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方法論記事

ゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株のスフェロイドの3D培養法

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DOI：

10.3791/64859

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2023年1月20日

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1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Cell Biology, Federal University of Paraná (UFPR), 4Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

この記事について

サマリー

ここでは、2つのゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)細胞株、ZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)のスフェロイドを形成するための効果的で簡単かつ高速な3D培養プロトコルを紹介します。

要約

魚細胞株は、生態毒性評価のための 有望なin vitro モデルです。しかしながら、従来の単層培養系(2D培養)には周知の制限(例えば、培養寿命およびいくつかの in vivo 細胞機能の維持)がある。したがって、スフェロイドなどの3D培養物が提案されており、これらのモデルは組織様構造を再現できるため、 in vivo 条件をよりよく再キャプチャできます。この記事では、2つのゼブラフィッシュ(Danio rerio)細胞株であるZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)を使用してスフェロイドを形成するための効果的、簡単、高速の3D培養プロトコルについて説明します。このプロトコルは、丸底の超低アタッチメント96ウェルプレートに細胞をプレーティングすることで構成されています。軌道振盪(70rpm)下で5日後、ウェル当たり単一のスフェロイドが形成される。形成されたスフェロイドは安定したサイズと形状を示し、この方法はウェル内で複数のスフェロイドが形成されるのを回避します。したがって、同様のサイズのスフェロイドを手で選ぶ必要はありません。このスフェロイド法の容易さ、速度、再現性により、ハイスループット のin vitro 試験に役立ちます。

概要

スフェロイドは、細胞を3D培養で細胞間密接な接触で培養するときに形成される細胞の小さな球体です。インビボ組織環境を模倣するスフェロイドの能力は、様々な細胞株および初代細胞において既に研究されている1,2。しかし、スフェロイドは哺乳類毒性試験用に十分に開発されていますが、非哺乳類脊椎動物(魚類など)での毒性試験用のスフェロイドの開発はまだ進行中です3。魚類細胞株の場合、スフェロイドは、異なるタイプのウェルプレート3、4、5、6、7を用いた軌道振動(OS)や、磁性ナノ粒子8を用いた磁気浮上法など、さまざまな方法で開発されてきました。ただし、スフェロイドのこれらの培養方法のいくつかは、他の方法よりも不利な点がある可能性があります。

例えば、大型マイクロプレート(24ウェルプレート)での旋回法では、サイズと形状が異なる多数のスフェロイドが生成される可能性があります。実際、多重スフェロイド構造形成が実証されている7。これには、実験のために同じサイズと形状の回転楕円体を厳選するための多大な努力が必要です。ハンギングドロップ3D培養法は、哺乳類細胞株1,2,9,10,11のスフェロイドを生成するために一般的に使用され、それによって、ドロップあたり単一のスフェロイドを生成することができ、上記の問題を回避することができる。しかしながら、修正されたハンギングドロップ法(ハンギングドロップ+軌道振動)は、安価な方法を用いてZFLスフェロイドを生成することができるが、欠点がある12。形成された細胞凝集体は、滴内で長期間維持することはできません。したがって、それらはウェルプレートに移される必要があります。このプロセスは、マイクロピペット12を用いて滴下して行われるため、層流フード内での激しい取り扱いおよび長時間の作業を必要とする。また、この方法では、ZFLスフェロイドを完全に形成するのに10日(ハンギングドロップで5日+OSで5日)12を要します。これらの欠点は、特に化学物質の優先順位付けと製品の持続可能性のための潜在的なアプリケーションを考慮すると、毒性試験のための3D魚スフェロイドの適用を制限する可能性があります。

したがって、この記事では、96ウェルの超低接着プレート(ULAプレート)とオービタルシェーカー(回転直径22 mm)の併用に基づいて、ZFL(D.レリオ 正常肝細胞)およびZEM2S(D.レリオ 胞胚期胚)細胞株の単一スフェロイドを生成できる3D培養プロトコルについて説明します。適用された方法は簡単で再現性があり、短期間(5日間)で同様のサイズと形状のスフェロイドを大量に生成できます。この方法の利点は、産業界と学界の両方での水生毒性研究への魚の3Dモデルの適用、および生態毒性試験の代替方法の実装の進歩をサポートすることができます。

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プロトコル

丸底96ウェルプレートでZFLおよびZEM2S細胞株の3Dスフェロイドを生成するための重要なステップを 図1に示します。

注:このプロトコルで使用されるすべての材料に関連する詳細については、 材料の 表を、このプロトコルで使用される溶液と培地については 表1 を参照してください。

1. 細胞培養培地および単層培養

  1. 両方の細胞株(ZFL、ZEM2S)をCO2を含まない28°Cのインキュベーターで単層として増殖させ、~80%のコンフルエントに達したら継代培養比1:3で継代培養します。
    1. ゼブラフィッシュ細胞のT75フラスコを~80%のコンフルエントで開始し、上記のように培養する。
    2. 完全な培地を除去し、ピペットを使用して培養フラスコに1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(0.01 M)を加えて細胞を洗浄します。
    3. ピペットを使用して、1 mLの1xトリプシン-0.5 mM EDTA(0.05% [v/v])を培養フラスコに加え、28°Cで3分間インキュベートしてフラスコから細胞を剥離します。
    4. フラスコを軽くたたいて細胞を放出し、3 mLの完全培養培地をフラスコに加えてトリプシン消化を停止します。
    5. ピペットを使用して、細胞懸濁液を15 mLのコニカル遠沈管に移し、100 × g で5分間遠心分離します。
    6. ペレット形成後、上清を注意深く除去し、使用中の各細胞株(ZFLまたはZEM2S)の完全培地を1 mL加え、マイクロピペットを使用して再懸濁します。細胞カウントのためにアリコートを取ります。

2.トリパンブルー色素排除試験による細胞カウント

  1. 10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルー色素をマイクロチューブに加え、細胞をカウントし、生存率を評価します。ピペットを使用して細胞懸濁液と染料を混合します。
  2. 次に、この混合物(細胞懸濁液+トリパンブルー)10 μLをノイバウアーチャンバーに移し、トリパンブルーを取り込まない細胞を生菌と見なして、チャンバーの角に配置された4つの大きな正方形(象限:Q)の細胞をカウントします。式 (1) を使用して生細胞数を計算します。
    figure-protocol-1(1)
  3. 細胞懸濁液中の最終細胞数を計算するには、式(1)を用いて求めた細胞数に2(トリパンブルーの使用による希釈倍率)を乗じる。
    注:あるいは、自動細胞計数システムを使用することもできます。

3. ULAプレートのセルプレーティング

  1. 細胞数を計算した後、以下に示すように、96ウェル丸底ULAプレートのウェルあたり200 μLのこの懸濁液を各細胞株に必要な細胞数でプレートするように細胞懸濁液を調整します。
    1. 7,000個の生存可能な ZFL 細胞/ウェルをプレート化します。したがって、ULAプレート全体に対して、20 mLの完全な培地で700,000細胞を使用します。
    2. 3,500個の生存可能な ZEM2S 細胞/ウェルをプレート化します。したがって、ULAプレート全体に対して、20 mLの完全培地で350,000細胞を使用します。
  2. 培地リザーバー内の細胞濃度を調整した細胞懸濁液を調製し、泡や泡を形成しないように注意しながら、マルチチャンネルマイクロピペットを使用して混合します。マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、調整した細胞懸濁液をULAプレートの各ウェルに200 μL加えます。
    注:プレートは、96ウェルプレートからの培地の蒸発を防ぐために、パラフィルムまたは接着剤シーリングフォイルでシールする必要があります。

4.回転楕円体形成

  1. ULAプレートをオービタルシェーカーで70rpmで28°Cのインキュベーター内で5日間インキュベートします。スフェロイドを5日間の軌道振盪で形成し(図2)、直径~225 μm(ZFLスフェロイド)および直径~226 μm(ZEM2Sスフェロイド)の平均サイズに達します12。
    注:5日間のインキュベーション(最大円形度)後、スフェロイドを使用する準備が整います。
  2. スフェロイドを培養中に5日以上維持するには、5日ごとに100 μLの使用済み培地を除去し、マルチチャンネルマイクロピペットを使用して100 μLの新鮮な完全培養培地を追加します。
    注意: このプロセス中は、回転楕円体を吸引しないように注意してください。

5. 回転楕円体のサイズ(直径)と形状(円形度指数)の測定

  1. 画像を取得します。
    1. イメージングキャプチャシステムを備えた倒立光学顕微鏡の下で、定義されたスケールの画像を取得します。
      注意: 顕微鏡ステージキャリブレーションスライドまたはノイバウアースライド(象限サイズがわかっている)を使用して、スケールを取得します。
    2. 顕微鏡下で、スケールの画像を取得するために使用したのと同じ対物レンズを使用して、完全に形成されたスフェロイド(すなわち、5日齢のスフェロイド)の画像を取得します。
      注:スフェロイドのサイズと形状を決定するには画像の解像度が重要であり、システムの種類によって異なる可能性があるため、すべての画像は同じイメージングキャプチャシステムを使用して撮影する必要があります。
  2. 縮尺を設定します。
    1. ImageJソフトウェアを使用して、定義したスケールの画像を開きます( [ファイル]、[開く]の順にクリックします)。
    2. ツールバーから 直線セレクター を選択し、マウスを使用して、画像内の定義された縮尺の延長を横切る線をドラッグします。
    3. [ 分析 |縮尺を設定し、[ 縮尺の設定] ウィンドウが開くのを待ちます。
    4. [ スケールの設定] ウィンドウで、[既知の距離]の空白に、直線に対応する 既知の距離 (μm)を入力します。長さの 単位 にμmの um を入力します 。 OK をクリックします。
      メモ: ピクセル/μm単位のスケールは、ウィンドウの下部に表示されます。
  3. 測定パラメータを設定します。
    1. ImageJ ソフトウェアで、[ 分析 |[測定値の設定 ] をクリックして、[ 測定値の設定 ] ウィンドウを開きます。
    2. [測定値 の設定 ]ウィンドウで、目的の測定値のボックス( つまり、面積 記述子と 形状 記述子)を選択します。 OK をクリックします。
  4. 回転楕円体の直径と真円度を取得します。
    1. 回転楕円体の画像を開く (ファイル |開く)。
    2. ツールバーで フリーハンド選択ツール を選択し、マウスを使用して回転楕円体の外側を選択します( 図3Aを参照)。
      メモ: 画像をズームインまたはズームアウトするには、Ctrl キーを押しながらマウスを使用して上下にスクロールするか、 Ctrl キーを押しながらキーボードの上矢印キーまたは下矢印キーを使用します。
    3. [ 分析] を選択します。 |[測定] : [結果 ] ウィンドウが開き、測定値が表示されます。
    4. 面積の値を使用して、式 (2) を使用して回転楕円体のサイズ (直径) を計算します。
      figure-protocol-2(2)
    5. 円形度指数は、結果ウィンドウに「円形」として与えられ、式 (3) を使用してソフトウェアによって自動的に計算されます。
      figure-protocol-3(3)
      注: 真円度指数 1.0 は完全な回転楕円体形状を表し、0.0 に近い値は細長い形状13 を示します。

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結果

安定したサイズおよび形状を有するウェル当たり単一のスフェロイドがこの方法によって形成される。図2は、軌道振とう(70rpm)下でのULAプレートのウェルにおけるZFLおよびZEM2S細胞の単一スフェロイドの形成過程を示す。ZFL細胞株とZEM2S細胞株は、3D培養において異なる挙動を示します。ZEM2S細胞株は、眼窩振盪の初日からスフェロイド形状を容易に形成する能力を付与する特徴を示しますが(図2E)、ZFL細胞株は望ましいスフェロイド形状に到達するまでに5日かかります(図2A-C)。この方法で生成されたスフェロイドは、図2D(16日齢のZFLスフェロイド)および図2H(10日齢のZF2Sスフェロイド)に示すように、より長い培養期間(期間>5日)でも形状の点で安定性を示...

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ディスカッション

これは、ゼブラフィッシュの肝臓および胚細胞株のスフェロイドを生成するための簡単、簡単、かつ迅速な方法です。この方法は、スフェロイド形成に関連する科学的研究で報告された問題、および3Dスフェロイドアッセイからのデータ精度の不確実性を克服するために、既存の3Dスフェロイド法の修正に基づいてこのグループによって開発されました。例えば、報告された問題は、取り扱いの難しさ、スフェロイドを生成するのに時間がかかる性質、アッセイを実行するために同様のサイズと形状のスフェロイドを選択する必要性、およびハンギングドロップ法でスフェロイドをドロップからマイクロプレートに移すプロセスの困難さにあります3,7,12。さらに、このプロトコルは、CO2フリー条件でのZFLおよびZEM2S細胞株の培養を推奨する。両方の細胞株についてこのプロトコルで提案されている培地組成およびCO2フリー環境は、文献において広く報告されている。ZFL細胞株...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この作品の共著者であり、化粧品の分野で優れた研究者であり、ブラジルでの化粧品研究の促進に専念しているマルシオ・ロレンチーニ博士を記念して。著者らは、生理学部(UFPR)のマルチユーザーラボに、機器の入手可能性と、高等教育要員の改善のための調整(CAPES、ブラジル)(財務コード001)およびGrupo Boticárioの財政的支援に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96 ウェル クリア丸底超低アタッチメントマイクロプレート、個別包装、蓋付き、滅菌Corning7007
DMEM、粉末、高グルコース、ピルビン酸Gibco12800-017
ハムの F-12 栄養ミックス、粉末Gibco21700026
HEPES (1M)Gibco15630080
Java での画像処理と分析 (ImageJ) 1.52pソフトウェア National
Institutes of Health, USA		入手可能な場所: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, powderGibco41300021
Orbital shaker WarmnestKLD-350-BI回転直径 22 mm
ダルベッコ PBS (10x) とカルシウムおよびマグネシウムInvitrogen14080055
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Gibco15140122
RPMI 1640 ミディアムGibco31800-014
FBS - ウシ胎児血清、認定、USDA 承認地域Gibco12657-029
重曹、粉末、  分子生物学用バイオ試薬Sigma-AldrichS5761
トリパンブルーステイン (0.4%)Gibco15250-061
トリプシン-EDTA (0.5%)、フェノールレッドなしGibco15400054
ZEM2S 細胞株ATCCCRL-2147この細胞株は、Michael J.
Carvan 教授 (ウィスコンシン大学、Milwaukee, USA)
ZFL細胞株BCRJ256

参考文献

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