ クイック実行] を選択します。
    2. 挿入した5 mLおよび3 mLシリンジに適したシリンジタイプを選択してください。
    3. mRNA-LNP製剤のパラメーターを、 表2に記載のとおり、水と有機物の流量比が3:1になるように入力します。
    4. [次へ]ボタンを押して、次の画面に進みます。
    5. 正しいパラメータが入力されていることを確認してください。
    6. スタートボタンを押して、mRNA-LNPを調製します。

4. mRNA-LNPの製剤化後の処理と特性評価

  1. 右の円錐形チューブに集めたmRNA-LNPを、あらかじめ水和させた透析カセットにロードします。
    注:mRNA-LNPを装填する際には、カセットのメンブレンに穴を開けたり、損傷させたりしないでください。メンブレンが損傷すると、ロード時にmRNA-LNPが失われます。
    1. mRNA-LNPを含む透析カセットを1x PBSの入ったビーカーに戻し、最低2時間透析します。
    2. 透析後、mRNA-LNPを含む透析カセットを滅菌バイオセーフティキャビネットに入れ、針付きシリンジを使用してmRNA-LNPを取り除きます。
    3. 0.22 μmのシリンジフィルターを使用してmRNA-LNPを滅菌ろ過し、滅菌コニカルチューブに回収します。
    4. 特性評価のために、65 μL の mRNA-LNP 溶液を 1.5 mL のマイクロチューブに入れます。
  2. キュベットで10 μLのmRNA-LNPを990 μLの1x PBSで1:100に希釈し、動的光散乱を用いて流体力学的サイズと多分散度指数を測定します。
  3. 蛍光アッセイ(RiboGreenなど)を用いて、mRNA-LNPの濃度とカプセル化効率を評価します。
    1. 20x TE バッファーを分子生物学用水で希釈して、1x TE バッファーのストック溶液を調製します。
    2. Triton X-100 を 1x TE バッファーで希釈して、1% Triton X-100 バッファーのストック溶液を調製します。
    3. 試薬ストックを 1 x TE バッファーで 1:200 に希釈して、蛍光試薬を調製します。
    4. mRNA-LNP を 1x TE バッファーで 1:100 に希釈し、1% Triton X-100 バッファーを黒壁ブラックボトム 96 ウェルプレートで 100 μL に希釈します。
    5. メーカーの指示に従って RNA 標準試料を希釈して低範囲の検量線を調製し、その検量線を 96 ウェルプレートに播種します。
    6. 希釈したmRNA-LNPまたは希釈標準試料を含む各ウェルに、希釈した蛍光試薬100 μLを加えます。
    7. 96ウェルプレートをプレートリーダー内に置き、1分間振とうした後、4分間待ちます。
    8. メーカーのプロトコルに従って、480 nm/520 nmの励起/発光で各ウェルの蛍光強度を測定します。
  4. 検量線を使用して、蛍光値を濃度に変換します。
    1. 式 4.4 に従って、LNP を 1% Triton X-100 で希釈して得られた値(total mRNA)から TE バッファーで希釈した値(カプセル化されていない mRNA)を差し引き、LNP を 1% Triton X-100 で希釈した値で除算して、カプセル化効率を計算します。
    2. LNPを1% Triton X-100で希釈して得られた値(total mRNA)から、TEバッファー(カプセル化されていないmRNA)で希釈した値を差し引いて、細胞および動物の研究に使用したmRNA-LNP濃度を計算します。
  5. 6-(p-toluidino)-2-ナフタレンスルホニルクロリド(TNS)アッセイを実施して、mRNA-LNPのpKa を測定します。
    1. 超純水中にTNSの0.16 mM溶液を作製して、TNS試薬を調製します。
      注:試薬を使用する際は、劣化を防ぐため、必ず氷の上に置き、光を避けてください。
    2. 150 mM 塩化ナトリウム、20 mM リン酸ナトリウム、25 mM クエン酸アンモニウム、20 mM 酢酸アンモニウムの緩衝溶液を、2 〜 12 の範囲の異なる pH 値に 0.5 刻みで調整して調製します。
    3. 2.5 μL の LNP を、黒壁黒底 96 ウェルプレートの pH 調整した各緩衝液に添加します。
    4. 最終的なTNS濃度が6 μMになるように、各ウェルにTNS試薬を添加します。
    5. 96ウェルプレートを暗所で5分間インキュベートします。
    6. 蛍光プレートリーダーを使用して、322 nm/431 nmの励起/発光での蛍光を測定します。
    7. データをシグモイド曲線に当てはめ、近似式を使用してpKaを計算し、最大強度の50%が観測されたpHを求めます。
  6. mRNA-LNPの流体力学的サイズ、PDI、封入効率、およびpKaの 代表的な結果を 表3に示す。

5. HepG2細胞の in vitro トランスフェクション

注:in vitroでのLNPのトランスフェクション効率の評価には、HeLa細胞やHEK-293T細胞など、他のさまざまな細胞株を使用できます。すべての細胞は、LNPトランスフェクション試験の前にマイコプラズマの検査で陰性である必要があります。

  1. 5,000個のHepG2細胞を、白壁透明底96ウェルプレートの各ウェルに100 μLの完全な細胞培養培地(10%ウシ胎児血清と1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEM)に播種します。
    1. 細胞を37°C、5%CO2の制御されたCO2インキュベーターで一晩接着させます。
  2. mRNA-LNPを完全細胞培養培地で希釈し、総用量が100 μLになるようにします。
    1. ウェルから培地全体を取り除きます。
    2. 細胞を、所望の用量で完全細胞培養培地または完全培地(コントロール)で希釈したmRNA-LNPで処理します。
    3. 処理した細胞を含む96ウェルプレートを、制御されたCO2 インキュベーターに24時間戻します。
  3. ルシフェラーゼアッセイを実施してトランスフェクション効率を評価します。
    1. ルシフェラーゼ試薬と1x細胞溶解バッファーをメーカーの指示に従って調製します。
    2. 細胞が入った96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、バイオセーフティキャビネットに入れます。
    3. 96ウェルプレートのすべてのウェルから細胞培養培地を取り除きます。
    4. 各ウェルに20 μLの1x溶解バッファーを加え、続いて事前に調製したルシフェラーゼアッセイ試薬100 μLを加えます。
    5. プレートを光から保護し、プレートをプレートリーダーに入れて、各ウェルの生物発光シグナルを測定します。
      注:以前に調製したC12-200 mRNA-LNPによるHepG2細胞の処理を示す代表的な結果を 図1に示します。

6. 尾静脈注入後のマウスにおけるmRNA-LNPsの in vivo 評価

  1. mRNA-LNP溶液を滅菌1x PBSで希釈し、100 μLの尾静脈注入量(20 gマウスの体重用量約0.1 mg/kgに相当)に2 μgの総mRNAが含まれるようにします。
  2. 承認された方法で各マウスを拘束し、70%アルコールで湿らせたパッドで尾を拭きます。
    1. 29 G のインスリンシリンジに 100 μL の mRNA-LNP(2 μg)または 100 μL の 1x PBS を充填します。シリンジから気泡を取り除きます。
    2. ベベルを上に向けて針をマウスの外側尾静脈に挿入し、100 μLのmRNA-LNPまたは1x PBSをゆっくりと注入します。
    3. 針を取り外し、止血が達成されるまで圧力をかけます。
  3. 注射後6時間で、15 mg/mLのd-ルシフェリンカリウム塩を滅菌1x PBSに溶かしたストック溶液を調製します。
    1. in vivo Imaging System(IVIS)の電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。
    2. Initialize(初期化)を押して、計測器をデータ集録用に準備します。
    3. ルミネッセンスの横のチェックボックスをオンにして、露光時間を自動に設定します。画像化するマウスの数に対して正しい視野が選択されていることを確認します。
    4. 以前に治療したマウスに200μLのd-ルシフェリン(体重1kgあたり150mgのルシフェリン)を腹腔内に投与します。
    5. マウスを2.5%イソフルラン、酸素流量2.0 L/分に設定された麻酔チャンバーに入れます。
    6. ルシフェラーゼシグナルが安定するまで10分間待ってから、mRNA-LNPで処理したマウスをイメージングします。
    7. マウスに完全に麻酔がかけられていることを確認し、麻酔ラインをリダイレクトして、イメージングチャンバー内の鼻錐形 を介して イソフルランを投与します。
    8. マウスをノーズコーンに移し、腹部を露出させて仰向けになるようにします。
    9. チャンバーのドアを閉じ、ソフトウェアの [取得 ]ボタンをクリックして生物発光画像を取得します。
      注:mRNA-LNPまたは1X PBS処理後のマウス全身イメージングの代表的な結果を 図2に示します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA-LNPは、平均流体力学的直径76.16 nm、多分散度指数0.098のマイクロ流体装置を用いて調製しました。mRNA−LNPのpKaは 、TNSアッセイを行うことにより5.75であることがわかった18。これらのmRNA-LNPのカプセル化効率は、修飾蛍光アッセイおよび 式4.4を用いて92.3%と計算した。細胞処理および動物投与に使用した全 RNA 濃度は 40.24 ng/μL でした。この値は、修飾蛍光アッセイ19から、具体的には、LNPを1%Triton X−100および1x TE緩衝液で希釈して得られた蛍光を特定の濃度に変換し、カプセル化されたmRNAの量を計算することから得られた。

数式 4.4

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このワークフローでは、さまざまなmRNA-LNPを調製し、in vitroおよびin vivoでの効率を試験することができます。イオン化可能な脂質と賦形剤は、異なるモル比および異なるイオン化可能な脂質とmRNAの重量比で交換し、組み合わせることで、異なる物理化学的特性を持つmRNA-LNPを生成することができる22。ここでは、モル比35/16/46.5/2.5(イオン化脂質:ヘルパー脂質:コレステロール:脂質-PEG)のC12-200 mRNA-LNPを、イオン化脂質とmRNAの重量比が10:1で調製しました。これらのLNPは、in vitroでHepG2細胞で、in vivoでC57BL/6マウスでトランスフェクション効率を試験しました。C12-200 mRNA-LNPは、市販のマイクロ流体装置を用いたマイクロ流体混合により合成した。ピペットミキシングやTジャンクションミキシング4など、他の製剤法を使用してLNPを調製できますが、マイクロ流体ミキシングは、一般的に小さく...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

申告する利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.J.M.は、米国国立衛生研究所(NIH)所長のニューイノベーター賞(DP2 TR002776)、科学インターフェース(CASI)のバロウズウェルカム基金キャリア賞、米国国立科学財団のキャリア賞(CBET-2145491)、および米国国立衛生研究所(NCI R01 CA241661、NCI R37 CA244911、およびNIDDK R01 DK123049)からの追加資金からの支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.1 M 塩酸シグマ7647-01-0
0.22 μm シリンジ フィルタージェネシー25-243
1 mL BD スリップ チップBD309659
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (アンモニウム塩) (C14-PEG2000)アバンティ極性脂質880150P
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン (DOPE)アバンティ極性脂質850725P
1.5mL Eppendorf TubesFisher Scientific05-408-129
15 mL コニカルチューブFisher Scientific14-959-70C
200 プルーフ エタノールDecon Labs2716
23G ニードルFisher Scientific14-826-6C
3 mL BD Luer-Lokチップ付き使い捨てシリンジFisher Scientific14-823-435
3 mL 透析カセットThermo ScientificA52976
96 ウェル ブラック ウォール ブラック ボトム プレートフィッシャー サイエンティフィック07-000-135
96 ウェル ホワイト/クリア ボトム プレート、TC 表面サーモサイエンティフィ165306
酢酸アンモニウム、1 キログラムリサーチ プロダクツ インターナショナル 631-61-8
クエン酸二塩基SIgma3012-65-5
BD Luer-Lok シリンジ滅菌、単回使用、5 mLBD309646
C12-200 イオン化可能脂質ケイマン ケミカル36699
C57BL/6 マウスジャクソン研究所000664
コレステロールSigma57-88-5
CleanCapFLuc mRNA (5moU)TriLink BiotechnologiesL-7202
ディスポーザブルキュベットFisher Scientific14955129
D-Luciferin, Potassium SaltThermo ScientificL2916
DMEM, high glucoseThermofisher Scientific11965-084
Exel Insulin Syringes - 0.5 mLFisher Scientific1484132
ウシ胎児血清コーニング35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HyPure 分子生物学グレード ウォーターCytivaSH30538.03
Infinite 200 PRO プレートリーダーTecanN/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkin ElmerN/A
Large KimwipesFisher Scientific06-666-11D
ルシフェラーゼアッセイキットPromegaE4550
NanoAssemblr Ignite カートリッジ - クラシック - 100 パック精密ナノシステムNIN0065
NanoAssemblr Ignite Instrument精密ナノシステムNIN0001
PBS - リン酸緩衝生理食塩水 (10x) pH 7.4、RNase フリーThermo ScientificAM9624
ペニシリン-ストレプトマイシンサーモフィッシャー サイエンティフィック15140122
QB クエン酸バッファー、(クエン酸 100 mM) pH 3.0TeknovaQ2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay KitThermo ScientificR11490
Reporter Lysis 5x バッファーPromegaE3971
RNase Away Surface DecontaminantThermofisher Scientific7000TS1
塩化ナトリウムΣ 7647-14-5
水酸化ナトリウムΣ1310-73-2
リン酸ナトリウムΣ7601-54-9
TNS試薬(6-(p-トルイジノ)-2-ナフタレンスルホン酸ナトリウム塩)ΣT9792
トリトン X-100
ゼータサイザーマルバーン・パナリティナルNanoZS
ック 性 σ9036-19-5

参考文献

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