方法論記事

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

DOI：

10.3791/64840

⸱

2023年6月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト多能性幹細胞(hPS細胞)からインスリン分泌型ベータ細胞への分化は、ベータ細胞の機能や糖尿病治療の研究材料となります。しかし、天然のヒトベータ細胞を適切に模倣した幹細胞由来のベータ細胞を得るには課題が残っています。これまでの研究に基づいて、hPS細胞由来の膵島細胞を作製し、分化の結果と一貫性を改善したプロトコールを作成しました。ここで説明するプロトコルは、ステージ1〜4で膵臓前駆細胞キットを使用し、その後、ステージ5〜7で2014年に以前に発表された論文(以下「Rプロトコル」と呼ぶ)から変更されたプロトコルを使用します。膵臓前駆細胞キットと直径400 μmのマイクロウェルプレートを使用して膵臓前駆細胞クラスターを作製するための詳細な手順、96ウェル静的懸濁液フォーマットでの内分泌分化のためのRプロトコル、およびhPS細胞由来膵島の in vitro 特性評価と機能評価が含まれています。完全なプロトコルでは、最初のhPS細胞増殖に1週間かかり、その後、インスリン産生hPS細胞膵島を得るのに~5週間かかります。基本的な幹細胞培養技術と生物学的アッセイのトレーニングを受けた担当者は、このプロトコルを再現できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

膵臓のベータ細胞は、血糖値の上昇に反応してインスリンを分泌します。1型糖尿病(T1D)1におけるベータ細胞の自己免疫破壊、または2型糖尿病(T2D)2におけるベータ細胞機能障害により、十分なインスリン産生が欠如している患者は、通常、外因性インスリンの投与で治療される。この命を救う治療法にもかかわらず、正真正銘のベータ細胞からの動的なインスリン分泌によって達成される血糖値の絶妙なコントロールに正確に匹敵するものではありません。そのため、患者はしばしば生命を脅かす低血糖エピソードや慢性高血糖エクスカーションに起因する他の合併症の結果に苦しむ。ヒト死体膵島の移植は、T1D患者の厳密な血糖コントロールを正常に回復させますが、膵島ドナーの利用可能性と移植のための健康な膵島の浄化の難しさによって制限されます3,4。この課題は、原理的には、ヒトPS細胞を代替出発物質として使用することで解決できます。

in vitroでヒトPS細胞からインスリン分泌膵島を作製する現在の戦略は、in vivoでの膵臓胚発生の過程を模倣することを目的としていることが多い5,6。これには、発生中の胚性膵臓の重要な段階を模倣するために、責任あるシグナル伝達経路に関する知識と、対応する可溶性因子のタイムリーな追加が必要です。膵臓プログラムは、転写因子フォークヘッドボックスA2(FOXA2)と性決定領域Yボックス17(SOX17)7によって特徴付けられる決定的な内胚葉へのコミットメントから始まります。決定的な内胚葉の逐次分化には、原始的な腸管の形成、膵臓および十二指腸のホメオボックス1(PDX1)7,8,9を発現する後部前腸へのパターン形成、およびPDX1とNK6ホメオボックス1(NKX6.1)10,11を共発現する膵前駆細胞への上皮拡張が含まれます。

内分泌膵島細胞へのさらなる関与は、内分泌促進性マスターレギュレーターニューロゲニン-3(NGN3)12の一過性発現と、主要な転写因子であるニューロン分化1(NEUROD1)およびNK2ホメオボックス2(NKX2.2)13の安定的な誘導を伴います。その後、インスリン産生ベータ細胞、グルカゴン産生アルファ細胞、ソマトスタチン産生デルタ細胞、および膵臓ポリペプチド産生PPY細胞などの主要なホルモン発現細胞をプログラムする。この知識と、広範でハイスループットな薬物スクリーニング研究からの発見により、最近の進歩により、インスリン分泌が可能なベータ細胞に似た細胞を持つhPS細胞の作製が可能になりました14,15,16,17,18,19。

段階的なプロトコルはブドウ糖敏感なベータ細胞6,14,18,19を発生させるために報告されている。これらの研究に基づいて構築された、現在のプロトコルには、平面培養でPDX1 + / NKX6.1+膵臓前駆細胞を生成するための膵臓前駆細胞キットの使用が含まれ、続いてマイクロウェルプレートを均一なサイズのクラスターに凝集し、静的3D懸濁培養でRプロトコルを使用してインスリン分泌hPSC膵島をさらに分化します。フローサイトメトリー、免疫染色、機能評価などの品質管理分析は、分化細胞の厳密な特性評価のために実施されます。このホワイトペーパーでは、指向性分化の各ステップを詳細に説明し、in vitro 特性評価アプローチの概要を説明します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、H1、HUES4 PDXeG、Mel1 INSGFP/WなどのhPSC株をフィーダーフリー条件で使用することに基づいています。このセクションでは、ステップバイステップの手順を詳しく説明し、代表的な結果のセクションにMel1 INSGFP/W の分化からの裏付けデータを示します。ここに記載されていない他のhPSC株を扱う場合は、さらなる最適化が必要であることを推奨します。このプロトコルで使用されるすべての試薬および溶液に関する詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 分化培地および溶液の調製

注:調製するすべての溶液については表 1 を、分化培地については 表2 を参照してください。

  1. 細胞培養用のすべての培地と試薬を無菌バイオセーフティキャビネットで調製します。使用前に、細胞培養関連溶液および基礎培地を浴中で37°Cに短時間温めます。
    注:以下に説明するように、サプリメントを追加して毎日新鮮な分化培地を作成し、同じ日に使用してください。あるいは、膵臓前駆細胞キットは、メーカーのプロトコルに従って数日間にわたって使用できる、より大きな容量を事前に準備するオプションを提供します。培地調製のための両方の方法は、うまく機能することが証明されています。培地をウォーターバスに長時間放置することはお勧めしません。毎日新鮮な培地を調製する場合は、凍結融解サイクルを繰り返さないようにサプリメントを分注することをお勧めします。

2. ヒトPS細胞の膵前駆細胞への分化

  1. mTeSR1完全培地中のマトリゲル被覆容器上の未分化hPS細胞を維持し、培地交換を毎日行います。維持培養中、細胞が~70%のコンフルエントに達したら、メーカーのプロトコルに従って細胞解離試薬を使用して、3〜4日ごとにhPS細胞を継代します。分化を開始するには、細胞を単一細胞に解離し、6ウェルまたは12ウェルの組織培養処理プレート(培地容量はウェルあたりそれぞれ2 mLまたは1 mL)に播種します。
    注:内胚葉基礎培地とそのアリコートの保管に関する指示については、 表1 を参照してください。.
  2. 培養ウェルをhESC認定マトリゲル(メーカーのプロトコルで推奨されている氷冷DMEM/F12で希釈)でプレコートし、プレートを加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターに30分間置きます。
  3. マトリゲルコーティングプレートを室温に戻します(3時間以内に使用)。
  4. 使用済みの培地をhPS細胞培養液から吸引し、DPBSで一度すすぎます。hPS細胞培養物を細胞解離酵素を用いて37°Cで3〜5分間、単一細胞に解離します。温かいDMEM/F12培地を加えて細胞を洗い流し、15 mLまたは50 mLのコニカルチューブに移し、300 × g で5分間泳動します。
  5. 幹細胞完全培地と10 μM Y-27632で細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤または自動セルカウンターで生細胞(トリパンブルー陰性)カウントを実行します。希釈したマトリゲルを吸引し、直ちに1.60-1.80 × 105/cm2 の密度で生細胞をマトリゲルでコーティングしたウェルに播種し、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。ステージ 1 に進みます。
    注:これにより、分化を開始するためのコンフルエントが~95%開始されます。メーカーのプロトコルによると、2.6 × 105 / cm2 の播種密度が推奨されます。さまざまな播種密度をテストして、細胞株の最適値を決定し、細胞の生存率を確認することをお勧めします。生存率が80%未満の場合は、分化を進めないでください。細胞生存率の低下は、収穫時の過剰消化または過剰粉砕、または播種前に細胞をDMEM/F12培地に長時間放置した結果である可能性があります。
  6. ステージ 1 の 1 日目に、内胚葉基礎培地を浴中で 37 °C に短時間温め、Supplement MR と CJ を解凍します。内胚葉基礎培地にSupplement MRおよびCJを添加して、ステージ1A培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
  7. 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ1A培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
    注意: 洗浄手順は不要です。培地交換の前に培養プレートを静かに振って、付着していない細胞を培養物から除去します。培地の除去中は、ピペットチップをウェルの底に触れないようにし、穏やかな培地添加を行うことで、単層を破壊しないようにしてください。
  8. ステージ1の2日目に、内胚葉基礎培地を37°Cの浴で短時間温め、Supplement CJを解凍します。内胚葉基礎培地にSupplement CJを添加して、ステージ1B培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
  9. 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ1B培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
  10. ステージ 1 の 3 日目に、手順 2.8 から 2.9 を繰り返します。ステージ 2 に進みます。
  11. ステージ2の1日目に、膵臓ステージ2-4基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメント2Aおよび2Bを解凍します。よく混ぜてすぐに使用してください。
  12. 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ2A培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
  13. ステージ2の 2日目に、膵臓ステージ2-4基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメント2Bを解凍します。よく混ぜてすぐに使用してください。
  14. 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ2B培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
  15. ステージ 2 の 3 日目に、手順 2.13 から 2.14 を繰り返します。ステージ 3 に進みます。
  16. ステージ 3 の 1 日目に、膵臓ステージ 2-4 基礎培地を 37 °C の浴で温め、サプリメント 3 を融解します。膵臓ステージ2-4基礎培地にサプリメント3を追加して、ステージ3培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
  17. 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ3培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
  18. ステージ 3 の 2 日目 と 3 日目に、手順 2.16 から 2.17 を繰り返します。 ステージ 4 に進みます。
  19. ステージ 4 の 1 日目に、膵臓ステージ 2-4 基礎培地を 37 °C の浴で温め、サプリメント 4 を融解します。膵臓ステージ2-4基礎培地にサプリメント4を追加して、ステージ4培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
  20. 使用済み培地をウェルから吸引し、ステージ4培地を加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間インキュベートします。
  21. ステージ 4 の 2 日目から 4 日目に、手順 2.19 から 2.20 を繰り返します。集計手順に進みます。

3. 直径400μmのマイクロウェルプレートを用いた膵前駆細胞クラスターへの凝集

  1. ステージ 4 の 5 日目に、マイクロウェル (24 ウェルプレート形式など) をウェルあたり 500 μL の付着防止リンス溶液で前処理します。
  2. バランスプレートを準備し、マイクロウェルプレートを1,300 × g で5分間遠心分離します。
    注意: 顕微鏡でプレートをチェックして、マイクロウェルに気泡が残っていないことを確認します。気泡がマイクロウェルに閉じ込められたままの場合は、さらに5分間遠心分離します。
  3. ウェルから付着防止リンス溶液を吸引し、1 mLのDPBSで1回すすぎます。ウェルからDPBSを吸引し、各ウェルに1 mLの凝集培地を添加します。
  4. 使用済みの培地を膵前駆細胞培養物から取り出し、DPBSで一度洗浄する。解離試薬を用いて、培養物を37°Cで10〜12分間、単一細胞に解離します。細胞を温かいDMEM/F12で洗い流し、チューブに移し、300 × g で5分間泳動させます。
  5. 細胞ペレットを凝集培地に再懸濁し、生細胞カウントを行います。ウェルあたり240万〜360万個の細胞(すなわち、マイクロウェルあたり2,000〜3,000個の細胞)を播種し、各ウェルに凝集培地を添加して、ウェルあたり2 mLの最終容量を達成します。
  6. P1000ピペットチップで細胞を数回静かに上下にピペットし、ウェル全体に細胞が均一に分布するようにします。マイクロウェルに気泡を入れないでください。マイクロウェルプレートを300 × g で5分間遠心分離し、マイクロウェル内の細胞を捕捉します。加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターでマイクロウェルプレートを24時間凝集させてインキュベートし、ステージ5〜7の分化に進みます。
    注意: 凝集中にプレートを乱さないように注意してください。最適な凝集体形成には、最大48時間のインキュベーション時間が必要な場合があります。

4. キット由来膵臓前駆細胞クラスターのヒトPS細胞膵島への分化

  1. ステージ5の1日目に、 ステージ5〜7の基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメントを解凍します(表 1 および 表2を参照)。ステージ5〜7の基礎培地にサプリメント(最終使用濃度まで)を追加して、ステージ5培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
  2. 凝集体を形成した後、P1000ピペットチップで凝集体を数回静かに上下にピペットで移動させ、凝集していない細胞を浮かせます。凝集体が重力によって落ち着くのを待ちます(~1分待ちます)。使用済みの培地(浮遊する非凝集細胞を含む)を、凝集体の吸引を避けながら、できるだけウェルから静かに取り除きます。
  3. 新鮮なステージ5培地をマイクロウェルプレートの表面に激しく分注し、マイクロウェルから凝集体を取り除きます。凝集体を超低接着性(ULA)6ウェルに移します。ステージ5培地で一度すすぎ、マイクロウェルから凝集体を完全に回収します。
  4. ULA 6ウェルですべての凝集体を回収し、ステージ5培地で凝集体を再懸濁し、密度を100μLあたり20クラスターに調整します(たとえば、各ウェルから~1,200クラスターが回収されると予想されます。1,200クラスターをステージ5培地6 mLに再懸濁します)。マルチチャンネルピペットを使用して、50 μLのステージ5培地をULA平底96ウェルプレートの各ウェルに分注します。コーナーウェルとエッジウェルに 200 μL の DPBS を充填します。
    注:エッジウェルは蒸発しやすいため、凝集体の培養には使用しないでください。そうでない場合は、縁に沿った蒸発を最小限に抑えるように設計された96ウェルプレート(堀が組み込まれた96ウェルプレートなど)を使用するか、培養プレートを高湿度の微気候細胞培養インキュベーターに入れます。
  5. ULA平底96ウェルプレートの各ウェルに100 μLのクラスター再懸濁液を添加し、ウェルあたり平均20個のクラスターを含む合計150 μLの培地が得られます。
    注:クラスター再懸濁液は、96ウェルに分注する前に毎回穏やかに混合してください。
  6. 培養プレートを加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターの平らな面に24時間置きます。
  7. ステージ5の2日目に、ステップ4.1に従ってステージ5培地を準備します。
  8. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから~90 μLの使用済み培地を除去し、100 μLのステージ5培地でリフレッシュします。
  9. ステージ 5 の 3 日目に、手順 4.7 から 4.8 を繰り返します。 ステージ 6 に進みます。
  10. ステージ 6の1日目に、ステージ5〜7の基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメントを解凍します(表 1 および 表2を参照)。ステージ5〜7の基礎培地にサプリメント(最終使用濃度まで)を追加して、ステージ6培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
  11. マルチチャンネルピペットを使用して、使用済みの培地を~90 μL除去し、ウェルあたり100 μLのステージ6培地でリフレッシュします。
  12. ステージ 6 の 2 日目から 8 日目に、手順 4.10 から 4.11 を繰り返します。 ステージ 7 に進みます。
  13. ステージ7の1日目に、ステージ5〜7の基礎培地を37°Cの浴で温め、サプリメントを解凍します(表1および表2を参照)。ステージ5〜7の基礎培地にサプリメント(最終使用濃度まで)を追加して、ステージ7培地を調製します。よく混ぜてすぐに使用してください。
  14. マルチチャンネルピペットを使用して、使用済みの培地を~90 μL除去し、ウェルあたり100 μLのステージ7培地でリフレッシュします。
  15. ステージ 7 の 2 日目から 12 日目に、手順 4.13 から 4.14 を繰り返します。 in vitro の特性評価に進みます。

5. フローサイトメトリー解析

  1. 培地を除去し、DPBSで一度洗浄する。培養物(平面前駆細胞または分化クラスター)を解離試薬で37°Cで10〜12分間インキュベートすることにより、単一細胞に解離します。FACS緩衝液で洗浄し、300 × g で5分間泳動させます。
  2. 細胞ペレットをFACSバッファーに再懸濁し、細胞カウントを行います。細胞を300 × g で5分間スピンさせます。単一細胞を500 μLのFix/Permバッファーに室温で10分間再懸濁します。
    注意:使用前にFix/Permバッファーを室温に戻してください。フィックス/パーミバッファーにはパラホルムアルデヒド(PFA)が含まれています。PFAはドラフト内で慎重に取り扱い、施設のガイドラインに従って廃棄してください。
  3. 500 × g で3分間スピンし、500 μLの1x Perm/Washバッファーで2回洗浄し、300 μLの1x Perm/Washバッファーに再懸濁します。100 μLの単一細胞再懸濁液(それぞれ2.5〜3個×10個の5 細胞を含む)を3本のマイクロチューブに移し、未染色コントロール、アイソタイプコントロール、および抗体染色を行います(サンプル抗体および希釈情報については 、材料表 を参照)。室温で45分間インキュベートし、ホイルで覆います。
  4. 500 × g で3分間回転させます。500 μL の 1x Perm/Wash バッファーで 2 回洗浄します。サンプルを100 μLのFACSバッファーに再懸濁し、染色した細胞(特定の段階でのマーカーの細胞内染色については 材料表 を参照)をフローサイトメーターとソフトウェア(FlowJoなど)で分析します。
    注:サンプルをすぐにアッセイしない場合は、光から保護して4°Cで保管してください。ゲーティング戦略では、フローデータを最初に散乱特性(FSC-AおよびSSC-A)によってゲーティングして小さな細胞デブリを除去し、次にFSC-AおよびFSC幅特性によってシングレットを同定します。ポジティブゲーティングとネガティブゲーティングは、幹細胞コントロールおよび/または未染色のアイソタイプコントロールによって決定されます。

6. ホールマウント免疫染色

  1. クラスターをマイクロチューブに集めます。重力によってクラスターを沈降させます。使用済みの培地を吸引し、1 mLのPBS(カルシウムとマグネシウムを含む)で1回すすぎます。クラスターを 1 mL の 4% PFA で 4°C で一晩固定します。
  2. PBSTで1回すすぎ、500 μLの0.3% TritonX-100で20〜30個のクラスターをマイクロチューブ内で周囲温度でチルトシェーカーで少なくとも6時間透過処理します。
    注:大規模なクラスターでは、より長い透過時間(最大24時間)が必要です。
  3. クラスターを100 μLのブロッキングバッファーに混入し、常温でチルトシェーカーで1時間インキュベートします。ブロッキングバッファーを除去し、抗体希釈バッファーで希釈した一次抗体100 μLとともに、チルトシェーカーで常温で一晩インキュベートします。
    注:イメージング中にバックグラウンドが強い場合は、一次抗体と4°Cでインキュベートしてください。
  4. チルトシェーカー(チルト角度を8、速度を20に設定)で500μLのPBSTで30分以内に3分間洗浄します。
  5. クラスターを抗体希釈バッファー中の100 μLの二次抗体とともに、チルトシェーカーで常温で一晩インキュベートします。チューブをホイルで覆います。
    注:イメージング中にバックグラウンドが強い場合は、4°Cで二次抗体とインキュベートしてください。
  6. 500μLのPBSTで1回すすぎます。100 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液(10 μg/mL、PBST溶液)を加え、周囲温度で10〜15分間染色します。ホイルで覆い、光から保護します。
  7. チルトシェーカーで500 μLのPBSTで3 x 30分間完全に洗浄します。洗浄工程中にチューブをホイルで覆います。
  8. クラスターを、メーカーのプロトコルおよび公開されているプロトコル20,21に従って組織接着剤でプレコートされたイメージングチャンバースライド(材料表を参照)に取り付けます。
  9. 組織透明化培地(PBS溶液中の80%グリセロール)をマウントし、ガラスカバーガラスで覆います。共焦点イメージングまで光から保護します。
    注:サンプルがすぐに画像化されない場合は、光から保護して4°Cで保管してください。

7. 静的GSISアッセイ

  1. 低グルコースのKreb's Ringer重炭酸塩(3.3G KRB)バッファー、高グルコース(16.7G)KRBバッファー、および30 mM KCl KRBバッファーを37°Cの浴で温めます。
  2. サイズに合ったクラスターを手摘みし、2 mLの温かい3.3G KRBバッファーですすぎます。クラスターを非組織培養処理した6ウェルプレートに移し、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで1時間、2 mLまたは温かい3.3G KRBバッファーで平衡化します。
  3. 平衡化後、アッセイチャンバー( 材料表を参照)に100 μLの温かい3.3G KRBバッファーを充填します。5つのクラスターを手摘みし、アッセイチャンバーの中央に移します。加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。
    注:10 μLのピペットチップを使用して、最小限の中容量でクラスターを移します。
  4. ~100 μLの上清を慎重に回収し、基礎インスリン分泌が測定されるまで-30°Cで保存します(ステップ7.9を参照)。このステップでは、クラスターを乾燥させたり、失ったりしないでください。直ちに100 μLの温かい16.7G KRBバッファーをアッセイチャンバーに加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで同じクラスターを30分間インキュベートします。
  5. ~100 μLの上清を慎重に回収し、グルコース刺激インスリン分泌が測定されるまで-30°Cで保存します(ステップ7.9を参照)。直ちに100 μLの温かい30 mM KCl KRB KRBバッファーをアッセイチャンバーに加え、加湿した37°C、5%CO2 インキュベーターで同じクラスターを30分間インキュベートします。
  6. ~100 μLの上清を慎重に回収し、KCl刺激インスリン分泌が測定されるまで-30°Cで保存します(ステップ7.9を参照)。ただちに100 μLのRIPA溶解バッファーをアッセイチャンバーに加え、5つのクラスターすべてを含む溶解バッファーをマイクロチューブに移します。
  7. オプション)P200ピペットチップで激しく粉砕し、手動でクラスターを破砕します。30秒間ボルテックスし、氷上で30分間インキュベートした後、さらに30秒間ボルテックスします。
    注:ボルテックスによる完全な溶解と、氷上での十分なインキュベーション時間を確保してください。
  8. 8,000 × g で1分間回転させます。上清を回収し、総インスリン含有量が測定されるまで-30°Cで保存します(ステップ7.9を参照)。
  9. 製造元のプロトコルおよび公開されているプロトコル20,22に従って、ヒトインスリンELISAキットを使用して、上清サンプル中のヒトインスリンを測定します。
    注:上清サンプルの凍結と解凍を繰り返すことは避けてください。凍結融解サイクルが 3 回を超えるサンプルはアッセイしないでください。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

幹細胞をインスリン分泌性hPS細胞膵島に7つのステップで分化させるハイブリッド戦略を開発し、平面培養の最初の4段階では膵臓前駆細胞キットを使用し、最後の3段階では静的浮遊培養で以前に報告された方法6に基づいて構築された修正プロトコルを使用します(図1).このプロトコルでは、細胞播種後24時間(ステージ0)でほぼコンフルエント(90%-100%)の培養を確保することは、ほとんどのhPSC株の効率的な分化を開始するために重要です(図2A)。特定の細胞株に最適な条件を決定するために、さまざまな播種密度をテストすることを強くお勧めします。ステージ1の培養では、この段階でよく見られる死細胞の浮遊により、培地が曇って見える可能性があります。これは、付着した細胞が血管表面を完全に覆っている限り、キットの分化効率を損なうことはありません。ステージ2〜4では、細胞が増殖し、細胞死が減少するにつれて、単層はより圧縮され、使用済み培地はステージ1ほど曇らなくなります(

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この論文では、in vitroで培養してから40日以内に、グルコースチャレンジでインスリンを分泌できるhPS細胞膵島を作製できる7段階のハイブリッドプロトコルについて説明します。これらの複数のステップの中で、決定的な内胚葉の効率的な誘導は、最終的な分化の結果のための重要な出発点を設定すると考えられています18,27,28。メーカーのプロトコールでは、分化を開始するために2.6 × 105/cm 2の播種密度が推奨され、細胞をステージ1培地に2日間曝露します。1日目に細胞がほぼコンフルエント(90%-100%)に達するようにするには、最適な播種密度が異なる可能性があるため、新しいhPS細胞株で作業する際に播種密度をテストすることを強くお勧めします。例えば、3つのhPSC株すべてを手元に置いて試験したところ、2.60 × 105/cm 2ではなく、1.6-1.80 × 10...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Timothy J. Kiefferは、この原稿の作成中にViaCyteの従業員でした。他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEMCELL Technologies、Michael Smith Health Research BC、Stem Cell Network、JDRF、Canadian Institutes of Health Researchからの支援に感謝します。Jia ZhaoとShenghui Liangは、Michael Smith Health Research BC Trainee Awardを受賞しました。Mitchell J.S. Braamは、Mitacs Accelerate Fellowshipの受賞者です。Diepiriye G. Iworimaは、Alexander Graham Bell Canada Graduate ScholarshipとCFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Awardを受賞しています。MCRIとモナシュ大学のEdouard G. Stanley博士には、Mel1 INS GFP/W ラインを共有し、アルバータ糖尿病研究所の膵島コアには、ヒト膵島を分離して配布してくださったことに心から感謝します。また、ブリティッシュコロンビア大学のライフサイエンスインスティテュートイメージングおよびフローサイトメトリー施設からの支援にも感謝しています。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397甲状腺ホルモン
4% PFA 溶液Santa Cruz バイオテクノロジーsc-281692ヒュームフード
96-Well, Ultralow Attachment, 平底Corning Costar (VWR)CLS3474平底; 最後の 3 つの段階の静的懸濁液培養用
AccutaseSTEMCELL Technologies07920ステージ4細胞用解離試薬
Aggrewell400 プレートSTEMCELL Technologies34415400 µm直径マイクロウェルプレート
Aggrewell800プレートSTEMCELL Technologies34815800 µm径マイクロウェルプレート
Alexa Fluor 488 ヤギ抗ヒト FOXA2 (ヤギ IgG)R&D SystemsIC2400G1:100 in flow cytometry; ステージ 1 細胞のアッセイに使用
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR&D SystemsIC108G1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)BD Sciences5660321:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR&フローサイトメトリーにおけるDシステムIC0041G 1:500
Alexa Fluor 647マウス抗ヒトC-ペプチド(マウスIgG1&κ;)BD Pharmingen5658311:2,000 in flow cytometry; ステージ 7 細胞
Alexa Fluor 647 マウス抗ヒト INS (マウス IgG1κ)BD Sciences5656891:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (マウス IgG1&κ;)BD Sciences5633381:33 in flow cytometry; Used for Assay of Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)BD Sciences5625941:50 in flow cytometry; ステージ1細胞のアッセイに使用
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κアイソタイプコントロールBD Sciences5577141:50 in flow cytometry
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-β signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies7010マイクロウェルリンス溶液
アッセイチャンバーCellvisD35-10-1-N静的GSISおよび共焦点イメージング用
ウシ血清アルブミン(BSA)サーモフィッシャーサイエンティフィックBP1600-100免疫染色手順用
CK19抗体DAKOM08881:50 in ホールマウント免疫蛍光
D-グルコースSigmaG8769ミディアムサプリメント
DAPIシグマD9542核対比染色用
DMEM/F12、HEPESサーモフィッシャーサイエンティフィック11330032マトリックス希釈液
ロバ反ヤギ アレクサフロー555ライフテクノロジーズ A214321:500 ホールマウント免疫蛍光
ロバアンチヤギ アレクサフロー647ライフテクノロジーズ A214471:500 ホールマウント免疫蛍光
ロバ反マウス アレクサフロー555ライフテクノロジーA315701:500 ホールマウント免疫蛍光
ロバアンチマウス アレクサフロー647ライフテクノロジーズ A315711:500 ホールマウント免疫蛍光
ロバ反ウサギ アレクサフロー555ライフテクノロジーA315721:500 ホールマウント免疫蛍光
ロバ反ウサギ アレクサフロー 647ライフテクノロジーA315731:500 ホールマウント免疫蛍光
ロバアンチシープ アレクサフロー 647ライフテクノロジーA214481:500 ホールマウント免疫蛍光
DPBSシグマD8537Ca2+ および Mg2+/
ELISA、インスリン、ヒトAlpco80-INSHU-E01.1ヒトインスリン測定用
脂肪酸フリーBSAProliant68700培地サプリメント
固定および透過化ソリューションキットBD Sciences554714Fix/Permおよび10x Perm/Wash溶液付属
穏やかな細胞解離試薬STEMCELL Technologies7174維持培養中のhPSCの塊継代用
グルカゴン抗体SigmaG26541:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibodyThermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061L-glutamine supplement
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4組織透明化およびマウント用
GSi XXSigma Millipore565789ノッチ阻害剤
ヘパリンシグマH3149培地サプリメント
ITS-X (100x)サーモフィッシャーサイエンティフィック51500056インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン; 培地サプリメント
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP拮抗薬
MAFA抗体Abcamab264051:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualifiedサーモフィッシャーサイエンティフィック08-774-552血管表面コーティング用細胞外マトリックス
MCDB131 中Life technologies10372019ベース培地
mTeSR1 コンプリートキットSTEMCELLテクノロジー85850幹細胞培地と 5x サプリメント
N-Cys (N-アセチル システイン)シグマA9165抗酸化
剤 NaHCO3SigmaS6297培地サプリメント
NEUROD1 抗体R&D SystemsAF27461:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibodyDSHBF55A12-c1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibodyR&D SystemsAF62971:200 in whole mount immunofluorescence
PBSSigmaD8662with Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibodyAbcamab472671:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)BD Sciences5658601:2,000 in flow cytometry; used for assay of stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)Sciences5630231:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)BDSciences5621611:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κアイソタイプコントロールBD Sciences5546801:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)BD Sciences5645631:200 in flow cytometry
R428 ケイマンケミカルズ21523AXL チロシンキナーゼ阻害剤
レチノイド酸、オールトランスSigmaR2625光感受性
RIPA 溶解バッファー、10xシグマ20-188ホルモン抽出用
SANT-1シグマS4572SHH 阻害剤
SLC18A1 抗体SigmaHPA0637971:200 ホールマウント免疫蛍光
ソマトスタチン抗体シグマHPA0194721:100 ホールマウント免疫蛍光
STEMdiff 膵臓前駆逐キットSTEMCELL Technologies05120基礎培地とサプリメント
シナプトフィジン抗体NovusNB120-166591:25 ホールマウント免疫蛍光
Triton X-100SigmaX100透過化用
トロロックス シグマミリポア648471ビタミンEアナログ
TrypLE酵素エクスプレスライフテクノロジー12604-021セル継代hPSCsトリ
プシン1/2/3抗体R&D SystemsAF35861:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632STEMCELL Technologies72304ROCK inhibitor
Zinc sulfateSigmaZ0251Medium supplement
のアッセイに使用BD シングル

参考文献

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