ここでは、白血病細胞の腹腔内注射を利用して、マウスの急性骨髄性白血病(AML)を確立し、増殖させます。この新しい方法は、AML細胞の連続移植に効果的であり、マウスへの静脈内注射で困難や矛盾を経験する可能性のある人の代替手段として役立ちます。
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この記事について
サマリー
要約
急性骨髄性白血病(AML)および持続性白血病幹細胞(LSC)を含む関連する再発を治療するための新しい治療法の満たされていないニーズがあります。レシピエントマウスへの眼窩後注射によるこれらの細胞の移植の成功に基づく治療法をテストするための実験的なAMLげっ歯類モデルは、課題に満ちています。この研究の目的は、腹腔内経路を使用してAMLの堅牢なマウスモデルを生成するための簡単で信頼性が高く、一貫した方法を開発することでした。本プロトコールでは、骨髄細胞を、ヒトMLL−AF9融合癌タンパク質を発現するレトロウイルスで形質導入した。原発性AMLの発症におけるドナーLSCとしての系統陰性(Lin-)およびLin-Sca-1+c-Kit+(LSK)集団の効率が検証され、AMLを生成する新しい方法として腹腔内注射が採用されました。腹腔内注射と眼窩後注射の比較は、2つの方法を比較対照するために連続移植で行われました。ヒトMLL-AF9ウイルスで形質導入されたLin細胞とLSK細胞の両方が、レシピエントの骨髄と脾臓によく生着し、本格的なAMLを引き起こしました。ドナー細胞の腹腔内注射は、連続移植時にレシピエントにAMLを確立し、AML細胞の浸潤は、フローサイトメトリー、qPCR、および組織学的分析によってレシピエントの血液、骨髄、脾臓、および肝臓で検出されました。したがって、腹腔内注射は、ドナー白血病細胞の連続移植を用いたAML誘導の効率的な方法です。
概要
急性骨髄性白血病(AML)は、予後不良の多様な病因の血液悪性腫瘍の一種です1。AML動物モデルの生成は、その複雑な変異と病理生物学を理解するための基礎を築き、新しい治療法を発見します2。マウスの白血病発生は、AMLを強力に誘導する混合系統白血病(MLL)遺伝子を含む融合癌タンパク質を発現するドナー細胞を移植して、ヒトの疾患を模倣することを含みます3。MLL遺伝子関連AML4の移植では、ドナー細胞の様々な細胞起源が報告されており、疾患起源の原因となる細胞についてはほとんど知られていない。
マウスへの移植のために複数の経路が開発されている。変異ドナー細胞を骨髄5に直接導入する大腿骨内注射ではなく、静脈副鼻腔神経叢、尾静脈、頸静脈を利用する静脈内注射がマウスAMLモデル6、7、8、9の作製に広く用いられている。眼窩後方(r.o.)注射の場合、体積制限、高い技術的要求、繰り返しの試行またはエラー....
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プロトコル
すべての実験は、ペンシルベニア州立大学の施設内動物管理および使用委員会によって事前に承認されました。
1. 緩衝液および試薬の調製
- アンピシリン補充(AP)LB寒天プレート(滅菌10cmプレート)を準備する。これを行うには、10 gのLBブロスを400 mLの蒸留水に寒天で溶解し、攪拌し、容量を500 mLまで上げます。オートクレーブ滅菌し、溶液を冷まし、溶液にアンピシリン(ストック:150 mg/mL)0.5 mLを加え、振って混合します。アルコールランプの近くの滅菌10 cmプレートに18 mLの溶液をすぐに加え、室温で固化させ、さらに使用するまでプレートを逆さまに4°Cで保管します。
- 寒天を含まないLB10 gを500 mLの蒸留水に溶解してLB培地を調製します。オートクレーブ滅菌し、溶液を冷まし、溶液にアンピシリン(ストック:150 mg/mL)0.5 mLを加え、振って混合します。
- 5 mLのペニシリン/ストレプトマイシンと10 mLの熱不活化ウシ胎児血清(hiFBS)を485 mLの1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に加えて、フローバッファーを調製します。
注意: 加熱してFBSを不活性化するには、解凍したFBSボトルを56°Cの水浴に入れます。ボトルが転倒したり、水浴に沈んだりしないようにしてください。温度は完全な劣化にとって重要です。これを確実にする....
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結果
r.o.とi.p.移植経路を用いたマウスAML細胞の移植効率の比較
これまで、MLL-AF9形質導入LSK細胞を眼窩後移植したレシピエントマウスで1°AMLの樹立が報告され、連続移植によって1°AML細胞の移植能が実証されました30。本研究は、骨髄リン細胞 を使用して移植を行う可能性を評価した最初の研究です。異常な白血球増加症の存在(図2A)と骨髄と脾臓における白血病細胞(CD45.1+)の浸潤の増加(図2B)は、骨髄リン細胞 を使用して1°AMLを生成する可能性を支持しています。疾患誘導期間を比較するために、レシピエント当たり2匹のドナーマウスを安楽死させ、LSKまたはLin− 細胞のいずれかを単離した。結果から、LSKまたはLin- 細胞を移植した1°レシピエントに有意差は観察されませんでした(
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ディスカッション
これらの上記の研究は、Lin細胞の 移植が1°マウスAMLの生成においてLSK細胞に匹敵するという支持的な証拠を提供します。さらに、現在のデータは、i.p.注射が静脈内(またはr.o.)注射と比較してマウスAMLを確立するための効率的で便利な方法であることも示しています。
LSK細胞に加えて、顆粒球単球前駆細胞(GMP)、共通リンパ系前駆細胞(CLP)、および共通骨髄系前駆細胞(CMP)などの他の集団が、さまざまなインキュベーション期間31,32の1°MLL-AF9誘導AMLの生成においてドナー細胞として置換されることが報告されていますが、最適な選択を示唆するための定量的比較は不足しています。現在の研究では、同じドナーマウスから単離されたLin-およびLSKは、形質導入された骨髄系前駆細胞(Sca-1-)がAML33を開始できたことを考えると、1°MLL-AF9誘導AMLの生.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
著者らは、ペンシルベニア州立大学獣医生物医科学部動物診断研究所のハック研究所のフローサイトメトリーコアファシリティと組織病理学コアファシリティがタイムリーな技術サポートを提供してくれたことに感謝します。この研究は、米国がん研究所(KSP)、ペンシルベニア州立農業科学大学、ペンシルベニア州立がん研究所、USDA-NIFAプロジェクト4771、K.S.P.およびRFPへのアクセッション番号00000005からの助成金によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| a-コンピテントセルを選択 | バイオライン | BIO-85027 | |
| 塩化アンモニウム (NH4Cl) | シグマ アルドリッチ | 猫# A-9434 | |
| アンピシリン | シグマ アルドリッチ | 猫# A0797 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA), フラクション V—低エンドトキシン グレード | ジェミニ バイオ製品 | Cat# 700-102P | |
| シプロフロキサシン HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM、高グルコース、グルタミンなし | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco'Rsリン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Corning | Cat#21-031-CV | |
| EDTA、二ナトリウム塩(EDTA-2Na)、二水和物、分子生物学グレード | Calbiochem | Cat#324503 | |
| ウシ胎児血清-プレミアムセレクト | アトランタバイオロジカルキャ | ット#S11550 | |
| ロトランスフェリン、ウシ | シグマAldrich | キャット#T1283 | |
| インスリン溶液ヒト | シグマ | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-グルタミン 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB Broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse抗マウスCD45.1(FITC) | Miltenyi Biotec | Cat#130-124-211 | |
| インターロイキン-3(IL-3) | ジェミニバイオプロダクツ | Cat#300-324P | |
| マウスインターロイキン-6(IL-6) | ジェミニバイオプロダクツ | Cat#300-327P | |
| マウス幹細胞因子(SCF) | ジェミニバイオプロダクツ | Cat#300-348P | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| 重炭酸カリウム (KHCO3), 粒状 | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| ラット抗マウス CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | ネコ # 105812 | |
| ラット 抗マウス Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD ファーミンゲン | ネコ # 558162 | |
| 組換えマウス FLT3-リガンド | ペプロテック | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin 組換えヒト フィブロネクチン フラグメント | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 試薬 | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI 試薬 | Σ Aldrich | Cat# T9424 | |
| トリパン ブルー 溶液、0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノール レッド | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-メルカプトエタノール (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySepマウス造血前駆細胞単離キット | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| 大容量 cDNA 逆転写キット | サーモフィッシャー | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J マウス | ジャクソン研究所 | #002014 | |
| CD45.2 C57BL6/Jマウス | ジャクソン研究所 | 株#000664 | |
| 機器とソフトウェア | |||
| Adobeイラストレーター | バージョン25.2.3 | ||
| BD accuri C6フローサイトメーター | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSysソフトウェアプログラム | バージョン1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prismバージョン6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 リアルタイム PCR システム | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 化学発光 蛍光イメージング | G:Box Chemi |
参考文献
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
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