方法論記事

結晶性シリカダストの反復吸入による珪肺症マウスモデル

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DOI：

10.3791/64862

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2023年1月6日

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1Key Laboratory of Industrial Dust Control and Occupational Health of the Ministry of Education, Anhui University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University of Science and Technology, 3Anhui Province Engineering Laboratory of Occupational Health and Safety, 4School of Medicine, Department of Medical Frontier Experimental Center, Anhui University of Science and Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは鼻の点滴によって無水ケイ酸懸濁液への反復的な露出によって珪肺症のマウス モデルを確立する方法を記述する。このモデルは、ヒト珪肺症の病理学的プロセスを効率的、便利、かつ柔軟に模倣し、高い再現性と経済性を備えています。

要約

珪肺症は、産業環境で呼吸器系結晶性シリカ粉塵(CSD)にさらされることによって引き起こされる可能性があります。ヒトにおける珪肺症の病態生理学、スクリーニング、および治療はすべて、マウス珪肺症モデルを使用して広く研究されています。マウスにCSDを肺に繰り返し吸入させることで、マウスはヒトの珪肺症の臨床症状を模倣することができます。この方法論は、時間と出力の点で実用的かつ効率的であり、手術による上気道への機械的損傷を引き起こしません。さらに、このモデルは、珪肺症の急性/慢性形質転換プロセスをうまく模倣できます。主な手続きは、以下の通りです。滅菌した1〜5μmのCSD粉末を完全に粉砕し、生理食塩水に懸濁し、超音波水浴中に30分間分散させた。イソフルラン誘発麻酔下のマウスは、約2秒間、浅い速呼吸から深くゆっくりとした吸引に切り替わりました。マウスを手のひらに置き、親指の先をマウスの顎の唇の端にそっと触れて気道をまっすぐにしました。各呼気の後、マウスは1つの鼻孔からシリカ懸濁液を一滴ずつ吸い込み、4〜8秒以内にプロセスを完了しました。マウスの呼吸が安定した後、吸入したCSDが咳をしないように、胸を撫でたり愛撫したりしました。その後、マウスをケージに戻した。結論として、このモデルは、上気道から末端細気管支および肺胞まで、肺への微小粒子の典型的な生理学的通過に沿ってCSDを定量化することができます。また、仕事による従業員の繰り返しの曝露を再現することもできます。モデルは1人で行うことができ、高価な機器は必要ありません。ヒト珪肺症の疾患の特徴を高い再現性で便利かつ効果的にシミュレートします。

概要

労働者は必然的に不規則な結晶性シリカ粉塵(CSD)にさらされ、吸入する可能性があり、鉱業、陶器、ガラス、石英加工、コンクリート1,2など、多くの職業状況でより有毒です。珪肺症として知られる慢性的な粉塵吸入状態は、進行性の肺線維症を引き起こします3。疫学データによると、珪肺症の発生率は過去数十年にわたって世界的に減少していますが、近年、増加しており、若年層に影響を与えています4,5,6。珪肺症の根本的なメカニズムは、その潜行性の発症と長期の潜伏期間のために、科学研究にとって重要な課題を提示します。珪肺症がどのように発症するかはまだ不明です。さらに、現在の薬では、珪肺症の進行を止めたり、肺線維症を逆転させたりすることはできません。

現在の珪肺症のマウスモデルでは、CSDの混合懸濁液を気管から摂取します。例えば、麻酔後に頸部気管外傷を採用してCSDを肺に投与することは、染料粉塵へのヒトの反復暴露には従わない7。周囲の粉塵への曝露が個人に与える影響は、この有毒物質の環境濃度をより正確に反映するエアロゾルの形でCSDに曝露することによって研究できます8。しかし、環境CSDは、マウスの鼻の特異な生理学的構造のために、単純に直接肺に吸入することはできない9。さらに、この技術に関連する機器は高価であるため、研究者はマウスの珪肺症モデル10を再評価しています。2週間以内に5回点鼻薬でCSD懸濁液を吸入することで、珪肺症の動的モデルを構築することができました。このモデルは、使いやすく、一貫性があり、安全です。この研究により、マウスでCSDの反復吸入が可能であることに注意することが重要です。この手順で作成されたマウス珪肺症モデルは、研究要件に対してより有益であることが期待されます。

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プロトコル

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド(NIH Publication No. 8023、1978年改訂)のガイドラインに従い、安徽科技大学医学部の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. マウスの管理と給餌

  1. 20匹の健康なC57BL/6雄マウスを実験群またはビヒクル群に1:1の比率で割り当てます。マウスを新しい環境に1週間順応させます。
  2. 1日あたり12時間の一定の光時間を提供します。正確なタイミングのために時間制御スイッチを使用してください。

2. CSD懸濁液の準備

  1. 点鼻剤が垂れる少なくとも1日前に、瑪瑙乳鉢でシリカを0.5時間粉砕します。
  2. 結晶粒子の大きさと形を観察します。走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して代表的な写真を撮影します。
    1. 導電性テープを使用して粒子を結合し、SEM用のサンプルを準備します。 ヘアドライヤーを使用して、しっかりと接着されていないシリコン粒子をそっと吹き飛ばします。
    2. サンプルチャンバーを排気し、高圧をオンにして、画像をキャプチャします。
      注:レンズとサンプル間の作動距離(WD)は5.9mm、加速電圧は2.0kV、倍率(Mag)は100,000倍です。粒子は不規則な結晶化で分散しており、約80%の直径は1〜5μmです(図1A)。
  3. 20 mg/mLの滅菌CSD懸濁液を作製します。CSDを滅菌生理食塩水で希釈し、超音波振とう機(40kHz、80W)で室温(RT)で30分間混合します。
  4. 点鼻薬を投与する前に、CSD懸 ?? 液をボルテックスミキサーで10秒間完全に攪拌および混合します。.

3. マウスへの点鼻薬の投与

  1. 麻酔器で2%イソフルランを3.6 mL/hの用量でマウスに迅速に麻酔します(図1B、左パネル)。
    注意: 麻酔は、技術者による麻酔薬の吸入を避けるために、ドラフト内で行う必要があります。.マウスの急速で不規則な呼吸からゆっくりとした定常状態への変化を観察して、麻酔の深さが適切であることを確認します。
  2. 4〜8秒以内に50μLのCSDを鼻腔に滴下します(図1B、右)。
    1. 点鼻薬は、人差し指の先でマウスの頭を研究者の中手指節関節に当てます。
    2. マウスをうつ伏せにしたまま、4本の指を少し曲げ、親指の先をマウスの下唇に軽く触れて気道をまっすぐにします。咽頭に触れて咽頭反射を誘発しないようにします。
    3. 200 μlのピペットを使用して50 μlの液体を吸引します。マウスの呼吸数に応じて、3〜4回に分けて液体をマウスの鼻腔に滴下します。.各点滴は、15〜20μlの液体で構成する必要があります。.点滴は3日に1回、12日以内に5回投与します。コントロールマウスを等量の生理食塩水で処理します。
  3. マウスの心臓部分を5x〜10x5秒間優しくマッサージします。
    1. 手のひらでネズミの体を持ち、親指と人差し指で首の後ろの皮膚をつまみ、他の指でネズミの後肢を固定します。次に、もう一方の手の人差し指でマウスの心臓の鼓動領域を5秒間に5〜10回そっと押します。
  4. マウスの呼吸が安定したら、温熱パッド付きの回復ケージに入れ、麻酔から回復するまで観察してから、マウスをホームケージに戻します。31日でマウスを犠牲にします。

4.肺組織を採取し、パラフィン切片を作製する

  1. 0.18 mLの10%抱水クロラールを腹腔内に注入し、マウスがつま先または尾の刺激に反応しないようにします(歯付き鉗子を使用して実施)。次に、次の手順に進みます。
  2. マウスの手足を発泡スチロールテストボードに固定し、75%アルコールをスプレーして毛皮を湿らせます。鎖骨の正中線にある胸部肋骨の大部分を取り除き、マウスの胸腔を開いて心臓と肺を露出させます。
  3. すぐに眼科手術用ハサミで右心房を切り開き、左心房拍動時に心臓先端から20 mLのリン酸緩衝液(PBS)を最大振幅でゆっくりと注入し、全血を流します。次に、右肺の下葉を切除し、-80°Cで保存してウェスタンブロッティング分析を行います。
  4. PBS注入後、同じ部位に10 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を灌流し続けます。残りの肺を採取し、病理学的分析のためにサンプルを 30 mL の 4% PFA に保存します。
  5. 72時間固定後、標本をパラフィンに包埋します。
    1. 脱イオン水(60%、70%、80%、90%、100%)に段階的に希釈した一連のエタノール(EtOH)で組織を室温でそれぞれ1時間脱水し、キシレンを2回ずつ洗浄してサンプルを1時間ずつ除去します。
    2. 溶融したパラフィンワックスを50°Cで2時間加熱してサンプルに浸透させます。このプロセスを別のシリンダーで繰り返します。ワックス型をティッシュで1時間冷やして固めます。
    3. ワックスが硬化し、組織が包埋されたら、パラフィン切片化機を使用して組織を5μmでスライスします。正確な切片作成およびスライド取り付け手順については、以前に説明した11。
      注:十分な組織灌流は、10 mLの4%PFAを受け取った後、筋肉のけいれんと尾のねじれを「S」字型または屈曲に発達させることによって示されます。.

5. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色の実施

  1. パラフィン包埋組織をホットプレート(60°C)で4時間以上加熱し、スライドへの接着と脱パラフィンの改善を可能にします。
  2. パラフィン切片を脱ワックスして水和させます。スライドにサンプルをキシレンに2回、毎回30分間浸します。次に、それらを無水エタノールに浸し、次に95%、85%、75%アルコール、および脱イオン水にそれぞれ5分間浸します。
  3. ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行います。ヘマトキシリン染色バケツで組織を10分間染色します。やさしく流水で5分間洗い流します。次に、スライドをエオシン染色バケツに10秒間浸します。
  4. サンプルを75%、85%、95%、および無水エタノールでそれぞれ5分間脱水します。組織切片をキシレンに5分間浸してきれいにします。約60μLの中性レジン滴で切片を密封します。カバースライドをセクションの上に置き、気泡を避けるために慎重に下げます。

6. マッソン染色の実施

  1. ステップ5.2で説明したように、パラフィンサンプルを脱ワックスして水和します。次に、細胞核を50%ワイゲルトヘマトキシリンで10分間染色します。組織を酸性エタノール液化に10秒間浸し、流水で組織スライドを静かにすすぎ、核の青化を行います。
    注:使用直前にWeigertのヘマトキシリン染色液を調製してください。
  2. サンプルをLichun red染色液(各組織スライドに40 μL)の滴で7分間染色し、弱酸性作業溶液(30%塩酸)で1分間洗浄して、結合していないLichun赤色色素を除去します。
  3. それらを95%アルコールに20秒間浸し、無水エタノールでそれぞれ1〜3秒間2回脱水します。その後、手順5.4で説明したように、組織をキシレンで除去し、60 μLの中性樹脂滴で密封します。

7. シリウスレッド染色を行う

  1. ステップ5.2で説明したように、パラフィンセクションを脱ワックスして水和させます。
  2. 切片にシリウスレッド染色液を1時間浸潤させます。
  3. サンプルの細胞核をMayerヘマトキシリン染色溶液で8〜10分間染色します。流水で10分間やさしくすすいでください。次に、脱水してティッシュスライドを取り除きます。ステップ5.4で説明したようにそれらを密封します。

8. 免疫組織化学の実施

  1. ステップ5.2の説明に従ってパラフィンサンプルを脱ワックスし、水和させます。
  2. 約30 mLの3 mg/mLのEDTA抗原賦活化溶液で検体を浸潤させます。20〜30分間沸騰させます。組織を脱イオン水で洗浄し、0.5% Tween-20(PBST)を含むリン酸緩衝液中で5分間インキュベートします。
  3. サンプルを0.3%過酸化水素溶液に15分間浸し、検体中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化します。毎回PBSTで5分間3回洗います。
    注意: 0.3%過酸化水素溶液は、遮光環境で新鮮にする必要があります。
  4. 0.3% Triton-100溶液で15分間、試料のメンブレンを透過処理します。次に、30〜40μLの5%ウシ血清アルブミン(BSA)で1時間ブロックします。
  5. ブロッキング溶液を取り除きます。希釈した一次抗体NF-κB(希釈率1:200)およびCD68(希釈率1:1,000)を添加し、顕微鏡スライドIHCウェットボックス内で2〜8°Cで一晩インキュベートして、蒸発と光を防ぎます。
  6. 翌日、RTに1時間移します。次に、PBSTで3回、それぞれ5分間洗浄します。
  7. サンプルをウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(希釈比1:500)中で1時間、室温でインキュベートし、PBSTで3回ずつ5分間洗浄します。
    注:一次抗体と二次抗体の両方を5%BSAで希釈しました。
  8. 酵素標識抗体に対応する3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)基質とサンプルを5〜20分間インキュベートします。最適な染色強度に達したら、脱イオン水との反応を停止します。
    注意: DAB溶液は新たに調製し、光から保護する必要があります。発色反応を顕微鏡でリアルタイムに観察し、染色を止めるタイミングを決定する必要があります。陽性の標本は強い染色を示しますが、陰性の標本は発色しません。
  9. サンプルをワイゲルトヘマトキシリンで30秒間対比染色します。次に、流水で組織を1分間すすぎます。次に、ステップ5.4で述べたように、組織スライドを脱水し、透明化し、密封します。

9. ウェスタンブロッティング分析の実施

  1. 肺組織を溶解してタンパク質を抽出します。200 μL の RIPA ワーキング溶液を 20 mg の肺組織に加えます。
  2. ハンドヘルド電動グラインダーを使用して氷上で組織を5分間均質化し、穏やかに振とうしながら氷上で1時間インキュベートします。その後、ホモジネートを 4 °C で 15 分間、14,800 x g で遠心分離します。
  3. 上清を採取し、BCAタンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を測定します。RIPAで6 μg/μLのタンパク質保存溶液を作製します。80 μLのプロテインライセートに20 μLの5xローディングバッファーを加えます。タンパク質含有微量遠心チューブを金属浴(100°C)で20分間加熱することにより、二次タンパク質構造を破壊します。
  4. 冷却後、タンパク質保存溶液100 μLを各チューブに分注し、サンプルを-80°Cの冷蔵庫で保存します。電気泳動の前に、タンパク質濃度を1倍ローディングバッファーで2–3 μg/μLに希釈します。
    注:タンパク質抽出プロセスは氷上で実行する必要があります。RIPAワーキング溶液の場合、100 mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)1 μLを99 μLのRIPAに添加して、リン酸化タンパク質の分解を阻害します。 5倍のローディングバッファーをRIPAで1:4の比率で希釈して、1xローディングバッファーを調製します。
  5. 各ウェルに 20 μg のサンプルを添加し、ゲルを泳動します。5%濃縮ゲルの場合、80 Vで20分間使用して、同じ開始点からタンパク質を電気泳動します。10%単離ゲルの場合、100 Vで1時間泳動して、分子量の異なるタンパク質を可能な限り分離します。
  6. PVDFメンブレンをメタノールで20秒間予備活性化します。400mAの電流で1〜2時間湿式転写法を使用して、タンパク質をPVDFメンブレンに転写します。
    注:電気泳動タンクと電解転写タンクが水平であることを確認してください。メンブレン転写プロセスは多くの熱を発生するため、タンク全体を氷で冷却します。
  7. メンブレンをTBST溶液で毎回5分間、5回洗浄します。次に、5%BSAまたは5%スキムミルクで1時間ブロックします。一次抗体NF-κB(1:1,000)およびβ-アクチン(1:1,000)を5%BSAで希釈します。ストリップを抗体溶液に浸し、2〜8°Cで一晩静かに振とうします。
  8. ストリップをPBSTで洗浄します。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:10,000)を希釈し、希釈した二次抗体中で室温で1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
  9. 増強化学発光(ECL)現像液を調製し、ストリップ上に滴下し、3分間インキュベートします。
  10. ストリップをゲルイメージャーに20秒間さらします。ストリップのグレー値を測定して、システムソフトウェアでタンパク質レベルを評価します。β-アクチンを内部統制として使用する。

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結果

マウスにおける珪肺症の潜在的な病因は、提案された方法を使用して調査されました。その結果、実験群のマウスの体重は対照群に比べて有意に減少し、曝露中止後の体重の回復が遅いことが分かりました。ここで使用した用量が最適化されているため、この実験ではシリカに曝露したマウスでは死亡率は観察されませんでした。CSDへの反復点鼻漏の技術的ロードマップを(図1)に示します。前述の手順には、CSD懸濁液の準備、イソフルラン誘発麻酔、点鼻薬、および胸部マッサージが含まれていました12。コラーゲン沈着と筋線維芽細胞の分化を4週間の静的摂食後に実証した12。私たちは、この粉塵曝露法を用いて、石炭粉塵によって引き起こされる肺線維症の根本的なメカニズムを研究しています。マクロファージの新しいサブセットとビタミンDの介入効果は、シングルセルトランスクリプトーム技術によって発見されました13。本研究では、気管支末梢弾性線維の損傷を引き起こすCSDへの曝露により、マウスの...

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ディスカッション

珪肺症マウスモデルは、珪肺症の病因と治療を研究するために重要です。このプロトコルは繰り返された鼻の露出によってマウスの珪肺症のモデルを準備するための方法を記述する。この方法は、異なる曝露時間によって誘発される珪肺症の病理学的特徴の研究を可能にする。マウスに人工呼吸器を装着し、呼吸数をモニターした。最初の短くて速い呼吸数は、時間の経過とともに徐々に遅くなったり深くなったりしました。麻酔によりマウスの筋肉が弛緩し、深呼吸が始まり、ゆっくりと深呼吸する時間帯にCSDを吸入できるようになりました。このプロセスの間、オペレーターはマウスの下顎骨を親指で持ち、首をまっすぐにして液体が消化管に入るのを防ぎます。この方法は、粉塵曝露を研究するために繰り返し実施する個々のニーズを満たすことができます。2017年にKatoらは、口腔咽頭点滴 による 単回高用量(125 mg/mL、40 μL)を使用して肺線維症をモデル化し、この濃度を参照して、鼻腔を通る複数の少量投与によって誘発される肺の変化を調べようとしています14。

麻酔後の点鼻薬...

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開示事項

著者は利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、安徽省大学シナジーイノベーションプログラム(GXXT-2021-077)および安徽科技大学大学院イノベーション基金(2021CX2120)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 mLチューブバイオシャープBS-05-M
10% ホルマリン中性固定剤Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.
Adobe IllustratorAdobe NA
アルコール消毒剤Xintai Kanyuan消毒製品有限公司
CD68Abcamab125212
クエン酸抗原賦活化溶液biosharp ライフサイエンスBL619A
DAB 発色キットNJJCBioW026-1-1
ジメチルベンゼンWest Asia Chemical Technology (Shandong) CoNA
Enhanced BCA protein assay kitBeyotime BiotechnologyP0009
ヘマトキシリンとエオシン(H&E)Beyotime BiotechnologyC0105S
HRP基質Millipore CorporationP90720
HRP共役 アフィニピュアヤギ 抗ウサギIgG(H+L)プロテインテックSa00001-2
IceaceticWest Asia Chemical Technology (Shandong) CoNA ImageJ
NIHNA
IsofluraneRWD LifeサイエンスR510-22
マッソンのトリクローム染色キットソーラーバイオG1340
メタノールマックリンNA
マイクロチューブミリポアAXYMCT150CS
NF-κB p65細胞シグナル伝達技術8242S
振動サーモスタット金属浴アブソンNA
パラフィン埋め込み機精密(常州)医療機器株式会社PBM-A
パラフィンスライサーJinhuaクラタイインスツルメンツ株式会社NA
リン酸緩衝液(PBS) バイオシャープBL601A
生理食塩水 淮南市
ピペットEppendorfNA
PMSFBeyotime BiotechnologicalST505
光顕微鏡リンパスBX51
精密バランスAcculabALC-110.4
Prism7.0GraphPad バージョン7.0
PVDF膜ミリポア3010040001
RIPA溶解バッファーBeyotime BiotechnologyP0013B
RODI IOTインテリジェント多機能浄水システムRSJRODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3DシェーカーScilogexNA
SDS-PAGEゲル調製キットBeyotimeバイオテクノロジーP0012A
二酸化ケイ素シグマ#BCBV6865
シリウス赤色染色南京SenBeiJiaバイオテクノロジー株式会社
小動物麻酔器安徽Yaokun Biotech Co.、Ltd.ZL-04A
ユニバーサルピペットチップ(0.1–10 µL)KIRGENKG1011
ユニバーサルピペットチップ(100–1000 &マイクロ;L)KIRGENKG1313
ユニバーサルピペットチップ(1–200 µL)キルゲンKG1212
ボルテックス ミキサー VWRNA
ZEISS GeminiSEM 500ツァイスドイツSEM 500
β-actinBiossbs-0061R
NANA acid の最初の人民病院NA偏オ181012

参考文献

  1. Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
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