ラットモデルにおける結紮糸とリポ多糖の注射 の組み合わせによる 歯周炎の誘発

歯周炎(PD)は、世界で6番目に蔓延している公衆衛生状態であり、総人口の約11%に影響を及ぼし、進行性、不可逆的、破壊的な形態の歯周病です^1,2。PDは、歯肉および歯周組織に影響を与える炎症過程であり、歯肉退縮、ポケット発達を伴う接合部上皮の頂端移動、および歯槽骨の喪失をもたらします³。さらに、PDは、心血管疾患、肥満、糖尿病、関節リウマチなどのいくつかの全身性疾患に関連しており、環境および宿主特異的要因が重要な役割を果たします^4,5。

したがって、PDは、主に微生物群集の嚥下障害に起因する微生物プラークの蓄積と、歯周病原菌に対する誇張された宿主免疫応答によって開始され、歯周組織の破壊につながる多因子性疾患です^4,6。いくつかの歯周病細菌の中で、グラム陰性嫌気性細菌ポルフィロモナス・ジンジバリスは^PD4の重要な病原体の1つです。P. gingivalisは、その壁に複雑なリポ多糖(LPS)を含み、炎症を起こした歯周組織において多形核白血球浸潤および血管拡張を誘導することが知られている分子^である7。これにより、インターロイキン1(IL-1)、IL-6、IL-8、腫瘍壊死因子(TNF)、プロスタグランジンなどの炎症メディエーターが産生され、その後破骨細胞の活性化と骨吸収が行われ、組織破壊と究極の歯の喪失につながります³。

動物モデルのさまざまな利点の中には、人間のように細胞の複雑さを模倣する能力、または限られた細胞タイプのプラスチック表面で実施される in vitro 研究よりも正確である能力が含まれます⁸。 PDをin vivoで実験的にモデル化するために、非ヒト霊長類、イヌ、ブタ、フェレット、ウサギ、マウス、およびラットなどの異なる動物種が使用されてきた⁹。しかし、ラットは安価で取り扱いが容易であるため、PDの病因について最も広く研究されている動物モデル^です10。それらの歯肉組織は、人間の歯肉組織と同様の構造的特徴を持ち、浅い歯肉溝と接合部上皮が歯の表面に付着しています。さらに、ヒトと同様に、接合部上皮は、細菌、異物、および炎症細胞からの滲出液の通過を容易にする ⁹。

ラットにおけるPD誘導の最も報告されている実験モデルの1つは、歯の周りに結紮糸を配置することであり、これは技術的には困難ですが、信頼性があります¹⁰。結紮糸の配置は、歯垢と細菌の蓄積を促進し、歯肉溝に嚥下障害を引き起こし、歯周組織の炎症と破壊を引き起こします¹¹。歯周付着の喪失と歯槽骨の再吸収は、このラットモデル⁸で7日間で発生する可能性があります。

PDの別の動物モデルは、歯肉組織へのLPSの注射からなる。その結果、破骨細胞形成と骨量減少が刺激されます。このモデルの組織病理学的特徴は、炎症誘発性サイトカインのレベルが高く、コラーゲン分解、および歯槽骨吸収を特徴とするヒトが確立したPDに似ています^6,8。

したがって、この研究の目的は、 P.ジンジバリス-LPS(Pg-LPS)注射の技術に基づく実験的PDの単純なラットモデルと、最初の上顎大臼歯(M1)の周りの結紮糸配置を組み合わせることでした。これは、ヒトPD疾患で観察されたものと同様の特性を持つモデルであり、疾患の進行メカニズムと将来の可能な治療法の研究に使用できる可能性があります。

注:この研究の実験プロトコルは、バレアレス諸島健康研究所の動物実験倫理委員会(CEEA-UIB;参照番号163/03/21)によって承認されました。

1.動物の麻酔と手順の準備

1. 手術前に、すべての手術器具(アルミマウスギャグ、デンタルエクスプローラー、ダイヤモンドランス、外科用ハサミ、マイクロサージェリーペンチ、マイクロニードルホルダー、ホレンバックカーバー、骨膜マイクロサージカルエレベーター、マイクロサージカルハサミ)を滅菌します(135°Cで5分)。
2. 説明されているように、無菌状態で手順に必要なすべての溶液を準備します。
   1. リン酸緩衝液(PBS)/生理食塩水で希釈した1.6 mLのケタミンと1 mLのキシラジンを混合することにより、ケタミン(60 mg / mL)とキシラジン(8 mg / mL)の混合物を準備します。ストックは4°Cで保管してください。
   2. アチパメゾールをPBS /生理食塩水で最終濃度0.25 mg / mLに希釈します。.ストックは4°Cで保管してください。
   3. ブプレノルフィンをPBS /生理食塩水で最終濃度0.03 mg / mLに希釈します。.ストックは4°Cで保管してください。
   4. 滅菌生理食塩水中で1 mLの Pg-LPS(1 mg / mL)を準備します。ストックは-20°Cで保管してください。
3. 実験には、12週齢で手術時の体重210〜350 gの雌と雄のWistarラットを使用します。動物を適切な環境と一定の条件(20〜24°C、1日あたり12時間の明暗サイクル)の下でグループで飼育し、食物と標準的な水を 自由に提供します。
4. 麻酔を誘発するには、ラットの体重を量り、25 Gの滅菌皮下注射針と1 mLの注射器を使用して、腹腔内(IP)に80 / 10 mg / kgの濃度でケタミン/キシラジンの混合物を投与します。.
5. ラットに麻酔をかけた後、動物を加熱された手術プラットフォームに仰向けにします。処置中は、熱損失を防ぐために動物の体を覆います。
   注:麻酔の深さは、手順中のペダル反射の喪失とバイタルサインの監視によって評価されます。必要に応じて、小さなノーズコーンを使用して、100%酸素中の2%イソフルランで麻酔を維持します。麻酔導入後に滅菌眼軟膏を両眼に塗布し、角膜を保護し、乾燥を防ぎます。
6. 処置中は、小さなノーズコーンを使用して100%酸素を投与し、パルスオキシメトリによって脈拍数と酸素飽和度を監視します。
   注:酸素飽和度と脈拍数がそれぞれ95%と190 bpmを下回った場合は、手順を中止し、正常値に達するまで動物を外側褥瘡の位置に置きます。
7. 切歯(上下)の周りにアルミニウム製の口ギャグを使用してラットの口を開き、舌を引っ込め、上顎と下顎を開いた快適な作業位置で安定させ、下顎大臼歯へのアクセスを可能にします。
   注:動物を外側褥瘡に入れる必要がある場合は、回復を促進するために位置を変更する前に、口のギャグを外してください。動物に麻酔をかけたら、手術前に歯肉溝液(GCF)を収集します(基礎状態でのサンプル)(0日目)。
8. 以下の手順で説明するように GCF を収集します。
   1. 動物を背中に向けて手術台に置き、上顎と下顎骨をアルミ製の口ギャグで開いた位置に安定させます。
   2. GCFを合計4つ(M1ごとに2つ)の吸収紙ポイントnº30(直径0.03 cmx長さ3 cm)を使用して、M1の中口蓋の周りの歯肉の隙間(歯肉上皮と隣接するエナメル質の間のスペース)にわずかな抵抗があるまで挿入して収集します。用紙ポイントを同じ位置に合計30秒間保持してから、すぐに取り外します。
   3. 回収後、すぐにペーパーポイントをプラスチックバイアルに移し、アッセイ性能が出るまで-80°Cで保存してください。

2.保持結紮法と歯肉内 Pg-LPS 注射

注:結紮モデルは、顕微手術器具を使用して歯肉溝内の両側にM1の周りに滅菌編組絹結紮糸(5/0)を配置し、外科医の結び目で固定することによって作成されました(0日目)口蓋表面。使用された顕微手術器具は、顕微手術ペンチ、マイクロニードルホルダー、ホレンバックカーバー、骨膜顕微手術エレベーター、および顕微手術はさみでした。LED光源を備えた外科用ルーペも使用しました(倍率3.6倍)。

1. 縫合糸の遠位尾部を歯列の口蓋側に配置し、M1と第2上顎大臼歯(M2)の接触の間に近位セグメントを挿入します。
2. 骨膜顕微手術エレベータを使用して、溝内に縫合糸を挿入します。このレベルの組織は付着した歯肉の狭い領域を提示するため、M1の頬面の周りに結紮糸を非常に慎重に巻き付けます。口蓋側では、縫合糸が歯肉溝に打ち込まれるように、両端が締められていることを確認してください。
   注意: M1とM2の間に縫合糸を挿入するときに抵抗が観察された場合は、歯科用エクスプローラーとダイヤモンドランス型のバーを使用して、接点をわずかに開くことができます。
3. 縫合糸の端を外科医の結び目で結び、尾をできるだけ短くトリミングします。溝に結び目を挿入します。
   注意: 手術器具の先端は、口腔外傷や出血を引き起こす可能性があります。ガーゼまたは綿棒の小さな部分を準備して口腔から血液を取り除き、圧力を加えて出血を止めます。顕微手術アプローチによる慎重な軟部組織管理は、外科的合併症を最小限に抑え、組織外傷を少なくします。
4. 結紮糸の位置決め後、25 Gの滅菌皮下注射針と1 mLシリンジを使用して、40 μLの Pg-LPSを滅菌生理食塩水に注入します(歯の根元または首と歯茎の縁の間)M1の中口蓋側(0日目)。

3. 手続きの終了

1. ライゲーションポジショニングと Pg-LPS塗布後、ラットを手術状態から解放し、ヒートランプの下の清潔な個々のケージに入れます。
2. アンタゴニストのアチパメゾール(0.5 mg / kg皮下(SC))に25 Gの滅菌皮下注射針と1 mLの注射器を注射します。.
3. 痛みを和らげるために、0.03 mg / kgのブプレノルフィン、サウスカロライナ州を注射します。
4. 手術の効果が完全に逆転するまで動物の回復を監視します。各ラットを一定の条件(20〜24°C、1日あたり12時間の明暗サイクル)で適切な環境に個別に収容します。食べ物と脱イオン水を 自由に提供します。
5. 処置後の最初の2日間は、動物の体重を量り、痛みを和らげるためにブプレノルフィンSCを1日2回注射します。
   注:ブプレノルフィンは、ワインドアップ効果を排除するために手順を開始する前に投与することができます。
6. 実験期間中、週に1〜2回、体重と一般的な行動評価によって動物を監視します。

4.処置後のフォローアップ

注:PDの誘導は、細菌バイオフィルムの蓄積とその結果としての炎症を促進するために14日間維持されました。結紮糸を検査して調整する必要があり、 Pg-LPSは週に3回注射されます(2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、12日目)。

1. 次のように合字(2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、12日目)を調べて調整します。
   1. 麻酔導入チャンバーを使用して、100%酸素中の2%イソフルランで麻酔します。
   2. ラットを麻酔した後、動物を背中に置き、動物の麻酔を維持するために100%酸素中の1%イソフルランを含む手順中に小さなノーズコーンを使用します。
   3. 切歯(上下)の周りのアルミニウム製の口ギャグを使用してラットの口を開き、舌を引っ込め、上顎骨と下顎骨を開いた快適な作業位置に安定させ、結紮糸にアクセスできるようにします。
   4. 骨膜顕微手術エレベーターを使用して歯肉に対して結紮糸を締め、結紮糸の縫合糸が挿入されていることを確認し、歯肉の周りに炎症を引き起こします。
      注:手術後7〜10日で結紮糸が失われる可能性があります。これが発生した場合は、 Pg-LPSの注入で説明されているプロトコルに従ってください(ステップ2.4)。
2. 結紮糸調整後、M1の中口蓋側の歯肉縁下組織に25 Gの滅菌皮下注射針と1 mLシリンジを使用して40 μLの Pg-LPSを両側に注入します(2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、および12日目)。
3. 麻酔のためにノーズコーンを取り外し、ラットをケージに入れます。麻酔の効果が完全に逆転するまで動物の回復を監視します。

5.動物の犠牲と分析

注:PDの進行を評価するためのさまざまなオプションがあります。ここで説明する分析は、歯肉溝液(GCF)における炎症誘発性サイトカインの評価と、肺胞骨の喪失の評価からなる。

1. 研究の14日目(14日目)に、二酸化炭素チャンバー内で_CO2を有する動物を屠殺する。げっ歯類には、チャンバー容積/分の30%から70%の変位率が推奨されます。.
   注:安楽死を確認するには、ペダル反射に対する動物の反応の欠如とバイタルサインの欠如を確認する必要があります。
2. 以下の手順で説明するように GCF を収集します。
   注:GCFは、PD導入前(手術前)(0日目)およびPD導入後(屠殺後)(14日目)に収集されます。
   1. 動物を背中の外科用プラットフォームに置き、上顎骨と下顎骨をアルミ製の口のギャグで開いた位置に安定させます。
   2. 吸着紙のポイントnº30(直径0.03 cmx長さ3 cm)を使用してGCFを収集し、M1の中口蓋の周りの歯肉の隙間にわずかな抵抗がかかるまで挿入します。用紙ポイントを同じ位置に合計30秒間保持してから、すぐに取り外します。
   3. 回収後、すぐにペーパーポイントをプラスチックバイアルに移し、アッセイ性能が出るまで-80°Cで保存します。
3. GCF内のタンパク質を評価するには、以下の溶液を調製し、説明されている溶出法の手順に従います。
   注:IL-1βは、メーカーのプロトコルに従って、イムノアッセイを使用してGCF(14日目)で評価されます。
   1. 溶出バッファーを新鮮な状態で調製し、抽出プロセス全体を通して氷上に保ち、プロテアーゼ活性を阻害します。
   2. 溶出バッファーに必要なすべての溶液を説明に従って調製します。
      1. 超純水中で1mLのアプロチニン(1mg/mL)を調製します。
      2. メタノール溶液で10 mLのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)(200 mM)を調製します。
      3. 24.5 mLのPBS溶液(pH = 7.4)に125 μLのPMSFと250 μLのアプロチニンを加えて、溶出バッファーを調製します。
   3. 市販のホスファターゼ阻害剤錠剤1錠を新たに調製した溶出バッファー10 mLで4°Cで攪拌下で10分間溶解します。
      注:GCF溶出の持続時間は限られています。最初の30分以内にホスファターゼ阻害剤錠剤を添加した後、遠心分離に直ちに使用してください。.
   4. ホスファターゼ阻害剤を添加した後、11 μLの完全溶出バッファーをペーパーポイントでチューブに直接加えます。
   5. チューブを452 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   6. 溶出した内容物を新しいプラスチックバイアルに移します。このプロセスをさらに4回繰り返して、総容量50 μLにします。
   7. 最後の遠心分離の後、総量60 μLをペーパーポイントに直接加え、最後にもう一度452 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   8. タンパク質評価に必要な量の溶出液を使用してください。
4. 安楽死とGCF収集の後、外科用ハサミの助けを借りて、ラットの上顎を切り取ります。ラットのマスクをはがし、できるだけ柔らかい組織を残さないようにしてください。
5. 顎を顕微鏡ステージに配置して視覚化し、希望の倍率で写真を撮ります。
6. PBSで希釈した4%パラホルムアルデヒド(PFA)にジョーを直接入れます。完全に固定するために、新しいPFAで週に2回12日間リフレッシュします。
   注意: PFAを含む手順は、安全データシートの推奨事項に従って、ドラフトで実行する必要があります。
7. 顎を完全に固定した後、次のようにコーンビームコンピューター断層撮影(CBCT)スキャナーを使用して骨量減少を評価します。
   1. PCを開きます。
   2. CBCT分析プログラムを開きます。
   3. 義歯スキャンモード>スキャンプロトコルを選択します。
   4. 視野 (FOV) > (11x8) HIR (90 kV の電圧と 3 mA の電流) を選択します。
   5. ラットの固定上顎をガントリーに入れます。
   6. [ 次へ] をクリックします。
   7. X線 発射ボタンをクリックします(X線 リモコンを押して放出を行い、スキャン中ずっと押し続けます)。
   8. 必要に応じて、コントロールボタンを押して上顎骨を前頭面の中央に移動し、X線 発射ボタンをクリックします(X線 リモコンを押して発光させ、スキャンの全期間押し続けます)。
   9. [ 次へ] をクリックします。
   10. X線 発射ボタンをクリックします(X線 リモコンを押して放出を行い、スキャン中ずっと押し続けます)。
   11. 必要に応じて、コントロールボタンを押して義歯を矢状面の中央に移動し、X線 発射ボタンをクリックします(X線 リモコンを押して放出を行い、スキャンの全期間押し続けます)。
   12. [ 次へ] をクリックします。
   13. [スタート]ボタンをクリックします(X線リモコンを押して発光させ、試験中ずっと押し続けます)。処理メッセージを受信するまで待ってから、表示される指示に従います。
   14. ウィンドウビューが表示されます。グレーを65%に調整し、[ 適用]をクリックします。
   15. スキャンを保存するには、[ ファイル ]をクリックしてDICOM形式で保存します。次に、[すべての画像]をクリックし、[DICOMエクスポート選択]ウィンドウで、表示されているすべてのパラメーター(初期 画像 、元の軸、再フォーマットされた軸、多平面)を選択し、事前定義されたタイプを選択します。
8. 上顎大臼歯の2次元および矢状代表画像を、次のように解析プログラムを使用して処理します。
   1. ソフトウェアを開きます。
   2. [ファイル] をクリックして [開く] をクリックし、DICOM 形式の画像を含むフォルダーを選択して [開く] をクリックします。
   3. 「8ビットに変換」ウィンドウが表示されるまで待ち、0〜6,000の範囲を選択して、[ OK]をクリックします。
   4. [ 未加工画像] をクリックします。
   5. 選択範囲の上部と下部を定義して、関心領域を制限します。歯槽骨が表示される最初と最後の画像を検索し、 選択範囲の上部 と 下部 の選択コマンドで選択します。
      注:大臼歯の歯槽骨の代表的な2次元画像は、 図3A、Bのようにエクスポートできます。
   6. 矢状を表す画像については、 プロファイルバーの切り替えをクリックします。
   7. 口蓋の中央に矢状線を描き、[ モデルの再スライス]をクリックします。関心領域を区切るためのパラメータ(スライス間隔:1、スライス数:100)を決定し、「 OK」をクリックします。スライスモデルが終了するまで待ちます。最後に、[ スライスされた画像の保存]をクリックします。
      注:図3C、Dのように、大臼歯の歯槽骨の代表的な矢状想像をエクスポートできます。

実験ステップのタイムラインを 図1に示します。 図2A は、実験の時間0におけるM1の溝の周囲に結紮糸を配置した、外科的介入後の下顎骨の画像を示す。 図2B は、処置の14日後、M1の周りの結紮糸が歯肉溝に入り、歯肉の炎症を引き起こし、浸潤蓄積を引き起こす方法を示しています。

図1:ラットにおける歯周炎(PD)誘発の実験手順のタイムラインの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

代表的な二次元画像(図3;赤四角)は、基底対照の間の下顎骨の歯槽骨量減少の違いを示し、より多くの骨体積を示し(図3A)、PD確立後、より高い歯槽骨量減少を示しています(図3B)。さらに、矢状画像の分析により、PD確立後のM1(図3D;赤矢印)およびM2(図3D;緑矢印)の歯根間骨領域における歯槽骨量の減少が、基底対照群(図3C)と比較して大きいことが強調されています。また,歯槽骨吸収はセメントエナメル接合部(CEJ)と歯槽骨稜(ABC)の間の空間の増加を特徴としていた。両ラット群におけるCEJとABCの間の距離を図3C,Dに青色矢印で示す。確立されたPDは、基礎対照(図3C)と比較して、CEJとABC(図3D)の間に大きなスペースを発達させた。

犠牲の瞬間、口蓋の画像は、異なるグループのM1の歯肉退縮の違いを示しました(図4A、B)。PD群(図4B)は、基底対照群(図4A)と比較して、骨支持の喪失および根の露出により、より大きな頂端歯肉の移動を示す。また、PD群(図4B)は、基底対照群(図4A)と比較して、上顎大臼歯周辺の歯肉の炎症が大きかった。 図4C は、GCF由来の炎症誘発性サイトカインIL-1βの分析結果を示し、対照群と比較してPD群に表示されたIL-1βの有意に高い放出を示す。文献によると、IL-1βは歯周炎における炎症、免疫調節、および骨吸収に関与し、歯周組織破壊の強力な刺激因子である12。

図2:異なる時間にM1の溝に挿入された結紮糸の画像。 (A)M1の周りに結紮糸が配置されたラット口蓋、結紮糸挿入後0日。(B)M1の周りに結紮糸を配置したラット口蓋、結紮糸の挿入から14日後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:歯槽骨と上顎大臼歯の代表的な二次元画像。 (A)基底コントロールの上顎大臼歯の歯槽骨(赤四角)、および(B)結紮糸挿入および Pg-LPS注入による14日間の定着性歯周炎(PD)のCBCTにより得られた代表的な二次元写真。(C)基底制御および(D)PDの上顎大臼歯の代表的な矢状二次元図。赤矢印はM1の根間歯槽骨面積、青矢印はCEJとABCの距離、緑矢印はM2の根間歯槽骨面積を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:口蓋の代表的な画像。 (A)基礎対照群及び(B)歯周炎(PD)群の屠殺後の口蓋を、結紮糸挿入及び Pg-LPS注射で14日間処置した後の代表的な画像。(c)基礎対照群及びPD群のGCFにおけるIL-1β濃度の測定(n=9)。±結果はクラスカル-ウォリスによって統計的に比較された:* p < 0.05 PD群対基礎対照群。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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