方法論記事

容積制御出血性ショックのブタ乳児モデルの説明

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DOI：

10.3791/64815

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2023年11月3日

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1Pediatric Intensive Care Department, Gregorio Marañón University General Hospital, 2Gregorio Marañón Health Research Institute, 3Primary Care Interventions to Prevent Maternal and Child Chronic Diseases of Perinatal and Development Origin Network (RICORS), Carlos III Health Institute

この記事について

サマリー

この記事は、出血性ショックの乳児ブタモデルを設定するための詳細でアクセスしやすいガイドを研究者に提供することを目的としています。

要約

出血性ショックは、小児患者の罹患率と死亡率の主な原因です。蘇生の指針となる成人で検証された臨床指標の解釈と異なる治療法間の比較は、この集団の固有の異質性のために小児では困難です。その結果、成人と比較して、小児出血性ショックの適切な管理はまだ十分に確立されていません。さらに、出血性ショックの小児患者が不足しているため、臨床的に関連する研究の開発が妨げられています。このため、小児の出血の影響とさまざまな治療法に対する反応を研究するには、実験的な小児動物モデルが必要です。麻酔をかけた若豚における出血性ショックの容積制御モデル児を本稿に紹介する。出血は、事前に計算された血液量を抜くことによって誘発され、その後、豚は監視され、さまざまな治療法で蘇生されます。ここでは、未熟なブタにおける出血性ショックの正確で再現性の高いモデルについて説明します。このモデルは、重度の出血に反応して活性化される代償メカニズムを特徴付ける血行動態データを生成します。

概要

外傷による生命を脅かす出血は、まれではありますが、小児患者の主要な死因です1,2。出血性ショックのその他の原因には、出血熱、消化管出血、肝臓手術、心臓手術などがあり、特に心肺バイパスを使用する場合3。

成人集団とは対照的に、小児出血性ショックの管理に関するデータは不十分であり、これは主に専門家の意見に基づいているか、成人の診療から直接翻訳されています2,4。しかし、大人からの経営戦略の翻訳は適切ではないかもしれません。例えば、成人で検証された臨床指標は、異なる年齢のグループ間に存在する生理学的不均一性および小児集団で優勢な異なる損傷パターンのために、小児患者に外挿することは困難です。その結果、小児患者への介入を引き起こす特定のエンドポイントは明確に定義されていません。さらに、現在成人に実施されている治療法が小児に及ぼす可能性のある有害な影響に関する十分な証拠はありません2,4,5。

これらすべてを考慮して、介入を促すための特定の蘇生閾値を確立し、小児出血性ショックに対する最も適切な治療法をより適切に決定するために、さらなる調査が必要である。しかし、小児の生命を脅かす出血に関する質の高い臨床的関連性のある研究の開発は、患者の不足と、新生児期から青年期までの小児集団におけるすでに述べた異質性のために困難である。

出血性ショックの臨床的関連性は、小児患者を対象とした臨床試験の実施の難しさに加えて、小児の出血性ショック後の病態生理学を研究し、異なる治療法を比較するための動物モデルでの前臨床評価の必要性を強調しています。出血性ショックを研究するための研究には、いくつかの動物モデルが広く用いられている6,7,8,9。ブタは人間との解剖学的および生理学的類似性により、生物医学研究において高く評価されています。特定の乳児モデルを使用する利点に関しては、未熟なブタの血行動態、呼吸器系、血液系、代謝系が、若いヒトの血行動態と非常に同等であることを示す証拠があります9。これは、小児の出血性ショックの臨床シナリオをシミュレートするユニークな機会を提供します。

このモデルでは、事前に計算された血液量を抜くことによって出血が誘発されます。その後、豚を監視し、さまざまな蘇生液を投与します。

ここでは、未熟なブタにおける出血性ショックの正確で再現性の高いモデルについて説明します。このモデルは、重度の出血に反応して活性化される代償メカニズムを特徴付ける血行動態データを生成します。

プロトコル

このプロトコルの実験は、スペインのマドリッドにあるグレゴリオマラニョン大学病院の動物研究のための施設倫理委員会、およびマドリッド自治政府の農業環境評議会(許可番号:12/0013)によって承認されました。倫理的ケアと実験動物の使用に関するヨーロッパとスペインのガイドラインが研究全体を通して適用されました。実験は、スペインのマドリッドにあるグレゴリオマラニョン大学病院の実験医学および外科で行われました。

注:選択した動物モデルは、生後2〜3か月(8〜12 kg)の健康なミニブタ(Sus scrofa domestica)で構成されていました。ミニブタは、生物医学研究に適した3つの異なる品種の交配の結果です。これらの動物はほぼ同一の血統であり、マドリッドの特別に認可された繁殖施設(IMIDRA)によって提供され、3つのホモ接合体の遺伝子系統を純粋に維持しています。雄と雌の動物は同じ意味で使われていました。動物には標準的な豚の餌を与え、健康を確保するために最低2日間観察しました。誤嚥のリスクを減らすために、処置の前夜に食事を抜いたが、水は出さなかった。一般的な実験では、麻酔導入と手術準備に30分、計装に60分、回復に30分、出血誘発と後方安定化に60分、蘇生に30分、フォローアップに120分など、完了するまでに約6時間かかります。

1.麻酔、挿管、人工呼吸器

  1. 首の外側領域、耳の後ろ、または大腿骨後部にケタミン(10 mg / kg)とアトロピン(0.02 mg / kg)の筋肉内注射で豚に前投薬します。.
    注:アトロピンなどの抗コリン薬は、豚が麻酔下で過剰に唾液を分泌する可能性があるため、有用です10。私たちの経験では、この用量のケタミンはストレスを軽減するのに十分であり、悪影響なしに豚に適切な鎮静と鎮痛を誘発します。ただし、動物が適切に鎮静されていない場合、または飼育室から手術室までの距離が長い場合は、別の用量のケタミン(10 mg / kg)を安全に投与できます。
    注意:動物を取り扱うときは手袋が必要です。
  2. 鎮静された動物を手術室に運び、温かい毛布を備えた手術台に置きます。
  3. 豚の耳にクリップで留めたセンサーで末梢酸素飽和度(Sp02)を測定し、連続的な3誘導心電図(EKG)モニタリングを開始します。
  4. ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンスクラブとアルコールを少なくとも3回交互に皮膚を消毒します。末梢静脈カテーテル(22-24 G)を耳静脈に挿入します。事前に消毒液で皮膚を消毒してください。
  5. フェンタニル (5 μg/kg)、プロポフォール (4 mg/kg)、アトラクリウム (0.5 mg/kg) の静脈内注射により麻酔を誘発する。自発呼吸がなくなり、反射神経がないことを確認したら、動物を背臥位にし、吸気酸素(Fi02)の割合を100%に設定した犬用マスクでハンドバッグマスクの換気を直ちに開始します。
    注:神経筋遮断薬の使用に関連する偶発的な認識のリスクを減らすために、豚で有効性が知られており、上限の用量の麻酔薬を使用して、適切なレベルの麻酔を確保する必要があります。.さらに、心拍数、血圧、体温などの心血管徴候を継続的に監視し、離脱反射(足の離脱、眼瞼反射、顎の緊張)がなく、筋肉の緊張がリラックスしている場合にのみ神経筋遮断薬を投与します。.
  6. 気管内挿管を行います。この手順には、少なくとも 2 人のオペレーターが必要です。
    1. 気管内挿管に必要な基本的な機器と手術器具の準備が整っていることを確認します:口を開けてチューブを固定するためのガーゼ、長さ17〜25 cmのストレートブレードを備えた獣医用喉頭鏡、一般的な気管内チューブ(ID 4-5)、スタイレット、空気の入った注射器、粘着テープ。
    2. 舌を少し引き出し、上下の犬歯の後ろに置いたタイガーゼを使用して顎を開いたままにします。
    3. 喉頭鏡検査を行い、喉頭蓋が見えたら、喉頭鏡の先端を使用して喉頭蓋を舌の付け根に向かって上向きに押します。
      注:喉頭蓋が軟口蓋に付着している場合、チューブの先端で背側に変位する可能性があります。オペレーター 1 はステップ 1.6.2 を実行し、オペレーター 2 はステップ 1.6.3 を実行します。
    4. 声帯が見えてきたら、チューブを気管に少し回転させてゆっくりと進めます。
      注:気管の最も狭い点は声門下レベルにあります。チューブの挿入が難しい場合は、少し回転させるか、チューブを小さくしてみてください。
    5. スタイレットを取り外し、5 mLのシリンジを使用してカフを膨らませます。
    6. 対称的な胸部の上昇、適切な酸素飽和度(95%〜100%)、および適切な波形と潮汐終末CO2(EtCO2 )の読み取り値を観察して、気管内チューブの配置を確認します。.
      注意:豚は喉頭痙攣や喉頭粘膜の浮腫に非常に敏感であり、喉頭穿孔は、挿管を数回試みた後、または鎮静が不十分な場合にも発生する可能性があります10。
  7. 挿管を確認した後、呼吸数20回/分、一回換気量8mL/kg、FiO240%、呼気終末陽圧4cmH2Oの人工呼吸器を使用して人工呼吸器を開始する。二酸化炭素(PaCO2)の分圧が35〜45mmHgになるように換気を調整します。
  8. フェンタニル (10 μg/kg/h)、プロポフォール (10 mg/kg/h)、およびアトラクリウム (2 mg/kg/h) の連続注入 により 、実験全体を通して深い麻酔を維持します。

2. インストルメンテーション

  1. 血管カテーテル検査のために大腿骨領域を準備します。包帯を使用して脚を後ろに引き、ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンスクラブとアルコールを少なくとも3回交互に鼠径部を消毒します。
  2. 超音波で大腿血管を評価し、ドップラー法を使用して動脈と静脈を区別します。静脈のサイズに応じて、大腿静脈の1つに3つのポートを備えた5.5〜7.5フレンチ(F)中心静脈カテーテルを、連続超音波ビューでセルディンガー法を使用して挿入します11,12。
  3. 中心静脈カテーテル留置直後に、トランスデューサーシステムを接続して中心静脈圧を測定します。
  4. グルコース注入(20 mL / h)を含む電解質が中心ラインポートの1つに接続され、維持生理食塩水注入(5 mL / h)が残りのポート を介して 注入され、カテーテルの閉塞が防止されていることを確認します。.
  5. 同じ技術を使用して、心拍出量モニタリング用に特別に設計された4Fの動脈カテーテルで反対側の大腿動脈をカニューレ挿入します。超音波検査で確認できない場合は、血液ガス検査を行ってカテーテルの正しい位置を確立します。
    注:重大なけいれんまたは血腫の場合は、対側の大腿動脈にクロスオーバーします。
  6. 動脈カテーテルを挿入したら、心拍出量モニターシステムと動脈トランスデューサーの動脈ワイヤーをモニターポートに直接接続します。モニターの静脈測定ユニットを中心静脈トランスデューサーに同時に接続します。
    注:この実験で使用した心拍出量モニターは、 材料表に指定されています。セットアップ、キャリブレーション、および対策については、製造元の指示13 を参照してください。
  7. 静脈トランスデューサーと動脈トランスデューサーの両方がゼロに校正されていることを確認してください。
  8. 左内頸動脈と左外頸静脈を切除法 で 露出させます。
    1. メス、先端が鈍い手術用ハサミ、組織鉗子、小型の自己保持型組織リトラクター、ニードルホルダー、外科用スワップ、針による縫合糸、18 G IVカニューレ1本、イントロデューサー付き5Fカテーテルシース1本、セルディンガーガイドワイヤー1本など、必要な機器と手術器具が揃っていることを確認します。
    2. 動物を背臥位にした状態で、消毒液で首の皮膚を消毒します。
    3. メスを使用して左気管傍切開~10cmを行い、下顎と顎の角度の間の線を二等分します。
    4. 外頸静脈を露出させるには、SCMの外側の組織を解剖し、静脈を周囲の筋膜から分離します。
    5. 隔離後、静脈の周りにループ状に巻かれた2つの非吸収性シルク縫合糸(USP-0)を使用して、穿刺前に血管を固定します。
    6. ベンフロン針(18 G)で静脈を切開します。静脈内に入ったら、針を引っ込め、ガイドワイヤーをベンフロンチューブに挿入します。
    7. ベンフロンチューブを取り外し、イントロデューサー(5 F)でシースをワイヤーに挿入します。挿入後、イントロデューサーとワイヤーの両方を取り外します。
    8. 挿入後すぐに、血栓の形成を防ぐために0.9%NaCl(5 mL / h)でシースをすすぎます。
    9. 近位シルク縫合糸をシースの周りに結んで固定します。その後、シースのハンドルをSCMに固定し、ホッチキスで皮膚を閉じます。
  9. 外科的準備後、ベースラインモニタリング値と血液サンプルを取得する前に、動物を30分間安定させます。
  10. 実験中は、サーマルブランケットとオーバーヘッドウォーマーを使用して、血液温度を37〜39°Cに維持します。
    注意: 温度は、熱希釈動脈カテーテルの先端にあるサーミスタで測定されます。

3.血行動態および灌流モニタリング

  1. 心電図、末梢酸素飽和度、呼吸量と圧力、およびFi02を監視します。
  2. 気管内チューブとマルチパラメータモニターの間に肺活量計を接続して、定性的および定量的なEtC02を測定します。
    メモ: マルチパラメータモニタの詳細については、 材料表を参照してください。
  3. 近赤外分光法(NIRS)を使用して、脳組織酸素化指数(bTOI)と内臓組織酸素化指数(aTOI)を監視します。センサーを額と前腹壁(肝下領域)の皮膚に置きます。
    注:脳センサーは、上矢状洞静脈血で汚染されている可能性があるため、正中線に置かないでください14。
  4. 内頸動脈に取り付けた血流プローブをフローモニターに接続し、頸動脈血流(CaBF)を測定します。
  5. 前腹壁の皮膚にレーザードップラーセンサーを配置して、皮膚組織血流(CuTBF)を連続的に測定します。
    注意: 頸動脈および皮膚房状ブローフローセンサーの詳細については、 材料表を参照してください。
  6. ベースライン時および30分ごとに次のパラメータを記録します:血液温度、吸気一回換気量、EtCO2、心拍リズム、心拍数(HR)、収縮期血圧および拡張期血圧、平均動脈血圧(MAP)、ショック指数(HR /収縮期血圧)15、中心静脈圧、心臓指数(CI)、グローバル拡張末期容積指数(GEDVI)、脳卒中容積指数(SVI)、左心室収縮性(Dt / Dpmax)、 全身血管抵抗指数 (SVRI)、血管外肺水指数 (ELWI)、圧力脈拍変動 (PPV)、末梢ヘモグロビン飽和度、中心静脈飽和度 (ScvO2)、脳 (bTOI) および内臓 (aTOI) 組織酸素化指数 NIRS、CaBF、および CuTBF による。
  7. CI値を得るには、中心静脈カテーテルを通して8°C未満の温度で0.9%生理食塩水の5 mLボーラスを注入します。連続する 2 つのメジャーの平均を記録します。
  8. 大腿血管から0.3 mLの血液を採取することにより、30分ごとに動脈および静脈の血液ガスプロファイルと乳酸濃度を決定します。標準的な全血球計算、凝固研究、および生化学をベースライン時、出血誘発後、および実験の最後に実施します。
  9. 各採血後、0.5 mLの100 IU / mLヘパリンでラインを洗い流します。

4.出血性ショック誘発

  1. インスツルメンテーションとベースラインデータが収集された後、定常状態が達成されたら、30分以上かけて頸静脈から30 mL / kgの血液を回収することにより、血液量減少性ショックを誘発します。.
  2. 安定化のために30分かかります。この期間中は、救急医療チームの到着の遅れを模倣するために蘇生努力をしないでください。

5.輸液とフォローアップ

  1. 安定化期間の後、ボリュームエキスパンダーまたは血管作用剤のボーラスを30分間注入します。
    注:テストされたボリュームエキスパンダーと血管作用薬の例は、通常の生理食塩水、高張性アルブミン、アンジオテンシン、およびテルリプレシンです。この研究では、30 mL / kgの生理食塩水(NS)(n = 13)、15 mL / kgの5%アルブミンと3%高張生理食塩水(AHS)(n = 13)、または15 μg / kgのテルリプレシンと15 mL / kgの5%アルブミンと3%高張生理食塩水(TAHS)(n = 13)の単一の静脈内ボーラスが使用されました。
  2. 注入後、動物を120分間フォローアップします。血行動態パラメータを記録し、動脈および静脈の血液ガスプロファイルと乳酸濃度の決定のために30分ごとに血液サンプルを取得します。この期間中は蘇生努力をしないでください。

6. 実験終了と安楽死

  1. 実験が完了したら、鎮静剤の過剰摂取(5 μg/kgのフェンタニルと10 mg/kgのプロポフォール)と塩化カリウムの静脈内注射(2 mEq/kg)を使用して、蘇生に成功したすべての動物を犠牲にします。
  2. 連続心電図ディスプレイで、収縮または脈拍のない電気的活動による循環の欠如、侵襲的動脈圧モニタリング中の拍動性流れの欠如、およびその他のバイタルサインの欠如を確認します。
  3. フォローアップ期間中に動脈血圧が25 mmHg未満に低下した場合は、それ以上の苦しみを避けるために動物を犠牲にしてください。

結果

提示されたモデルは、出血性ショックとその後の蘇生後の大循環および微小循環の変化を研究するためのいくつかの実験で成功裏に使用され、さまざまな体液と血管作用薬を比較しています16,17,18,19。

ショックに対する反応を考慮すると、このモデルは、制御された出血が血行動態パラメーター、ならびに脳灌流および組織灌流に著しい変化をもたらすことを一貫して示しています。

容積離脱後、著しい頻脈とMAP、CI、SVI、血液量パラメータ(GEDVIおよびITBI)、および頸動脈血流の減少、および全身血管抵抗指数の増加が検出されます(図1および図2)。

全身灌流パラメータに関しては、乳酸は有意に増加し、ScvO2、CuTBF、およびbTOは減少します(図3)。中心静脈圧、Dt/Dpmax、ELWの変動は、通常、登録されません。

検査パラメータに関しては、ヘモグロビン含有量とヘマトクリット値は、液体が投与されるまで減少しません。アルブミン濃度は低下し、トロポニンレベルは制御された出血後に有意に増加します。.コア温度、PaO2、PaCO2、動脈血酸素飽和度、EtCO2、電解質、腎臓および肝機能パラメータなどの他のパラメータは、通常、安定しています。

このモデルは、ショックに対する心血管系および生化学的反応の分析における有用性に加えて、異なる蘇生液をうまく区別することが示されています。

以前の研究では、出血性ショックの乳児動物モデルで、高張液の少量の注入の使用 単独または異なる昇圧剤と組み合わせて、全体的な血行動態と灌流パラメーターが改善されます 通常の生理食塩水と比較した場合。

以前に報告したように、高張液の注入は、2倍の量の等張液の注入と同様の反応を引き起こすことを一貫して観察しています16,17,18。

より具体的には、アルブミンと高張生理食塩水の使用は、通常の生理食塩水または高張生理食塩水単独よりも大きくて長い体積膨張を引き起こし、HR、SVI、およびPPVに有意差があり、他のグループで観察されたように、血圧およびGEDVIの体積膨張後の漸進的な低下はありませんでした(図1および図2).さらに、高張アルブミンでは、体液膨張の開始と比較して、他のグループよりもbTOIとCaBFの大幅な増加、および乳酸レベルの大幅な低下として表される、灌流パラメータの大幅な改善も観察されました(図3)。この違いは、アルブミンが血液量を増やし、通常の生理食塩水よりも血管内コンパートメント内に長期間留まる能力に続発する可能性があると考えています。興味深いことに、輸液蘇生の開始時にテルリプレシンの単一ボーラスを追加すると、高張性アルブミン群で観察されたものと同様の結果が得られ、血行動態または灌流パラメーターの点で追加の利点が得られないことがわかりました17,18。

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図1:血行動態パラメータ。 (A) 心拍数の推移、(B) 平均動脈圧、(C) ベースライン時の心指数 (t0')、(D) ベースライン時の全身血管抵抗指数 (t0')。実験の過程で:制御された出血の終わり(Shock30');注入の開始、制御された出血の終了から30分後(Res0');注入終了(Res30');注入終了から30分後のフォローアップ(Obs30');注入終了後60分経過後のフォローアップ(Obs60');注入終了後90分経過後のフォローアップ(Obs90')。(*)ベースライン、同じグループとの有意差(p < 0.05)。(‡) 出血によるp < 0.05、同じグループ。(#) p < 0.05 グループ NS から。略語:NS =通常の生理食塩水;AHS = 高張生理食塩水アルブミン;TAHS = テルリプレシンと高張生理食塩水アルブミンの併用。データは平均と標準偏差で表されます。この図は、Urbano et al.17の許可を得て改作したものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図2:血液量パラメータ。 (A)脳卒中容積指数の推移、(B)脈圧変動、および(C)ベースライン(t0')での全体的拡張末期容積指数。実験の過程で:制御された出血の終わり(Shock30');注入の開始、制御された出血の終了から30分後(Res0');注入終了(Res30');注入終了から30分後のフォローアップ(Obs30');注入終了後60分経過後のフォローアップ(Obs60');注入終了後90分経過後のフォローアップ(Obs90')。(*)ベースライン、同じグループとの有意差(p < 0.05)。(‡) 出血によるp < 0.05、同じグループ。(#) p < 0.05 グループ NS から。略語:NS =通常の生理食塩水;AHS = 高張生理食塩水アルブミン;TAHS = テルリプレシンと高張生理食塩水アルブミンの併用。データは平均と標準偏差で表されます。この図は、Urbano et al.17の許可を得て改作したものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図3:全身灌流パラメータ。 (A)動脈血中乳酸の推移、(B)中心静脈血酸素飽和度、(C)ベースライン時の脳組織酸素化指数(t0')。実験の過程で:制御された出血の終わり(Shock30');注入の開始、制御された出血の終了から30分後(Res0');注入終了(Res30');注入終了から30分後のフォローアップ(Obs30');注入終了後60分経過後のフォローアップ(Obs60');注入終了後90分経過後のフォローアップ(Obs90')。(*)ベースライン、同じグループとの有意差(p < 0.05)。(‡) 出血によるp < 0.05、同じグループ。(#) p < 0.05 グループ NS から。データは平均と標準偏差で表されます。この図は、Urbano et al.17の許可を得て改作したものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

若い豚に処置を行うことは、これらの動物の特定の解剖学的および生理学的特徴のために複雑で生命を脅かす可能性があります。一貫した結果を達成し、動物の損失を減らすには、慎重に検討すべきいくつかの重要なステップがあります。第一に、動物のストレス反応を最小限に抑えるためには、適切なレベルの鎮静を達成することが不可欠であり、過剰になると、内因性カテコールアミン放出による結果が変化する可能性があります。また、動物は頻脈や不可逆的な代謝性アシドーシスを伴う重度のストレス反応を発症し、実験の終了を早める可能性があるため、筋肉内注射と挿管の間の遅延を避けることも重要です。他のグループは吸入麻酔薬を使用して良好な結果を得ていますが20,21、吸入鎮静剤では間接熱量測定による呼吸ガス交換の測定ができないため、静脈内投与を好みます。私たちの経験では、プロポフォールとフェンタニルの組み合わせは効果的であり、副作用はほとんどありません。温度の急激な変化は、ショックに対する動物の血行動態反応に大きな影響を与え、結果が改ざんされたり、最終的に実験の失敗につながったりするため、実験全体を通して慎重な温度管理を行うこともプロトコルの重要な側面です。

インスツルメンテーションのもう一つの重要な部分は、ブタの解剖学的構造の特殊性と喉頭痙攣に対する感受性を考えると、挿管です。したがって、この手順は、以前に経験のある少なくとも1人のオペレーターによって実行される必要があり、スタイレットと筋肉の弛緩の使用が推奨されます10,22。血管のカテーテル検査も、動物のサイズが小さいため難しい場合があります。大腿骨アクセスの場合、血管は深く位置しており、通常は直径が小さく、異なるコースと位置を示すため、超音波ガイド下穿刺が好ましい22。子宮頸部アクセスについては、頸動脈フロープローブの配置を可能にするために外科的アクセスを使用しますが、超音波技術も実行可能です23,24。外頸静脈のカニューレ挿入は、そのより広い直径、その表面的な位置、および周囲の構造の数が少ないために、通常好ましい22。カテーテルは、閉塞を防ぐために、挿入後すぐに生理食塩水で洗い流す必要があります。.凝固変化を避けるためにヘパリンを使用していません。また、当初は、余分な水分の投与による血行動態反応の歪みを防ぐために、ブドウ糖注入の投与を避けていましたが、動物が重篤で早期の低血糖を発症することを発見しました。最後に、麻酔や現在使用されている侵襲性の低い技術を使用しても、器具は動物に重大なストレス反応を引き起こすため、採血を開始する前に回復に十分な時間を残すことが望ましいです。出血性ショックの誘発については、生存率に優れた有意な病態生理学的反応を引き起こすため、30 mL / kgの除去を推奨します。私たちの経験では、子豚は大量の失血に耐えられず、死亡率は高いです。また、血液を徐々に抜くことも重要で、急激な除去は重度の血行動態の不安定性や動物の早期死亡につながる可能性がある。

研究者が利用できる種や実験モデルは多種多様ですが、動物の出血性ショックの理想的なモデル(単純で、再現性が高く、臨床状況を正確に再現する)は依然として課題となっています。マウスやラットを中心とする小動物モデルを用いて、ショックの病態生理学的メカニズムを解明しています。しかし、サイズが小さいため、外科手術やサンプリング手術の実施が大幅に複雑になります。犬や豚などの大型動物は、取り扱いが高価で複雑ですが、その大きさと人間との生理学的類似性により、治療戦略の前臨床評価に適しています。しかし、過去も現在も犬の使用は倫理的に問題があります。彼らは実験動物モデルとしてブタよりも優位に立つことはなく、その知能と人間とイヌの間の特別な二国間関係は、系統発生スケールでより高い位置に位置付けられています6,7,8。

これらすべてを考慮して、成豚は、成人の人間の生理学、サイズ、および解剖学的構造との類似性により、心臓血管研究に広く使用されてきました。しかし、文献で十分に確立されているように、心血管系、血液量、体温調節、およびショックへの反応の点で、人間の成人患者と小児患者の間には大きな違いがあります2,3,4。同時に、これらの違いは豚にも当てはまることを示す証拠があり、子豚は心血管、脳血管、血液、および電解質のプロファイルが小児のヒト患者のプロファイルと非常によく似ていることがわかっています9,25。最後に、両種の成体と乳児の解剖学的および生理学的違いを超えて、乳児動物モデル、特にミニブタの使用は、実際の臨床現場でモニタリングに使用されるのと同じデバイスをテストする機会を提供します。多くの場合、これらのデバイスの信頼性は、成人向けアルゴリズム、センサー、またはスケールを単純に適応させたために低いことが証明されています。これらすべての側面は、特定の小児動物モデルを開発することの重要性と、小児臨床環境へのトランスレーショナルユーティリティの観点からの関連性を裏付けています。

動物の種類の他に、出血性ショックの研究で一般的に使用される3つの基本的なモデルがあります:制御された出血(容量または圧力による)と制御されていない出血です。この記事で紹介するプロトコルは、通常、体重のパーセンテージによって計算される固定血液量が、観察者によって設定された期間にわたって除去される固定量出血モデルについて説明しています。それどころか、定圧出血モデルでは、動物は所定のMAPまで出血され、その後、動物種とショックの程度または結果に応じて、指定された期間、定期的な出血または輸液注入で維持されます。固定容積出血性ショックモデルと固定圧出血性ショックモデルの両方により、制御された条件下でのショック誘発性病態生理学的変化の研究が可能になり、再現性と標準化の点で明らかな利点を提供します。しかし、それらの主な制限は、血栓の形成の阻害および平均血圧の上昇により、出血の外科的制御の前に積極的な輸液蘇生が出血を増加させ、生存率を低下させることが知られている活動性出血に対するさまざまな蘇生戦略の効果の研究を許可しないことです。標準化された血管外傷(肝臓および脾臓の潰れ/裂傷、動脈損傷、または付属肢の切断)によって誘発される制御不能な出血モデルは、臨床状況をよりよく反映することが示唆されており、それによってさまざまな輸液蘇生戦略の効果をよりよく理解することが可能になる 低体温や止血製品などの他の介入。しかし、臨床的に最も関連性が高いにもかかわらず、これらの制御されていない出血モデルは、標準化と再現性の点でいくつかの明らかな欠点をもたらします。これらすべてを考慮すると、理想的なモデルは存在しないように思われるため、この分野の研究は、臨床的関連性と実験の標準化および信頼性とのバランスをとる必要があります6,7,8,9,26。

この研究で記述されたモデルは、ショック時の内皮機能障害や微小循環の変化18の調査、さまざまな血行動態モニタリングシステムの検証など、心血管研究における幅広い応用の可能性を提供する可能性がある。さらに、他の研究分野でも使用でき、重度の出血後の内分泌反応や免疫反応の研究、およびさまざまな液体や昇圧剤の副作用の測定を可能にします。ただし、さまざまな蘇生戦略に関する研究に関しては、臨床現場での変更を実施する前に、制御されていない出血モデルでそれらの効果を研究することをお勧めします7,26。

結果を実生活に外挿することの難しさに加えて、このモデルには他の制限があります。まず、麻酔薬の使用や人工呼吸器の使用など、実験設定に関連するいくつかの交絡変数があり、ショック中の生理学的反応を減弱させ、結果の解釈を複雑にする可能性があります。さらに、動物に対する計装ストレス応答と温度制御は、さまざまなメカニズムを介して大循環と微小循環に影響を与える可能性があります。このモデルのもう一つの重要な限界は、実験の必要性と資源の利用可能性に関連しており、心的外傷後の観察期間が限られていることであり、これは出血性ショックの長期的な影響の研究をさらに制限する。さらに、人間と豚の生理学的類似性にもかかわらず、考慮すべき種間の違いがいくつかあります。例えば、凝固系はブタでより効果的であるようである27,28。また、乳酸とコハク酸の血漿レベルは種によって異なり、ブタは基礎アルカローシスを患っているため、出血が酸塩基バランスに及ぼす影響を過小評価している可能性があります2 9。最後に、炎症反応と免疫反応、およびいくつかの昇圧剤受容体が豚で異なることもよく知られています9。特定の動物の違いも影響要因として考慮する必要があります。いくつかの研究は、ショックに対する感受性の点で性差を示しており、女性は男性よりも有意な生存率の優位性を持っています6,9。しかし、本研究で実施した実験では、種に内在する潜在的な変動性を最小限に抑えるために、同じ年齢層で同様の遺伝的背景を持つ動物を使用しています。

結論として、本稿は、小児出血性ショックの豚モデルを設定するための実践的かつ段階的なガイドを提供する。他の既存のモデルと比較して、これは信頼性が高くわかりやすいプロトコルであり、重度の出血後の病態生理学的反応の調査やさまざまな蘇生戦略の評価のために、生物医学研究に幅広く適用できます。

開示事項

この作品の著者には利益相反はありません。

謝辞

この研究は、プロジェクト「PI20/01706」を通じてInstituto de Salud Carlos III(ISCIII)から資金提供を受け、欧州連合によって共同設立されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。グレゴリオ・マラニョン小児集中治療室とグレゴリオ・マラニョン実験研究所の同僚の皆さんに感謝の意を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ADAスワブAlbino Dias de Andrade, S.A.300575750400   不織布綿棒
Alaris SECarefusionN/A容積式輸液ポンプ
AtracuriumAspen Pharma Trading Limited.アイルランド、ダブリンN/A筋弛緩剤
アトロピン 1 mg/mLB. Braun481377/1013
バリア接着剤開口部ドレープMölnlycke63621
BD エメラルド シリンジ 5 mL、10 mL、20 mL ベクトンディッキンソンSAhttps://www.bd.com/en-eu/offerings/capabilities/syringes-and-needles/injection-syringes/bd-emerald-3-piece-syringeさまざまなオプションが利用可能
BLF21AレーザードップラーモニターTransonic Systems Inc.BLF21A皮膚血流モニター
 BlueSensor NF ECG電極Ambu NF-50-A/12
Check-Flo パフォーマー イントロデューサー セット 5FrCook MedicalG12018血管シース
Datex ohmeda S5GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, FinlandM1162897血行動態モニター
フェンタニル 0.05 mg/mLKern PharmaN/AAnesthesia
GE Vivid S5GE Healthcare Sシリーズ超音波装置
Introcanの安全性 18 G, 22 G, 24 GB. BraunIntrocanシリーズ安全性 静脈内カテーテル
INVOS脳/体細胞酸素濃度計 成人用センサーMedtronic PLC, USAhttps://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry/invos-cerebral-somatic-oximetry-adult-sensors.html
INVOS OXIMETER 脳/体細胞ソマネティックス08-10566地域酸素濃度モニター
ケタミン 50 mg/mLファイザー47034鎮静
レオンプラスハイネン+ LöウェンスタインN/Aベンチレーター
ライフスコープ VS日本光電N/Aベッドサイドモニター
ミラー喉頭鏡ブレード 12&プライム;Jorgensen Labs, USAJ0449F喉頭鏡
マルチルーメン中心静脈カテーテルセット 7 フレンチ、3ルーメン、30cmアローCS-14703中心静脈カテーテル
Nellcor WarmTouch 5300ACovidienサーマルブランケット
ニトリル手袋メディハンズ KS-ST RT021使い捨て手袋
小児用ソーマセンサー INVOS 脳/体Covidienhttps://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry.html使い捨て地域酸素飽和度センサー
PICCO モニタリングキットPulsion Medical SystemsPV8215
PICCO 熱希釈カテーテル 5F/20 cmPulsion Medical SystemsN/A
Propofol Lipoven 10 mg/mLFresenius Kabi, SpainN/A麻酔
脈拍等高線心拍出量 (PiCCO2)Pulsion Medical SystemsN/AHemodynamic monitor
Rüsch flexislipTeleflex Medical503700気管内チューブスタイレット
Softa swabsB. Braun19579アルコールパッド
外科用シルク縫合糸 USP 0Aragó, Barcelona, Spain. 6245
TruWave圧力監視セットEdwardsT001767A圧力監視セット
超音波透過ゲルUltragel ハンガリー 2000 Kft. UC260
の

参考文献

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