結晶性シリカダストの反復吸入による珪肺症マウスモデル

労働者は必然的に不規則な結晶性シリカ粉塵(CSD)にさらされ、吸入する可能性があり、鉱業、陶器、ガラス、石英加工^{、コンクリート1,2}など、多くの職業状況でより有毒です。珪肺症として知られる慢性的な粉塵吸入状態は、進行性の肺線^{維症を引き起こし}ます3。疫学データによると、珪肺症の発生率は過去数十年にわたって世界的に減少していますが、近年、増加しており、若年層に影響を与えています^4,5,6。珪肺症の根本的なメカニズムは、その潜行性の発症と長期の潜伏期間のために、科学研究にとって重要な課題を提示します。珪肺症がどのように発症するかはまだ不明です。さらに、現在の薬では、珪肺症の進行を止めたり、肺線維症を逆転させたりすることはできません。

現在の珪肺症のマウスモデルでは、CSDの混合懸濁液を気管から摂取します。例えば、麻酔後に頸部気管外傷を採用してCSDを肺に投与することは、染料粉塵へのヒトの反復暴露には従わない⁷。周囲の粉塵への曝露が個人に与える影響は、この有毒物質の環境濃度をより正確に反映するエアロゾルの形でCSDに曝露することによって研究できます⁸。しかし、環境CSDは、マウスの鼻の特異な生理学的構造のために、単純に直接肺に吸入することはできない⁹。さらに、この技術に関連する機器は高価であるため、研究者はマウスの珪肺症モデル¹⁰を再評価しています。2週間以内に5回点鼻薬でCSD懸濁液を吸入することで、珪肺症の動的モデルを構築することができました。このモデルは、使いやすく、一貫性があり、安全です。この研究により、マウスでCSDの反復吸入が可能であることに注意することが重要です。この手順で作成されたマウス珪肺症モデルは、研究要件に対してより有益であることが期待されます。

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド(NIH Publication No. 8023、1978年改訂)のガイドラインに従い、安徽科技大学医学部の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. マウスの管理と給餌

1. 20匹の健康なC57BL/6雄マウスを実験群またはビヒクル群に1:1の比率で割り当てます。マウスを新しい環境に1週間順応させます。
2. 1日あたり12時間の一定の光時間を提供します。正確なタイミングのために時間制御スイッチを使用してください。

2. CSD懸濁液の準備

1. 点鼻剤が垂れる少なくとも1日前に、瑪瑙乳鉢でシリカを0.5時間粉砕します。
2. 結晶粒子の大きさと形を観察します。走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して代表的な写真を撮影します。
   1. 導電性テープを使用して粒子を結合し、SEM用のサンプルを準備します。 ヘアドライヤーを使用して、しっかりと接着されていないシリコン粒子をそっと吹き飛ばします。
   2. サンプルチャンバーを排気し、高圧をオンにして、画像をキャプチャします。
      注:レンズとサンプル間の作動距離(WD)は5.9mm、加速電圧は2.0kV、倍率(Mag)は100,000倍です。粒子は不規則な結晶化で分散しており、約80%の直径は1〜5μmです(図1A)。
3. 20 mg/mLの滅菌CSD懸濁液を作製します。CSDを滅菌生理食塩水で希釈し、超音波振とう機(40kHz、80W)で室温(RT)で30分間混合します。
4. 点鼻薬を投与する前に、CSD懸 ?? 液をボルテックスミキサーで10秒間完全に攪拌および混合します。.

3. マウスへの点鼻薬の投与

1. 麻酔器で2%イソフルランを3.6 mL/hの用量でマウスに迅速に麻酔します(図1B、左パネル)。
   注意: 麻酔は、技術者による麻酔薬の吸入を避けるために、ドラフト内で行う必要があります。.マウスの急速で不規則な呼吸からゆっくりとした定常状態への変化を観察して、麻酔の深さが適切であることを確認します。
2. 4〜8秒以内に50μLのCSDを鼻腔に滴下します(図1B、右)。
   1. 点鼻薬は、人差し指の先でマウスの頭を研究者の中手指節関節に当てます。
   2. マウスをうつ伏せにしたまま、4本の指を少し曲げ、親指の先をマウスの下唇に軽く触れて気道をまっすぐにします。咽頭に触れて咽頭反射を誘発しないようにします。
   3. 200 μlのピペットを使用して50 μlの液体を吸引します。マウスの呼吸数に応じて、3〜4回に分けて液体をマウスの鼻腔に滴下します。.各点滴は、15〜20μlの液体で構成する必要があります。.点滴は3日に1回、12日以内に5回投与します。コントロールマウスを等量の生理食塩水で処理します。
3. マウスの心臓部分を5x〜10x5秒間優しくマッサージします。
   1. 手のひらでネズミの体を持ち、親指と人差し指で首の後ろの皮膚をつまみ、他の指でネズミの後肢を固定します。次に、もう一方の手の人差し指でマウスの心臓の鼓動領域を5秒間に5〜10回そっと押します。
4. マウスの呼吸が安定したら、温熱パッド付きの回復ケージに入れ、麻酔から回復するまで観察してから、マウスをホームケージに戻します。31日でマウスを犠牲にします。

4.肺組織を採取し、パラフィン切片を作製する

1. 0.18 mLの10%抱水クロラールを腹腔内に注入し、マウスがつま先または尾の刺激に反応しないようにします(歯付き鉗子を使用して実施)。次に、次の手順に進みます。
2. マウスの手足を発泡スチロールテストボードに固定し、75%アルコールをスプレーして毛皮を湿らせます。鎖骨の正中線にある胸部肋骨の大部分を取り除き、マウスの胸腔を開いて心臓と肺を露出させます。
3. すぐに眼科手術用ハサミで右心房を切り開き、左心房拍動時に心臓先端から20 mLのリン酸緩衝液(PBS)を最大振幅でゆっくりと注入し、全血を流します。次に、右肺の下葉を切除し、-80°Cで保存してウェスタンブロッティング分析を行います。
4. PBS注入後、同じ部位に10 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を灌流し続けます。残りの肺を採取し、病理学的分析のためにサンプルを 30 mL の 4% PFA に保存します。
5. 72時間固定後、標本をパラフィンに包埋します。
   1. 脱イオン水(60%、70%、80%、90%、100%)に段階的に希釈した一連のエタノール(EtOH)で組織を室温でそれぞれ1時間脱水し、キシレンを2回ずつ洗浄してサンプルを1時間ずつ除去します。
   2. 溶融したパラフィンワックスを50°Cで2時間加熱してサンプルに浸透させます。このプロセスを別のシリンダーで繰り返します。ワックス型をティッシュで1時間冷やして固めます。
   3. ワックスが硬化し、組織が包埋されたら、パラフィン切片化機を使用して組織を5μmでスライスします。正確な切片作成およびスライド取り付け手順については、以前に説明した¹¹。
      注:十分な組織灌流は、10 mLの4%PFAを受け取った後、筋肉のけいれんと尾のねじれを「S」字型または屈曲に発達させることによって示されます。.

5. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色の実施

1. パラフィン包埋組織をホットプレート(60°C)で4時間以上加熱し、スライドへの接着と脱パラフィンの改善を可能にします。
2. パラフィン切片を脱ワックスして水和させます。スライドにサンプルをキシレンに2回、毎回30分間浸します。次に、それらを無水エタノールに浸し、次に95%、85%、75%アルコール、および脱イオン水にそれぞれ5分間浸します。
3. ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行います。ヘマトキシリン染色バケツで組織を10分間染色します。やさしく流水で5分間洗い流します。次に、スライドをエオシン染色バケツに10秒間浸します。
4. サンプルを75%、85%、95%、および無水エタノールでそれぞれ5分間脱水します。組織切片をキシレンに5分間浸してきれいにします。約60μLの中性レジン滴で切片を密封します。カバースライドをセクションの上に置き、気泡を避けるために慎重に下げます。

6. マッソン染色の実施

1. ステップ5.2で説明したように、パラフィンサンプルを脱ワックスして水和します。次に、細胞核を50%ワイゲルトヘマトキシリンで10分間染色します。組織を酸性エタノール液化に10秒間浸し、流水で組織スライドを静かにすすぎ、核の青化を行います。
   注:使用直前にWeigertのヘマトキシリン染色液を調製してください。
2. サンプルをLichun red染色液(各組織スライドに40 μL)の滴で7分間染色し、弱酸性作業溶液(30%塩酸)で1分間洗浄して、結合していないLichun赤色色素を除去します。
3. それらを95%アルコールに20秒間浸し、無水エタノールでそれぞれ1〜3秒間2回脱水します。その後、手順5.4で説明したように、組織をキシレンで除去し、60 μLの中性樹脂滴で密封します。

7. シリウスレッド染色を行う

1. ステップ5.2で説明したように、パラフィンセクションを脱ワックスして水和させます。
2. 切片にシリウスレッド染色液を1時間浸潤させます。
3. サンプルの細胞核をMayerヘマトキシリン染色溶液で8〜10分間染色します。流水で10分間やさしくすすいでください。次に、脱水してティッシュスライドを取り除きます。ステップ5.4で説明したようにそれらを密封します。

8. 免疫組織化学の実施

1. ステップ5.2の説明に従ってパラフィンサンプルを脱ワックスし、水和させます。
2. 約30 mLの3 mg/mLのEDTA抗原賦活化溶液で検体を浸潤させます。20〜30分間沸騰させます。組織を脱イオン水で洗浄し、0.5% Tween-20(PBST)を含むリン酸緩衝液中で5分間インキュベートします。
3. サンプルを0.3%過酸化水素溶液に15分間浸し、検体中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化します。毎回PBSTで5分間3回洗います。
   注意: 0.3%過酸化水素溶液は、遮光環境で新鮮にする必要があります。
4. 0.3% Triton-100溶液で15分間、試料のメンブレンを透過処理します。次に、30〜40μLの5%ウシ血清アルブミン(BSA)で1時間ブロックします。
5. ブロッキング溶液を取り除きます。希釈した一次抗体NF-κB(希釈率1:200)およびCD68(希釈率1:1,000)を添加し、顕微鏡スライドIHCウェットボックス内で2〜8°Cで一晩インキュベートして、蒸発と光を防ぎます。
6. 翌日、RTに1時間移します。次に、PBSTで3回、それぞれ5分間洗浄します。
7. サンプルをウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(希釈比1:500)中で1時間、室温でインキュベートし、PBSTで3回ずつ5分間洗浄します。
   注:一次抗体と二次抗体の両方を5%BSAで希釈しました。
8. 酵素標識抗体に対応する3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)基質とサンプルを5〜20分間インキュベートします。最適な染色強度に達したら、脱イオン水との反応を停止します。
   注意: DAB溶液は新たに調製し、光から保護する必要があります。発色反応を顕微鏡でリアルタイムに観察し、染色を止めるタイミングを決定する必要があります。陽性の標本は強い染色を示しますが、陰性の標本は発色しません。
9. サンプルをワイゲルトヘマトキシリンで30秒間対比染色します。次に、流水で組織を1分間すすぎます。次に、ステップ5.4で述べたように、組織スライドを脱水し、透明化し、密封します。

9. ウェスタンブロッティング分析の実施

1. 肺組織を溶解してタンパク質を抽出します。200 μL の RIPA ワーキング溶液を 20 mg の肺組織に加えます。
2. ハンドヘルド電動グラインダーを使用して氷上で組織を5分間均質化し、穏やかに振とうしながら氷上で1時間インキュベートします。その後、ホモジネートを 4 °C で 15 分間、14,800 x g で遠心分離します。
3. 上清を採取し、BCAタンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を測定します。RIPAで6 μg/μLのタンパク質保存溶液を作製します。80 μLのプロテインライセートに20 μLの5xローディングバッファーを加えます。タンパク質含有微量遠心チューブを金属浴(100°C)で20分間加熱することにより、二次タンパク質構造を破壊します。
4. 冷却後、タンパク質保存溶液100 μLを各チューブに分注し、サンプルを-80°Cの冷蔵庫で保存します。電気泳動の前に、タンパク質濃度を1倍ローディングバッファーで2–3 μg/μLに希釈します。
   注:タンパク質抽出プロセスは氷上で実行する必要があります。RIPAワーキング溶液の場合、100 mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)1 μLを99 μLのRIPAに添加して、リン酸化タンパク質の分解を阻害します。 5倍のローディングバッファーをRIPAで1:4の比率で希釈して、1xローディングバッファーを調製します。
5. 各ウェルに 20 μg のサンプルを添加し、ゲルを泳動します。5%濃縮ゲルの場合、80 Vで20分間使用して、同じ開始点からタンパク質を電気泳動します。10%単離ゲルの場合、100 Vで1時間泳動して、分子量の異なるタンパク質を可能な限り分離します。
6. PVDFメンブレンをメタノールで20秒間予備活性化します。400mAの電流で1〜2時間湿式転写法を使用して、タンパク質をPVDFメンブレンに転写します。
   注:電気泳動タンクと電解転写タンクが水平であることを確認してください。メンブレン転写プロセスは多くの熱を発生するため、タンク全体を氷で冷却します。
7. メンブレンをTBST溶液で毎回5分間、5回洗浄します。次に、5%BSAまたは5%スキムミルクで1時間ブロックします。一次抗体NF-κB(1:1,000)およびβ-アクチン(1:1,000)を5%BSAで希釈します。ストリップを抗体溶液に浸し、2〜8°Cで一晩静かに振とうします。
8. ストリップをPBSTで洗浄します。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:10,000)を希釈し、希釈した二次抗体中で室温で1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
9. 増強化学発光(ECL)現像液を調製し、ストリップ上に滴下し、3分間インキュベートします。
10. ストリップをゲルイメージャーに20秒間さらします。ストリップのグレー値を測定して、システムソフトウェアでタンパク質レベルを評価します。β-アクチンを内部統制として使用する。

マウスにおける珪肺症の潜在的な病因は、提案された方法を使用して調査されました。その結果、実験群のマウスの体重は対照群に比べて有意に減少し、曝露中止後の体重の回復が遅いことが分かりました。ここで使用した用量が最適化されているため、この実験ではシリカに曝露したマウスでは死亡率は観察されませんでした。CSDへの反復点鼻漏の技術的ロードマップを(図1)に示します。前述の手順には、CSD懸濁液の準備、イソフルラン誘発麻酔、点鼻薬、および胸部マッサージが含まれていました12。コラーゲン沈着と筋線維芽細胞の分化を4週間の静的摂食後に実証した12。私たちは、この粉塵曝露法を用いて、石炭粉塵によって引き起こされる肺線維症の根本的なメカニズムを研究しています。マクロファージの新しいサブセットとビタミンDの介入効果は、シングルセルトランスクリプトーム技術によって発見されました13。本研究では、気管支末梢弾性線維の損傷を引き起こすCSDへの曝露により、マウスの肺線維症の進行が有意に加速されました(図2および図3)。珪肺症結節は、CSDを含むマクロファージで構成されています。結節性線維症には多くのCSDが豊富に含まれており、CD68陽性マクロファージはこれらの粒子を活発に飲み込んでいます。これらの沈着したCSDは、線維性病巣の形成を促進します。前述したように、CSDに4週間曝露した後、マウスはシリコン肺結節へのコラーゲン沈着や肺組織構造の損傷などの明らかな病変を獲得しました。また、気管支12の周囲の組織にも軽度の損傷があった。CSDによって引き起こされる小胞体ストレスの生物学的プロセスは、炎症反応に関与するNF-κBに関連しています(図4を参照)。全体として、これらの知見は、提案されたアプローチがマウスの珪肺症の発症を効果的にシミュレートできることを示しています。

図1:5ミクロン未満の結晶性シリカダスト(CSD)粒子を点鼻薬に使用しました。 (A)CSDの走査型電子顕微鏡(SEM)では、粒子が不規則な形状をしていることが分かりました。(B)CSD懸濁液を用いて、点鼻薬によるマウス珪肺症モデルを調製した。左のマシンはイソフルラン麻酔に使用され、右のパネルは点鼻効果につながる重要なポイントを概説しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:シリウスレッド染色は、1ヶ月間の点鼻CSDによるマウス肺の線維化を示しました。 (A)シリウスレッド染色を行い、CSDまたは生理食塩水処理後の肺組織におけるコラーゲン沈着を測定しました(ペインの左上と左下)。偏光顕微鏡で見ると、赤、黄、緑の3種類のコラーゲン線維が見つかり、そのうち赤色で示されている1型コラーゲン線維が珪肺症の危険因子です。しかし、車両群(右上および下層パネル)では有意な線維化は認められなかった。(B)線維症スコア(FS)は、シリウス赤染色12 に基づく半定量的評価指標であり、対照(***P < 0.0001)と有意に異なる。スケールバー = 200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:珪質性結節形成におけるマクロファージの役割をモニターするためのCSD処理マウス肺におけるCD68の免疫組織化学染色。 典型的なシリカ結節は、中心部のCSDの貪食後の液化壊死を特徴とし、周辺部はマクロファージに囲まれています(HE染色)。さらに、CSDは線維症(マッソン染色)を伴って結節に富んでいました。CD68の免疫組織化学染色により、マクロファージが肺組織に広く存在していることが明らかになりました。さらに、これらのマクロファージはCSDを摂取し(偏光顕微鏡下、右図)、重度の肺損傷を引き起こしました。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:CSD処理したマウス肺におけるNF-κBの発現 。 (A)肺組織に対して免疫組織化学染色を行った。右ペインのCSD処理マウス肺は、左ペインのVehicleグループと比較して高いNF-κB染色を示しました。スケールバー = 50 μm。 (B)代表的なウェスタンブロットでは、CSD処理マウスの肺におけるNF-κB発現が増加していることが示されました。新鮮な肺組織溶解をウェスタンブロッティングにかけた。(C)Sil基とVeh基のNF-κB差は有意であった(** P < 0.01)。バンド強度は画像Jを用いて測定 した。

著者は利益相反がないことを宣言します。