方法論記事

うつ病ラットモデルにおけるモンゴル伝統医学Zadi-5の行動薬理学およびネットワーク薬理学に基づく分析

DOI：

10.3791/64832

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2023年2月24日

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1Faculty of Mongolian Medicine, Inner Mongolia Medical University, 2Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、うつ病におけるモンゴルの伝統的な薬であるZadi-5の治療効果の行動テスト検証とバイオインフォマティカル予測のための方法を説明しています。

要約

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Zadi-5は、うつ病や刺激症状の治療に広く使用されているモンゴルの伝統医学です。うつ病に対するZadi-5の治療効果は以前に報告された臨床試験で示されていますが、薬物に存在する活性医薬品化合物の同一性と影響は完全には解明されていません。.この研究では、ネットワーク薬理学を使用して薬物組成を予測し、Zadi-5錠剤の治療活性化合物を特定しました。ここでは、慢性予測不能軽度ストレス(CUMS)のラットモデルを確立し、オープンフィールドテスト(OFT)、モリス水迷路(MWM)分析、およびショ糖消費テスト(SCT)を実施して、うつ病におけるZadi-5の潜在的な治療効果を調査しました。この研究は、うつ病に対する Zadi-5 の治療効果を実証し、障害に対する Zadi-5 の作用のクリティカル パスを予測することを目的としています。フルオキセチン(陽性対照)群とZadi-5群の垂直および水平スコア(OFT)、SCT、およびゾーン交差数は、CUMS群のラットよりも有意に高かった(P < 0.05)。ネットワーク薬理学分析の結果によると、PI3K-AKT経路はZadi-5の抗うつ効果に不可欠であることがわかりました。

概要

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うつ病は、大うつ病性障害(MDD)とも呼ばれ、重度の神経精神疾患であり、社会の医学的および経済的負担を増大させる原因となっています。関連する複雑さ、罹患率、および死亡率のために、この障害の治療法を見つけるためにかなりの量の研究が行われてきました1,2。世界保健機関(WHO)のメンタルヘルス調査によると、現在、世界中で約3億5000万人がうつ病とそれに関連する症状に苦しんでいます。うつ病は、2030年までに世界の疾病負荷の主な原因として、がんと心血管疾患を追い越すと予測されています。したがって、うつ病の予防と治療は、近い将来、世界的な優先事項となるでしょう3。MDDの病因はまだ解明されていません。それでも、遺伝的素因、視床下部-下垂体-副腎軸の機能不全、神経伝達物質分泌の減少、神経免疫調節不全による神経炎症、細胞アポトーシス、および細胞増殖の減少4,5。

これらの因子の中でも、神経免疫調節不全による神経炎症や神経栄養因子の分泌変化は、うつ病をはじめとする多くの精神疾患の発症に関与していることが特に注目されています6。過去10年間、学者たちは、海馬が再生神経機能の主要な部位であり、感情と認知の調節に関与していることを実証してきました。この点で、海馬ニューロンは開発中の抗うつ薬の新規治療標的として認識されています7,8。また、海馬は記憶の学習や定着において、短期記憶や長期記憶にも関与していることが報告されています。具体的には、海馬のCA1領域における錐体ニューロンの不足は、逆行性および順行性健忘症を引き起こす9。典型的な抗うつ薬の治療戦略は、海馬の歯状回における細胞増殖と神経新生を促進することを目的としています。創薬化学技術に基づいて合成された天然物由来の化合物や低分子は、さまざまな神経精神疾患に対する革新的な治療薬の主要な供給源と考えられています。

モンゴル高原の遊牧民の子孫であるモンゴルの伝統薬は、長い歴史と理論的な医療体制が確立されており、様々な薬効成分が協調して作用し、相乗的な機能を生み出すため、マルチターゲット・マルチパスウェイ効果を発揮します。Zadi-5は、そのような薬の中でも確立された製剤であり、モンゴルの優れた臨床医である高石博士(1804-1876)によって書かれた「高石博士の臨床経験」に初めて記録されました。モンゴルでは、苦痛、動悸、刺激、心臓刺すような痛みの症状を治療するためにこれらの錠剤を使用することが長い間臨床的に行われてきました10,11。さらに、Zadi-5は、罹患した患者の脳卒中後うつ病の緩和に効果があることが証明されています12。CUMSに関する最近の実験的研究により、Zadi-5製剤は中枢神経伝達物質を調節することによりうつ病を緩和することが明らかになりました13。実際、Zadi-5では、うつ病のラットモデルにおいて、脳由来神経栄養因子(BDNF)とチロシンキナーゼ受容体B(TrkB)のレベルの上昇が検出され、学習と記憶の改善と相関しています14。しかし、そのようなうつ病の緩和のためのZadi-5の正確な作用機序は解明されていません。.

この研究は、行動テストを使用してラットのうつ病に対するZadi-5の治療効果を実証し、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)とSwiss Target Predictionを使用してZadi-5の成分を特定し、うつ病の治療におけるモンゴルの伝統医学であるZadi-5の有効性の根底にある潜在的なメカニズムを予測することを目的としています。

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プロトコル

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すべての実験プロトコルは、内モンゴル医科大学の動物実験ケア委員会の倫理によって承認され、動物のケアと倫理に関する国立衛生研究所のガイドラインに従っていました。8週齢(200g±20g)の雄のSprague Dawley(SD)ラットを、温度(22°C±2°C)と湿度(55%±15%)の部屋に、12時間/12時間の明暗サイクルで1週間飼育した。ネットワーク薬理解析のワークフローについては、 図 1 を参照してください。

1. ラットの行動試験

  1. CUMSラットモデルの確立
    1. 対照を除くすべてのラットに、28日間の隔離と組み合わせた次の刺激を適用します:24時間の明暗サイクルの反転、24時間の食物剥奪、24時間の水分剥奪、15分間の高速レベル振とう(1回/ s)、テールクランプ2分間、冷水(4°C)で5分間泳ぐ、 45°Cの熱刺激、および24時間の湿潤パディング(表1)。個々のケージでラットを飼育します。
      注意: 同じ種類の刺激を連続して繰り返すことは避けてください。 CUMSラットモデルを確立するための上記の手順は、動物倫理委員会によって承認されており、以前に説明されています15。
  2. 薬剤の調製
    1. Zadi-5錠剤を粉砕機で粉砕し、蒸留水で1.16 g / mL溶液を調製します。.蒸留水に0.36 mg/mLのフルオキセチン溶液を別途調製します。
  3. 薬物投与
    1. ラットを無作為に6つのグループ(n = 10)に分けます:コントロール(CON)、モデル(MOD)、Zadi-5グループ(Zadi-5、1.6 gのZadi-5 / kg16)、フルオキセチングループ(フルオキセチン、3.6 mgのフルオキセチン/ kg)。1日1回、28日間、ラット1匹あたり1mL/gの適切な薬液を強制経口投与し、CON群とMOD群を等量の蒸留水で処理する。
      注:強制経口は、すべてのグループのモデル確立の開始時に開始されます。
  4. オープンフィールドテスト(OFT)
    1. ブラックボックス(50 cm x 50 cm x 30 cm)を等面積の9つの正方形の領域に分割します。ボックスにビデオトラッキング分析システムを装備します。最後の強制経口投与の1日後、ネズミを中央の正方形に置き、その水平および垂直の活動を3分間記録します。
    2. すべての前足で交差した正方形の数を水平方向のアクティビティとして採点し、立って身だしなみを整える数を垂直方向のアクティビティとして採点します。各テストの後、75%アルコールで箱を洗浄して、その後のテスト17のためにラットの臭いを取り除きます。
  5. ショ糖消費試験(SCT)
    1. 消費の前後にそれぞれのボトルの重量を量り、式(1)を使用して、0日目、7日目、14日目、21日目、および28日目の60分間のスクロース選好率を計算します。
      ショ糖消費量= figure-protocol-1 × 100% (1)
  6. モリス水迷路(MWM)
    1. プールを 4 つの象限に分割します。象限を1から4まで順番に並べ、水面から1cm下の3番目の象限に隠しプラットフォームを配置します。
    2. ラットの被験者を異なる象限の迷路に配置してプラットフォームを120秒間探し、MWMビデオトレイル分析システムを使用して遅延時間を記録します。
    3. ラットの被験者をプールの固定位置に置きます。被験者が 120 秒以内に隠れたプラットフォームを見つけられない場合は、レイテンシーを 120 秒として記録します。
    4. 次に、プラットフォームを取り外し、ネズミを水中に置き、120秒間のゾーン横断回数を記録します。
    5. ある程度の不透明度のためにプールにミルクを追加します。実験中は水温を23°C±1°Cに維持してください。

2. ネットワーク薬理学的予測

  1. Zadi-5のアクティブなコンポーネントをスクリーニングします。
    1. Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP、https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)を参照し、「ハーブ名」セクションに「Myristicae Semen Seeds」、「Aucklandiae Radix roots」、「Piperis longi Fructus」を入力して、化学物質の名前を取得します。経口バイオアベイラビリティ (OB) の薬物動態指数を >30% とし、薬物様 (DL) 指数を >0.18 に設定します (補足ファイル 1)。
    2. 「Rou Dou Kou」(Myristica fragrans Houtt)、「Tu Mu Xiang」(Inula helenium L.)、「Mu Xiang」(Aucklandia lappa Decne.)、「Guang Zao」(Choerospondias axillaris Roxb.Burtt Hill)、および漢方薬局方(http://www.zhongyaocai360.com/zhongguoyaodian/)の「Bi Ba」(Piper longum L.)を使用して、各成分の化学名を特定します。
    3. 同定された化学名をPubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)で検索し、異性体SMILESまたはInChIkeyを見つけます
  2. Zadi-5の有効成分の標的タンパク質を同定します。
    1. SEA(http://sea.bkslab.org/)、BATMAN(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)を用いて有効成分の標的タンパク質を異性体SMILESまたはInChIkeyで同定し、重複するタンパク質を見つけます。
    2. タンパク質データベースUniProt(http://www.uniprot.org/uploadlists/)を使用して、同定されたターゲットを統一された遺伝子名に変換します。
  3. うつ病の標的タンパク質を探索します。
    1. Genecards(https://www.genecards.org/)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)、Drugbank(https://www.drugbank.com/)のキーワード「depression」および「depressive disorder」を使用して、うつ病の潜在的なタンパク質標的を検索および特定します。
  4. 標的遺伝子を見つけます。
    1. ベン図(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)を閲覧し、リスト-1のZadi-5の有効成分のターゲットをアップロードし、リスト-2のうつ病のターゲットをアップロードして送信します。ベン図を取得し、重複するターゲット候補を除外します。
  5. ネットワークを構築します。
    1. "Type and Network" というスプレッドシートを作成します (補足ファイル 2)。「タイプ」はネットワークのシグネチャで、「ネットワーク」はサイン間の関係を示します。
    2. 「タイプとネットワーク」をCytoscape v3.9.0にエクスポートして、「Zadi-5 herbs-ingredients-disease targets」ネットワークを構築します。
  6. 標的候補のタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークを解析します。
    1. STRINGデータベース(https://cn.string-db.org/)で共通のターゲットを設定し、それらの相互作用を分析します。タンパク質の種類 を「ホモ・サピエンス」に設定します。 交互作用のしきい値 を 0.9 に設定し、実験的に検証されたタイプのみを選択します。孤独な島のノードを表示しません。
  7. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)およびGene Ontology(GO)による標的関連経路のエンリッチメント解析を実施する。
    1. Zadi-5 の 86 の潜在的な抗うつ薬ターゲットを DAVID (https:// david.ncifcrf.gov/) の開始 分析 ブラケットに貼り付けて、生物学的プロセス、細胞成分、分子機能を含む遺伝子オントロジー (GO) 機能、および遺伝子およびゲノムの京都百科事典 (KEGG) パスウェイ濃縮分析を実行することにより、関連するシグナル伝達経路を研究します。
      注: KEGG は、オンラインの IMageGP (http://www.ehbio.com /ImageGP/index.php/Home/Index/) を使用してバブル チャートで視覚化されます。バブルサイズは、指定された経路でエンリッチされたターゲットの数を表し、バブルの色はエンリッチメントのP値を表します。
  8. PI3K-AKT シグナル伝達経路と相互作用する Zadi-5 の活性化合物を説明するためにネットワークを構築します。
    1. KEGG経路のドキュメントをダウンロードし、エンリッチメント解析からPI3K-AKT経路の遺伝子を選択し、スプレッドシートに貼り付けて「タイプとネットワーク」のドキュメントを作成します。
    2. 「Type and Network」ドキュメントをCytoscapeにエクスポートして、「PI3K-AKT可視化された化合物-標的-経路ネットワーク」(補足ファイル3)を生成します。
      メモ: 「タイプ」はネットワークのシグニチャで、「ネットワーク」はサイン間の関係を示します。

3. 統計解析

  1. 一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くダンカンの事後検定を使用して、生化学的パラメータと遺伝子発現パラメータの有意差を判断します。標準偏差 (SD) ±平均を計算し、データを可視化します。 P < 0.05 を統計的に有意なものと考えます。

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結果

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動物行動試験
CUMS誘発ラットうつ病モデルにおける行動試験の結果
CUMS刺激前のOFTスコア、ショ糖消費量、MWM分析について、試験群間に有意差は認められなかった。CUMSモデルを確立した後、MOD群の垂直および水平スコアはCON群よりも低かった(P < 0.05)。MOD群と比較して、POS群およびZadi-5群の垂直および水平スコアは有意に高かった(P < 0.05)(図2A、B)。

0日目に、試験群はスクロース消費量(%)に有意差を示さなかった。28日目のZadi-5およびPOS群のショ糖消費量(%)は、MOD群のそれよりも高かった(図2C)。

CON群と比較して、MOD群がMWMでプラットフォームを見つけるまでの待ち時間は有意に高かった(P

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ディスカッション

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うつ病は、気分の落ち込み、無快感症、エネルギー不足を特徴とする精神疾患です。この障害は、注意散漫、認知機能障害、社会的引きこもり、不眠症、性機能障害、および胃腸疾患を伴います18,19。うつ病の研究では、新薬の病態メカニズムと効果を理解するために、動物モデルを確立することが重要です。この研究では、CUMS誘発ラットうつ病モデルが確立されました プロトコルセクション2および表1に記載されている刺激を通じて、社会、家族、および仕事に関連する原因からのストレス、攻撃、および欲求不満をシミュレートします。刺激の強度の適切な順序と調整は、このうつ病モデルを確立するために重要です。さらに、OFTのラットテストのたびに、次のラットの痕跡が影響を受けないように、箱をすぐに洗浄する必要があります。単離と組み合わされたCUMSは、ヒト患者における抑うつ症状および生化学的徴候の発症をシミュレートする信頼性の高いラットうつ病モデル20を効果的に作成する。このモデル...

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開示事項

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著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

中国の内モンゴル医科大学のモンゴル医学部が提供する機器と実験室に感謝しています。本研究は、中国国家自然科学基金会(81760762)および中国内モンゴル自治区衛生健康委員会科学技術計画プロジェクト(202201300)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Cytoscapeソフトウェア バージョン3.7.0
フルオキセチンリリー蘇州製薬有限公司J20160029
モリス水迷路ビデオトレイル分析システム Tai Meng Tech Co., LtdWMT-200
Sprague Dawley ratsBeijing Biotechnology Co., Ltd, China SCXK (JING) 2016-0002
 ビデオ追跡システムTai Meng Tech Co., LtdZH-ZFT
Zadi-5 pillPharmaceutical Preparation Center of International Mongolian Hospital, Inner Mongolian, ChinaM1301006

参考文献

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Zadi 5 PI3K AKT

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