方法論記事

リード化合物の同定からバリデーションまでの低分子スクリーニング戦略

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DOI:

10.3791/64811

2023年1月20日

この記事について

要約

議論された記事:

Festa, F., Labaer, J. 自己組織化ヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤のスクリーニング.視覚化された実験のジャーナル。152、e59886(2019年)。

Stockman, B. J. et al. Nucleoside Ribohydrolasesの化合物阻害、IC50値、人工活性、および全細胞活性を決定するためのNMRベースの活性アッセイ。視覚化された実験のジャーナル。148、e59928(2019年)。

Gao, S. et al.線虫Caenorhabditis elegansの自動表現型プロファイリングによる化学毒性の予測のためのハイスループットアッセイ。視覚化された実験のジャーナル。 145、E59082(2019年)。

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. 接着細胞における標的関与を定量化するためのハイコンテントイメージングの使用。視覚化された実験のジャーナル。141、E58670(2018年)。

Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M.シングルターンオーバープロテアーゼPCSK9のタンパク質分解を評価するためのハイスループットルシフェラーゼアッセイ。視覚化された実験のジャーナル。138、e58265(2018年)。

Sullivan, C. et al. ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主免疫細胞の応答を特徴づける。視覚化された実験のジャーナル。119、e55235(2017年)。

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. 抗体アレイによるシグナル伝達経路の調査によるチロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性の評価.視覚化された実験のジャーナル。139、e57779(2018年)。

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A.NADH結合型ATPaseアッセイのセミハイスループット適応型で、低分子阻害剤のスクリーニングに応用されています。視覚化された実験のジャーナル。150、E60017(2019年)。

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. REPLACEによるタンパク質間相互作用阻害剤の開発:非ATP競合CDK阻害剤の設計と開発への応用.視覚化された実験のジャーナル。104、E52441(2015年)。

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. 化学阻害剤ライブラリーのスクリーニングによるT細胞受容体シグナル伝達のメディエーターの同定.視覚化された実験のジャーナル。143、e58946(2019年)。

Takakusagi, Y. Biosensorベースのハイスループットバイオパニングおよびバイオインフォマティクス解析戦略により、薬物-タンパク質相互作用の全球的検証を実現。視覚化された実験のジャーナル。166、e61873(2020年)。

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. HiBiT CRISPR細胞株を用いた標的タンパク質分解化合物のハイスループット細胞プロファイリング.視覚化された実験のジャーナル。165、e61787(2020年)。

編集記事

ゲノミクス革命は、遺伝的摂動とさまざまな疾患表現型との関連に関する膨大な量の知識をもたらしました1。これにより、潜在的な薬物標的として多数のタンパク質が注釈され、これらの標的を阻害する化合物の発見と開発への関心が高まりました2。これに関連して、ヒット化合物の発見、標的の検証、結合親和性の測定、選択性、毒性、細胞内標的の関与、ならびに化合物の反応性、安定性、および薬物動態特性のための重要なアプローチとして、さまざまなスクリーニング戦略が浮上しています。このコレクションは、低分子の生化学的および/または生物学的活性をスクリーニングおよび評価するために使用できる多数の戦略を紹介することを目的として、この分野における方法論的進歩のいくつかをキャプチャしています。

プロテインキナーゼは、500を超えるメンバーを持つ大きな酵素ファミリーを表します。これらの酵素はすべての細胞プロセスの重要な調節因子であり、その機能不全は多くの病気に関連しています3。したがって、彼らは創薬、ひいては方法論開発に強い関心の焦点となってきました。したがって、このコレクションの 4 つの記事は、この分野の進歩について報告しています。Festaらは、自己組織化核酸プログラマブルタンパク質アレイ(NAPPA)を使用するキナーゼ阻害剤発見のためのスクリーニングプラットフォームについて説明しています4。これらのアレイは、完全長ヒトキナーゼを表示し、大規模なキナーゼコレクション全体にわたる化合物のマルチプレックススクリーニングを可能にするため、ヒットを同定するだけでなく、プロファイリングの選択性も可能になります。Tiemanらは、キナーゼ阻害剤活性の読み出しとして、リン酸化状態の細胞全体の変化をスクリーニングするために開発されたリン酸化抗体マイクロアレイベースの方法について説明しています5。これは、阻害に耐性を持つようになった経路の性質についての洞察につながる可能性があり、これは薬物反応と有効性を理解するための重要なパラメーターです。Chenらは、キナーゼ阻害剤のコレクションをスクリーニングして、T細胞受容体(TCR)シグナル伝達に影響を与える化合物を特定するためのフローサイトメトリーアッセイについて説明しています6。この戦略により、TCR シグナル伝達に関与するキナーゼが迅速に同定され、免疫治療薬開発の標的としての可能性が示されました。最後に、多くのキナーゼの活性はタンパク質間相互作用(PPI)によって調節されており、これらのPPIを標的とする化合物が興味深い可能性があることを示唆しています。Nandha Premnathらは、ペプチド結合体の特徴を同じ結合面に関与する小分子に変換することにより、キナーゼの非ATP競合PPIを開発するために使用できるREPLACE(計算濃縮を使用した部分的なリガンド代替物による置換)と呼ばれる方法を説明しています7。

キナーゼ以外にも、多くの酵素が疾患に関与しており、創薬において追求されています。したがって、キナーゼ以外の酵素に最適化された方法も興味深いものです。たとえば、Stockmanらは、寄生虫Trichomonas vaginalis8由来のヌクレオシドリボヒドロラーゼの阻害剤を発見および評価するための核磁気共鳴(NMR)分光法ベースの活性アッセイについて説明しています。これらのアッセイは、IC50 値の測定にも使用できます。ATPase阻害剤をスクリーニングするために、Radnaiらは、2つの酵素(ピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼ)を含む結合酵素アッセイフォーマットを使用するセミハイスループットスクリーニング法を開発し、最終的にATPase活性をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の固有の蛍光に変換します9。プロプロテイン転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)は、これまでに説明したすべての酵素がプロプロテイン転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)であり、その基質によって自己阻害される単一ターンオーバープロテアーゼです。これにより、PCSK9の阻害剤のスクリーニングが困難になり、Chorbaらは、PCSK9切断活性を分泌されたルシフェラーゼ活性に読み出しとしてリンクするハイスループット細胞ベースの方法を説明し、阻害剤のスクリーニングを可能にします10

さまざまな標的の活性を阻害する化合物を見つけることに加えて、化合物が細胞内で意図した標的に関与していることを確認するアッセイも非常に興味深いものです。Axelssonらは、免疫蛍光抗体によるハイコンテントイメージングと細胞熱シフトアッセイ(CETSA)11を組み合わせることに基づいて、接着細胞における標的関与を検証するための戦略を説明しています。このアッセイでは、大量の化合物コレクションで処理された細胞に等温熱チャレンジを使用して、安定化化合物を同定します。Richingらによって開発された、分解分子の標的結合と活性を評価できる方法は、HiBiT / LgBiTタグ付け技術を使用して発光タンパク質を生成し、発光の低下 を介して分解パラメータを監視します12。最後に、Takakusagiらは、ファージベースのペプチドディスプレイを使用して、薬物結合ペプチドモチーフと小分子の間の結合をスクリーニングすることに基づくタンパク質-薬物相互作用を検証する方法を説明しています13。ペプチド表示画面は、バイオインフォマティクス分析と組み合わされて、標的結合を検証します。

低分子検証のもう一つの層は、動物モデルにおける低分子の効果の特性評価です。このコレクションには、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)モデルを使用して抗ウイルス活性を有する化合物の有効性と宿主免疫応答を評価する方法14と、化合物毒性をプロファイリングするためのモデルとして線 を使用する方法の2つが含まれています15。これらの研究は両方とも、 in vivo での有効性と毒性を評価できる最適化された方法の必要性を強調しています。

結論として、創薬と開発は、多くのボトルネック、課題、失敗の可能性が高い手ごわいプロセスです。また、薬剤耐性病原体が驚くべき速度で増加している感染症分野や、慢性疾患や高齢化に伴う疾患の有病率が増加している分野など、疾病負担が続いており、集中的な注意と対応が求められています。このコレクションでは、創薬、検証、特性評価を加速することを目的としたいくつかの方法に焦点を当てています。今後、この分野では、特にスクリーニングのスループットの向上、化学ライブラリーの多様性の向上、ハイスループットスクリーニング(HTS)に対応した in vivo モデルの開発など、さらなるイノベーションが期待されます。さらに、効力、選択性、特異性、有効性、毒性をより速く、より小規模に全体像を把握できるワークフローは、特に有効になる可能性があります。

開示事項

M.K.は、ライフサイエンス編集者の有給コンサルタントです。

謝辞

M.K. は、NCI T32 CA236754 によって部分的にサポートされています。

参考文献

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

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