ウシ単球由来樹状細胞を用いたワクチン免疫原性の決定

獣医用ワクチン接種は、世界の畜産部門に影響を与える病気に対する保護を与えることにより、食料安全保障と動物福祉の改善に貢献するため、畜産と健康の重要な側面を表しています¹。可能なワクチン候補の免疫原性を評価するための効果的な in vitro 法は、ワクチンの開発と製造のプロセスを加速するのに役立ちます。したがって、 in vitro 研究に基づく革新的な方法論で免疫アッセイの分野を拡大することは、免疫化と病原体感染に関連する免疫プロセスの複雑さを明らかにするのに役立つため、必要です。現在、定期的なサンプリング(血液や脾臓など)を必要とする in vivo 動物免疫およびチャレンジ試験が、候補ワクチンおよびアジュバントの免疫原性を測定するために使用されています。これらのアッセイは高価で時間がかかり、ほとんどの場合、動物の安楽死は試験の終わりまでに行われるため、倫理的な意味があります。

in vivoアッセイの代替として、末梢血単核細胞(PBMC)を使用して、in vitro²でワクチン誘導免疫応答を評価しています。PBMCは、70%〜90%のリンパ球、10%〜20%の単球、および限られた数の樹状細胞(DC、1%〜2%)で構成される不均一な細胞集団です³。PBMCには、B細胞、単球、DCなどの抗原提示細胞(APC)があり、感染や組織損傷の兆候を探して生物を常にパトロールします。局所的に分泌されるケモカインは、細胞表面受容体に結合することにより、これらの部位へのAPCの動員および活性化を促進する。単球の場合、ケモカインはDCまたはマクロファージのいずれかに分化するように運命を指示します⁴。DCが病原体に遭遇して捕獲するとすぐに、それらは二次リンパ器官に移動し、そこで主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIまたはクラスII表面タンパク質を使用して処理された病原体ペプチド抗原をそれぞれCD8+ T細胞またはCD4⁺ T細胞に提示することができ、したがって免疫応答を引き起こす^5,6。

さまざまな病原体に対する防御免疫応答を調整する上でDCが果たす重要な役割は、特に感染性病原体に対するワクチンやアジュバントを設計する際に、細胞内免疫メカニズムを理解するための興味深い研究ターゲットになります⁷。PBMCから得ることができるDCの割合はかなり小さい(1%〜2%)ので、代わりに単球がin vitro^でDCを生成するために使用されてきました8。これらの単球由来DC(MoDC)は、当初、がん免疫療法における可能な治療戦略として開発されました⁹。最近では、MoDCがワクチン研究に使用されており10、11^、12、古典的な単球がMoDC産生の主要なサブタイプ(89%)です¹³。インビトロでのMoDCの産生は、インターロイキン-4(IL-4)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、またはIL-13などの他のサイトカインと組み合わせて与えられた顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の添加によって以前に達成されています14,15,16。

in vitro MoDCアッセイの成功は、抗原刺激成熟MoDCが検出された抗原のタイプに特異的な免疫応答の範囲とタイプを調節する能力に依存しています¹⁷。MoDCによって認識および提示される病原体の種類は、CD4⁺ Tヘルパー(Th)細胞のTh1、Th2、またはTh17エフェクター細胞への分化を決定し、病原体特異的分泌サイトカインプロファイルによって特徴付けられます。Th1応答は細胞内病原体に対して誘発され、食作用依存性保護を調節するインターフェロンガンマ(IFN-γ)および腫瘍壊死因子ベータ(TNF-β)の分泌をもたらす。Th2応答は寄生生物に対して誘発され、IL-4、IL-5、IL-10、およびIL-13分泌によって特徴付けられ、食作用に依存しない体液性保護を開始します。Th17は、IL-17、IL-17F、IL-6、IL-22、およびTNF-α 18,19,20,21の分泌によって媒介される細胞外細菌および真菌感染症に対する好中球依存性の保護を提供します。以前の研究に基づいて、すべての病原体が予想されるサイトカインプロファイルに含まれるわけではないことが指摘されています。例えば、皮膚MoDCは、リーシュマニア寄生感染に応答して、CD4+ T細胞およびCD8⁺ T細胞からのIFN−γ分泌を刺激し、したがって保護的炎症誘発性Th1応答を誘導する²²。

また、サルモネラ菌リポ多糖(LPS)をプライミングしたニワトリMoDCでは、Th1応答とTh2応答の両方を活性化することにより、ネズミチフス菌に対する可変応答を誘導できることも示されていますが、サルモネラガリナラムはTh2応答のみを誘導し、MoDCクリアランス²³に対する後者のより高い耐性を説明できる可能性があります。ブルセラ・カニス(B. canis)に対するMoDCの活性化は、イヌとヒトの両方のMoDCでも報告されており、これは人獣共通感染症の感染メカニズムを表している可能性があります²⁴。B. canisでプライミングされたヒトMoDCは、重篤な感染に対する耐性を与える強力なTh1応答を誘導しますが、イヌMoDCは、Th1応答の低下を伴う優性Th17応答を誘導し、その後、慢性感染症の確立につながります²⁵。ウシMoDCは、前者¹⁰に応答してウイルス抗体複合体を形成するため、免疫グロブリンG(IgG)と結合した口蹄疫ウイルス(FMDV)に対する親和性が非結合FMDV単独と比較して増強された。まとめると、これらの研究は、病原体感染中の免疫応答の複雑さを分析するためにMoDCがどのように使用されているかを示しています。適応免疫応答は、リンパ球増殖に関連する特異的マーカーの定量化によって評価することができる。分裂細胞でのみ検出される細胞内タンパク質であるKi-67は、増殖研究の信頼できるマーカーと見なされ^ており26、同様に、活性化の後期にT細胞の表面に発現するCD25はリンパ球の増殖に対応します^27,28。

この研究は、牛MoDCのin vitro生成のための標準化された方法と、それに続くワクチンの免疫原性をテストするために使用されるin vitro免疫アッセイでのそれらの適用を示しています。市販の狂犬病ワクチン(RV)を使用して、このアッセイの有効性を検証しました。Tリンパ球の活性化と増殖は、フローサイトメトリー、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって測定され、Ki-67やCD25などの確立された細胞活性化マーカーの分析とIFN-γ 28,29,30,31の分泌を通じて測定されました。MoDCアッセイ中に動物または人間の実験試験は行われません。

採血は、オーストリア保健食品安全庁(AGES)の倫理ガイドラインに従い、受け入れられている動物福祉基準³²に準拠して、認定獣医サービスによって行われます。この研究は、オーストリア農業省から倫理的承認を受けました。MoDCの生成とその後のアプリケーションの実験計画を 図1に示します。

1.ナイーブMoDCの生産

注:全血サンプルは、ヘパリン化バキュテイナーによる頸静脈穿刺によって、病原体のない単一の子牛から取得されました(この研究では8本の9mL血液チューブを使用しました)。アイスボックスで血液を輸送します。後で使用するためにサンプルを2〜4°Cで保管するか、すぐに処理します。血液凝固を避けるために血液を回転させてください。真空容器を70%エタノールで滅菌します。以下のすべての実験は、1つの生物学的サンプルと6つの技術反復で実施されました。

1. ヘパリン化血液からPBMCを分離するための密度勾配遠心分離
   1. 血液を10倍反転させてよく混ぜます。
   2. 10 mLピペットを使用して、20 mLのヘパリン化血液を滅菌済みの50 mLチューブに移し、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈します。
   3. 15 mLのリンパ球単離培地を滅菌50 mLチューブにピペットで入れます。
      注意: ピペッティングする前に、リンパ球分離培地を室温に到達させてください。
   4. リンパ球分離培地を含む50 mLチューブを45°の位置に傾けます。25 mLピペットの先端を垂直に向け、リンパ球分離培地の上に30 mLの血液PBSを混合せずに慎重に重ねます。非常にゆっくりと、50 mLチューブを垂直位置に戻します。
   5. 800 × g で20°Cで35分間遠心分離し、最大加速でブレーキをかけません(減速機能はオフ)。
   6. パスツールピペットを使用してPBMC層(血漿の最初の層の直後の薄い白い層)を収集し、新しい50 mLチューブに移します。
      注:密度勾配遠心分離は、全血を異なる層に分離します。その結果、赤血球はペレットとして底部に沈降し、単核球(PBMC)は界面層に沈降し、血漿は最上層を形成する。顆粒球は、ペレットとPBMC層の間に見出される。
   7. 収穫したPBMCを40 mLの容量までPBSを加え、上下にピペッティングして完全に混合することにより、収穫したPBMCを2倍に洗浄します。その後、500× g 、4°Cで7分間、最大加速と最大減速で遠心分離します。
   8. 上清をデカンテーションで廃棄し、ペレットを15 mLの1x塩化アンモニウムカリウム(ACK)バッファーに再懸濁し、室温で10〜15分間インキュベートします。
      注意: 15分以上インキュベートしないでください。市販のACKバッファーは、PBMC画分に存在する残留赤血球(RBC)の溶解を確実にするために使用されます。
   9. PBSを40 mLの容量まで添加し、500 × g および4°Cで7分間遠心分離し、最大加速と減速を行います。
   10. 上清をデカントして廃棄し、手順1.1.9を繰り返します。
   11. 上清を捨て、ペレットを10 mLの完全培養培地(室温)に再懸濁します。
       注:完全な培養培地は、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640細胞培養培地で構成されています。
2. CD14結合磁気ビーズを用いたPBMC集団からのCD14^+/− 細胞の磁気分離
   1. 10 μLのトリパンブルー(0.4%)溶液と混合した10 μLの細胞懸濁液を使用して、きれいな血球計算盤のセルカウンターで細胞をカウントします。
      注意: トリパンブルー染料は有毒な化学物質であり、発がんの可能性があります。接触を避けるために個人用保護具(PPE)を着用して取り扱う必要があり、廃棄物は気密専用の有毒廃棄物容器に廃棄する必要があります。死んだ細胞は青く見えますが、生細胞は顕微鏡下ではっきりと見えます。
   2. 500 × gで7分間遠心分離します。
   3. ピペットを使用して上清を捨て、1×10から⁷ 細胞ごとに40 μLの容量を使用して蛍光活性化セルソーティングバッファー(FACS)にペレットを再懸濁します。ピペットを使ってよく混ぜます。
      注:FACSバッファーは、PBSに溶解した2%FBSと2mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で構成されています。
   4. 1細胞×10細胞あたり5 μLのCD14マイクロビーズバッファーを加え、ピペットを使用して十分に混合します。
   5. ウシCD14⁺ 単球³³のポジティブ選択のために4〜8°Cで30分間インキュベートします。潜伏期間中は15分ごとに渦を流します。
   6. オプションのステップ(フローサイトメトリー分析用):CD14-FITC(フルオレセインイソチオシアネート)染色抗体を10 μL添加し、その後4〜8°Cで15分間インキュベートします。 詳細については、ステップ5のフローサイトメトリー解析を参照してください。
   7. 1 mLのFACSバッファーを加え、500 × gで7分間遠心分離します。
   8. 上清を捨て、ペレットを1×10細胞あたり500 μLのFACS緩衝液に再懸濁した。
   9. 免疫磁気細胞分離カラムをセパレーター(磁気カラムホルダー)に挿入し、フロースルーを回収するためのカラム出口の下に15mLの収集チューブを置きます。
   10. 1 mLの脱気FACSバッファーでカラムを洗浄します。すすぎ後、使用済みの15 mLチューブを新しいものと交換します。
   11. 細胞懸濁液(ステップ1.2.8から)を、一度に500 μLのバッファーで1×10⁸ 細胞をピペッティングしてカラムを通過させます。
       注意: セルをカラムに通す前に、セルを混合するときに気泡が発生しないように注意してください。
   12. 毎回、3 mLの脱気FACSバッファーでカラムを3回すすぎます。
   13. フロースルーを収集し、この最初の溶出画分をCD14-細胞画分(PBMC^- マイナスCD14⁺ 単球)としてラベル付けします。これはナイーブリンパ球画分とも呼ばれます。
       注:CD14⁻ 細胞は、抗原パルスMoDCが産生されるまで完全な培養培地に維持されます。
   14. 区切り記号から列を削除します。
   15. 廃液を回収するために、新しい滅菌15 mLチューブをカラムの下に置きます。
   16. 5 mLのFACSバッファーをカラムにピペットで入れ、プランジャーを用いて直ちに押し込みます。
   17. フロースルーを収集し、この2番目の溶出画分をCD14⁺ 細胞画分としてラベル付けします。これはナイーブ単球画分とも呼ばれます。
   18. 採取したCD14⁺ 単球に完全培養液を加えて、1×10⁶ 細胞/mLにします。
       注:溶出したCD14⁺ 細胞画分中の生細胞をカウントして、目的の細胞数を達成するために必要な完全培養培地の量を推定します。
   19. 滅菌済みの24ウェルプレートを取り、1 mLの細胞懸濁液(1 ×^{10 6} cells/mL)を各ウェルに加えます。
3. 合計5日間のインキュベーションで3%w/vサイトカインカクテル(GM-CSF + IL-4)を添加することにより、CD14⁺ ナイーブ単球をナイーブMoDCに分化
   1. CD14⁺ 単球を含む各ウェルに、キットに含まれている40 μL(3% w/v)のサイトカインカクテルを補充します。
   2. プレートを5%_CO2 を含む加湿インキュベーター内で37°Cで48時間インキュベートします。
   3. 2日目に、ピペットを使用して各ウェルの内容物の半分(500 μL)を個々の1.5 mLチューブに移し、500 × g で4°Cで7分間遠心分離します。
   4. 上清を捨て、ペレットを500 μLの新鮮な完全培養培地に再懸濁します。
   5. この細胞懸濁液をステップ1.3.4から500 μL、指定された各ウェルに戻して、最終容量が1 mLになるようにします。
   6. 各ウェルに20 μLのサイトカインカクテルを注入します。
   7. 培養物を5%CO2を含む加湿インキュベーター内で37°Cで₇₂ 時間インキュベートする。
   8. 5日目のインキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り外します。
      注:各ウェルには、ナイーブMoDCの細胞懸濁液が1mL含まれています。MoDCの数は、播種された元の単球のパーセンテージ(~20%)になります(1×10⁶ / mL)。

2. MoDCエンドサイトーシス活性アッセイ

注:抗原取り込みアッセイまたはエンドサイトーシス活性アッセイは、ナイーブMoDCが異物を内在化する能力を測定します。前述のように、3%w/vサイトカインカクテルで培養し、5日間のインキュベーションで培養したナイーブMoDCを使用してアッセイを実行します³⁴。

1. ナイーブMoDC細胞懸濁液を24ウェルプレートから回収し、15 mLチューブに移します。また、PBSでウェルをすすぐことによって残留細胞を収集します。
2. 500 × g で7分間遠心分離します。上清を捨て、1%FBSを添加した1 mLの培養液にペレットを再懸濁します。
3. 生のMoDC細胞をカウントして、目的の細胞数(2 × 10^{5 cell} / mL)を達成するために必要な培地の量を推定します。
4. ナイーブMoDCを、最終細胞濃度2×10⁵ 細胞/mLの24ウェルプレート内の100 μLの完全培養培地で培養します。
5. 各ウェルに1 mg/mL FITC結合デキストラン(エンドサイトーシストレーサーとして使用される蛍光プローブ)を補充します。
   注:FITCデキストランは蛍光プローブとして機能し、エンドサイトーシストレーサーとして使用されます。
6. プレートを覆い、5%_CO2 および37°Cの暗所で60分間インキュベートします。
   注:バックグラウンドコントロールでは、追加のMoDC細胞(2 × 10⁵ 細胞/mL)を氷上で1 mg/mLのFITCデキストランとともにインキュベートします。
7. インキュベーション後、直ちに24ウェルプレートを氷上に移し、FITCデキストランのエンドサイトーシスを停止します。
8. 氷冷したFACSバッファーで細胞を洗浄します。
9. ペレットを回収、遠心分離し、500 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
10. フローサイトメトリーを使用して、細胞内のFITCデキストランの蛍光強度を分析します。詳細については、ステップ 5.2 のフローサイトメトリー解析を参照してください。

3. 抗原パルスMoDCの作製

注:狂犬病ウイルス(RV)に対する市販の臨床的に承認されたワクチンは、ナイーブMoDCを成熟抗原提示MoDCに分化させることができます。RVワクチン接種単回用量の0.1%(~1 μL)を使用して、抗原パルスMoDCを生成します。さらに、ナイーブMoDCを新しい24ウェルプレートに移すと悪影響を受けるため、ナイーブMoDCを生成するために使用したのと同じ培養プレート(ステップ1.3.8)でRVパルスMoDCを生成することが好ましい。

1. ステップ1.3.8)から、24ウェルプレートのナイーブMoDC培養液1 mLに1 μL/mLのRV懸濁液を加え、5%_CO2 および37°Cで48時間インキュベートします。
   注:RV刺激なしで培養されたナイーブMoDCは、バックグラウンドコントロールとして使用されます(および次のステップでリンパ球との共培養のための非特異的刺激として使用されます)。
2. インキュベーション後、7日目に、抗原パルスMoDCを含む24ウェルプレートを氷上に10分間保持します。
3. ウェルあたり1 mLの氷冷PBSを追加します。ピペッティングで各ウェルを完全に混合し、懸濁液を15 mLチューブに移します。
4. 2 mLの氷冷PBSでウェルを洗浄し、各ウェル内に残っている残留細胞を収集します。
5. 内容物をそれぞれのチューブに移し、細胞懸濁液を500 × g で7分間遠心分離します。
6. 上清を廃棄し、細胞ペレット(抗原パルスMoDC)を完全培養培地に再懸濁し、容量を最終細胞濃度1×10⁵ 細胞/mLに調整します。
   注:生細胞をカウントして、目的の細胞数を達成するために必要な培地の量を推定します。MoDCリンパ球共培養システムには、7日目からRVパルスMoDCを使用してください。

4. MoDCリンパ球共培養

注: in vitro MoDCリンパ球共培養システムは、抗原特異的リンパ球をプライミングするMoDCの能力を決定します。共培養の16日後の細胞の異なる処理群には、特異的、非特異的、および対照が含まれる。特定のグループは、RVパルスMoDCと共培養されたリンパ球として定義されます。非特異的グループは、非抗原パルスMoDCと共培養されたリンパ球として定義されます。対照群は、MoDCなしで培養されたリンパ球として定義される。

1. 溶出したナイーブリンパ球画分(CD14⁻ 細胞)に完全培養液を加えて、2 × 10⁶ cells/mLの細胞濃度を達成します。
   注:CD14⁻ 細胞培養中の生細胞をカウントし、収集以来24ウェルプレート内の完全な培養培地で維持され、目的の細胞数を達成するために必要な培地の量を推定します。
2. 7日目に、滅菌済みの24ウェルプレートを取り、1 mLのナイーブリンパ球細胞懸濁液(2 × 10⁶ 細胞/ mL)と1 mLの抗原パルスまたは非抗原パルスMoDC懸濁液(1 ×^{10 5} cell / mL)をウェルに播種します。
   注:各ウェルの総容量は2 mLで、ウェルあたりのリンパ球に対するMoDCの比率は1:20です。
3. プレートを37°Cおよび5%_CO2で48時間インキュベートします。
4. 抗原パルスMoDCによる培養液の濃縮と再刺激
   1. 抗原パルスMoDCリンパ球共培養のインキュベーション後、9日目に、各ウェルに20 ng/mL組換えIL-2を補給し、さらに120時間(5日間のインキュベーション)インキュベートを続けます。
   2. 14日目に、1 mLの共培養液を滅菌した1.5 mLチューブに移し、500 × g で7分間遠心分離します。
   3. 上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLの抗原パルスまたは非パルスMoDC(1 ×^{10 5} cell/mL)で再懸濁します。ピペッティングで穏やかに混合し、細胞懸濁液を指定されたウェルに戻します。
      注:このステップでは、各ウェルの総容量は2mLです。
   4. 5%_CO2 および37°Cで48時間インキュベートを続ける。16日目のインキュベーション後、共培養はフローサイトメトリー、qPCR、およびELISAを使用した分析の準備が整います。
      注:MoDCリンパ球共培養の各ウェルの2 mLごとに、1 mLの再懸濁細胞をフローサイトメトリー用に染色し、1 mLをRNA抽出に使用し、両方の上清をELISAに使用します。

5. フローサイトメトリー解析

注:フローサイトメーターでサンプルを実行する前に、適切なマーカー/モノクローナル抗体で細胞を染色してください。フローサイトメトリー解析に使用する試薬(染色モノクローナル抗体およびアイソタイプコントロール)、キット、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料表 を参照してください。

1. フローサイトメーター染色プロトコル
   注:抗CD14 mAbを使用して、PBMCおよびナイーブリンパ球および単球の細胞表面染色を実行します(ステップ1.2.6)。ナイーブMoDCの細胞表面染色には、抗CD86特異的、抗CD40特異的、および抗MHC II特異的モノクローナル抗体を使用してください。共培養16日目からの細胞の細胞表面染色には、抗CD4、抗CD8、抗CD25 mAbを使用します。細胞内染色には、抗Ki-67 mAbを使用してください。さらに、ネガティブアイソタイプコントロールmAbまたはmAbなし(FMO:蛍光マイナス1)のいずれかで細胞を染色します。表面マーカーおよび細胞内マーカーの染色時の主な違いは、細胞表面マーカーの場合、生死(L/D)染色またはその他のプロセスの前に、細胞を特定の表面mAbで染色する必要があることです。ただし、細胞内染色はL/D染色後に行われ、細胞内浸透を可能にするには固定と透過処理ステップが必要です。
   1. ピペットを使用して1 mLの細胞懸濁液を滅菌済みの1.5 mLチューブに移し、500 × gで10分間遠心分離します。
      注:遠心分離後、MoDCリンパ球共培養からの細胞を処理する場合は、ELISA分析のために上清を保存します。
   2. ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、15 mLのチューブに移します。1 mLのPBSを使用して残留細胞を回収し、これを再懸濁したペレットと組み合わせます。
   3. 細胞を含む15 mLチューブに10 mLのPBSを加え、ピペッティングで混合し、850 x gで7分間遠心分離します。
   4. 上清を廃棄し、手順5.1.3を繰り返します。
   5. 上清を捨て、上清をデカントした後に残った懸濁液(約180μL)とともに細胞ペレットを注意深く再懸濁します。
   6. 細胞懸濁液をV底96ウェルプレートに移し、こぼれないようにウェルを密封します。
   7. プレートを1,400 × g で5分間遠心分離します。遠心分離後、プレートを廃容器の上でフリックして液体のウェルを空にし、吸収紙でプレートを軽くたたいて余分な液体を確実に除去します。
   8. ウェルあたり25 μLの表面染色マスターミックスを加え、ピペットを使用して穏やかに混合した後、4°Cで30分間インキュベートします。
      注:単一ウェルの表面染色マスターミックスを調製するには、2.5 μLの表面mAbを20 μLのFACSバッファーに加えます。
   9. ウェルあたり200 μLのFACSバッファーを加え、1,400 × g で5分間遠心分離します。遠心分離後、デカントして液体のウェルを空にし、吸収紙のプレートを軽くたたいて余分な液体を取り除きます。
   10. ウェルあたり100 μLのL/D染色液を追加します。ピペットを使用して十分に混合し、続いて暗所で4°Cで15分間インキュベートします。
       注:単一ウェルの場合は、0.25 μLのL/D色素を100 μLのFACSバッファーに溶解します。L/D色素は、生細胞と死細胞を区別するのに役立ちます。
   11. 100 μLのFACSバッファーを追加します。ウェルを蓋で覆い、プレートを1,400 × g で5分間遠心分離します。上澄み液をデカントして廃棄し、吸収紙でプレートを軽くたたきます。
   12. 手順 5.1.11 を繰り返します。
   13. ウェルあたり50 μLの固定液(キットに付属)を加え、ピペットで混合してから、プレートを室温の暗所で10分間インキュベートします。
   14. キットに付属の1x透過洗浄バッファー(PW)を150 μL加え、ウェルを蓋で覆います。
       注:10 mLの1x PWバッファーを調製するには、1 mLの10xパーマバッファーを10 mLのdH₂Oで希釈します。
   15. プレートを1,400 × g で4°Cで5分間遠心分離します。上澄み液をデカントして廃棄し、吸収紙でプレートを軽くたたきます。
   16. 1x PWを200 μL添加し、1,400 × g で4°Cで5分間遠心分離します。上澄み液をデカントして廃棄し、吸収紙でプレートを軽くたたきます。
   17. 細胞内染色の場合は、ウェルあたり25 μLの細胞内染色マスターミックス(抗ヒトKi-67 mAb)を追加します。よく混合し、プレートを4°Cまたは暗所の氷上で30分間インキュベートします。
       注:単一ウェルの細胞内染色マスターミックスを調製するには、1 μLのKi-67 mAbを24 μLの1x PWに加えます。細胞内染色マーカーは、共培養16日目の細胞を処理する場合にのみ使用されます。細胞内染色は、PBMC、ナイーブリンパ球、単球、およびナイーブMoDCの処理中に行われません。
   18. インキュベーション後、200 μLの1x PWを各ウェルに加えます。ピペットで混合し、1,400 × g で5分間遠心分離します。上澄み液をデカントして廃棄し、吸収紙でプレートを軽くたたきます。
   19. 200 μLのFACSバッファーを加え、1,400 × g で5分間遠心分離します。上澄み液をデカントして廃棄し、吸収紙の上でプレートを軽くたたきます。
   20. 細胞ペレットを200 μLのFACSバッファーに再懸濁し、各ウェルの内容物を別々の滅菌フローサイトメーターチューブに移します。ウェルあたり300 μLのFACSバッファーを使用して、残留細胞を収集します。これで、細胞はフローサイトメトリー分析の準備が整いました。
2. フローサイトメーターでサンプルを実行
   注:サンプルは、製造元のマニュアルに従って、フローサイトメーター(488 nm、638 nm、および405 nmレーザーを使用)で実行されました。³⁵.プロトコルの詳細、トラブルシューティング、およびカスタマイズについては、マニュアルを参照してください。
   1. サンプルを読み取る前後に定期的なクリーニング手順を実行します。
      注意: 機器にチューブをロードしている間は、位置をスキップしないでください。
      1. 洗浄サイクルには、合計4本のチューブを使用し、最初のチューブにはフロー洗浄試薬が含まれ、残りの3本のチューブにはdH₂Oが含まれます。各チューブには3mLがあります。クリーニング実行中は、側方散乱(SSC)の265 Vに対して前方散乱(FSC)の330 V未満でチューブあたり100,000イベントをキャプチャすることにより、約1分間の中程度の流量でデータを取得します。
         注意: クリーニング中に破片やセルラーイベントを報告しないでください。このような場合は、クリーニング手順を再度実行してください。サンプルを実行する場合は、正確な読み取りが保証されるため、データを取得する前に、すべてのサンプルが均質な懸濁液になっていることを確認してください。
   2. サイトメーターを接続して電源を入れるには、タイトルバーの左隅にある アプリケーションボタンをクリックします 。 アプリケーションの ドロップダウンメニューから、サイト メトリーオプションを選択し、 電源オンオプションをクリックします。
      注: アプリケーションの ドロップダウンメニューから、[ 開く ]オプションを使用すると、事前にプログラムされたアッセイを参照でき、[新しいプロトコル]オプションを使用すると、ユーザーは 新しいプロトコル を作成できます。
   3. 最初に 、陰性対照 サンプルをマルチチューブホルダーにロードします。 [新しいプロトコル]を選択し、ワークスペース/画面の左側にある ワークリスト を確認します。
   4. ワークリストで、マルチチューブホルダー内のサンプルの位置を定義し、サンプルに名前を付け、識別用のプロトコルを指定します。
   5. ワークスペースの左側にある ハードウェアパネル から、 検出器 (FSC、 SSC、および10の蛍光範囲)、光電子増倍管の 電圧(V )と ゲイン 、 信号の面積-高さ-幅(AHW)などの複数のパラメーターを調整および選択します。
      注:検出器の次の設定は、使用した実験と機器に基づいて選択されました: FSC-AHW:AHW、V:270、G:5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITCデキストラン)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700) - AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
   6. タイトルバーの下にある機器取得コントロールパネルから、検出する流量(中)、時間(5分)、およびイベント(手順5.2.8を参照)のオプションを調整します。Acquire Singleオプションをクリックすると、機器がサンプルを描画/実行し、検出されたイベントのリアルタイムプレビューを表示できます。
   7. リアルタイムプレビューから、 蛍光の閾値 (電圧 と ゲイン)と細胞サイズを調整して、最終的に細胞の破片を排除しながら目的の 細胞 集団の周りにゲートを描画します。
      注:FSCは、サイズに基づいて細胞を区別するのに役立つため、ユーザーは単球やリンパ球などの免疫系の細胞を区別できます。単球はリンパ球と比較して大きく、より高いFSC強度を示します。
   8. 合計約 5,000の生MoDC、50,000の生リンパ球、および50,000の 生単球イベントを取得します。
   9. ネガティブコントロールサンプルを参照してすべてのパラメータが調整されたら、[ 停止]をクリックしてプロトコルを保存します。
   10. 次に、すべてのサンプルをマルチチューブローダーにロードします。ワークリストで各サンプルを定義し、ネガティブコントロールを参照して調整されたパラメータを実験内のすべてのサンプルに適用します。[ 取得 ] オプションをクリックして、実験内のすべてのサンプルを連続して実行できるようにします。
   11. すべてのサンプルからのデータが取得されたら、シーケンシャルバイパラメトリックおよびモノパラメトリックヒストグラムの生成を可能にする適切なデータ分析ソフトウェアを使用して、保存して読み取り可能なデータに変換します。

6. メッセンジャーRNA(mRNA)発現解析

1. RNA抽出
   注:抗原パルスMoDCリンパ球共培養(特異的)、非抗原パルスMoDCリンパ球共培養(非特異的)、MoDCを含まないリンパ球培養(コントロール)、およびナイーブリンパ球(共培養前に分離されたCD14^- 細胞)から総RNAを抽出します。RNA抽出には、RNaseフリーの水を使用してエタノールを調製します。抽出キットと試薬の詳細については、 材料表 を参照してください。
   1. MoDCリンパ球共培養プレート(~1 ×^{10 6} 細胞/mL)から1 mLの細胞懸濁液をピペットを使用して滅菌1.5 mL滅菌チューブに移し、500 × gで10分間遠心分離します。
   2. ELISAのために上清を保存します。細胞ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、15 mLチューブに移します。1 mLのPBSを使用して残留細胞を収集します。
   3. 500 × gで10分間遠心分離します。
      注:キットに付属の溶解バッファーを使用して細胞溶解が行われるまで、すべてのサンプルは生細胞として繊細に取り扱う必要があります。細胞死はRNaseを放出し、下流での定量に必要なRNAテンプレートを迅速に加水分解します。RLTバッファーは、RNaseを阻害する溶液中の細胞を溶解します。
   4. 350 μLの溶解バッファーを各空のウェルに加え、2〜3分間インキュベートして、前のステップで回収されなかった接着細胞を溶解します。
   5. ステップ6.1.3の遠心分離が完了したら、上清を廃棄し、細胞ペレットをステップ6.1.4で添加した350 μLの溶解バッファーと混ぜ合わせます。
      注:この時点で、チューブを-80°Cで保存するか、RNA抽出を進めることができます(次の手順)。
   6. ステップ6.1.5で70%エタノール350μLをライセートにピペットします。サンプルあたりの最終容量は700μLです。
   7. 抽出カラムを2 mLの収集チューブ(キットに付属)に挿入します。
   8. 抽出カラムごとに700 μLのサンプルを移し、10,000 × g で15秒間遠心分離します。収集チューブ内のフロースルーを廃棄し、スピンカラムに戻します。
   9. 抽出カラムに、350 μLのストリンジェントな洗浄バッファー(キットに付属)を加え、10,000 × g 以上で15秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
   10. サンプルあたり80 μLのDNase Iインキュベーションミックスを抽出カラムのメンブレンに加え、20〜30°Cで15分間セットします。
       注:サンプルごとにDNase Iインキュベーションミックスを調製するには、10 μLのDNase Iストック溶液を70 μLのDNaseバッファーに加え、最終容量80 μLにします。 チューブを数回反転させて完全に混合し、遠心分離機で短時間回転させます。
   11. 抽出カラムを350 μLのストリンジェントな洗浄バッファーで洗浄し、続いて10,000 × g で15分間遠心分離します。遠心分離後に収集チューブ内のフロースルーを廃棄します。
   12. 抽出カラムを毎回500 μLのマイルド洗浄バッファーで2回洗浄し、10,000 × g で15秒間遠心分離し、2回目に2分間洗浄します。各遠心分離後にフロースルーを廃棄します。
   13. カラムを最高速度で1分間遠心分離してメンブレンを乾燥させ、回収チューブを廃棄します。
   14. 抽出カラムを新しい1.5 mL収集チューブに入れます。
   15. RNaseフリー水50 μLをカラムメンブレンにピペットで移し、室温で3〜5分間インキュベートします。
       注:RNA濃度が100 ng未満の場合は、溶出量を30 μLに減らし、最初の溶出からの生成物を使用して抽出カラム膜を再溶出し、最終生成物を濃縮します。
   16. 10,000 × g で1分間遠心分離し、RNAを溶出します。
   17. 0.5〜2 μLのサンプルを使用して260 nmの吸光度を検出することにより、RNAの濃度を測定します。RNaseフリーの水を使用して、最終RNA濃度を0.1〜1 μg/μLに調整します。
   18. 後で使用するために、RNAアリコートを-80°Cで保存してください。
2. 相補的DNAの合成
   1. キットに付属の製造元のプロトコルに従って、抽出したテンプレートRNAから相補的DNA(cDNA)を合成します(詳細については、 材料の表 を参照してください)。
      注:使用した試薬と容量の概要を表 1 と 表2に示します。完全なプロトコルは、 補足ファイル1に詳述されています。
3. リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応
   1. qPCRの場合は、cDNAサンプルをトリプリケートで実行します。表3に示すように、GAPDH遺伝子を参照して特異的プライマーセットを用いてKi−67およびIFN−γについてのウシmRNA転写レベルを定量化する。
      メモ: 完全なプロトコルについては、 補足ファイル 1 を参照してください。

7. 酵素結合免疫吸着アッセイ

1. 分泌タンパク質を多く含む培養上清を採取し、ELISA法によるIFN-γの定量に処理する。
   注意: キットの使用の詳細については、 材料の表 を参照してください。完全なプロトコルは、 補足ファイル1に詳述されています。

8.統計分析

1. データを分析し、商用ソフトウェアを使用して実験計画のグラフィカルな図を作成します。比較分析には対応のないノンパラメトリック検定を使用します。0.05< P 値は統計的に有意であると考えてください。

この方法論は、in vivo研究を実施する前に候補ワクチン抗原を評価するためのウシMoDCのin vitro生成について説明しています。図1は、ウシMoDC生成の実験スキームと、インビトロアッセイへのMoDCの適用を示しています。磁気ベースの細胞選別技術を使用すると、50 mLの牛の血液から以前に分離された採取されたPBMCから約2,600万個のCD14+筋細胞を収集することができました。CD14+単球を含まない溶出細胞画分はリンパ球が豊富であり、ナイーブCD4+およびCD8+ T細胞の供給源として使用されました(CD14-リンパ球細胞画分)。

ナイーブ単球画分は、CD14細胞染色およびフローサイトメトリー後に観察されたように、98%のCD14+ 単球細胞で構成されていました(図2A、B)。精製されたナイーブ単球細胞を、3%サイトカインカクテル(GM-CSFおよびIL-4)の存在下で培養に供すると、その後5日間のインキュベーションで、DC様表現型に分化した。2600万個のCD14+ 単球の出発培養から、5日間のインキュベーション後に合計約1200万個のMoDCを得ることができました。ナイーブMoDCは、FITCデキストランのフローサイトメトリー分析を使用して観察されたように、機能的に抗原を取り込むことができました(図3)。さらに、ナイーブMoDCは、MHCクラスIIおよび共刺激CD86およびCD40細胞表面マーカーの発現を評価することによって表現型的に特徴付けられ、DC様表現型を検証しました(図4)。

ナイーブMoDCの抗原パルス刺激は、不活化RVの存在下で2日間培養することによって達成されました。ナイーブリンパ球(CD14− 細胞画分)の活性化は、抗原パルスMoDCリンパ球とその後のIL-2の補給との共培養によって達成された。9日目のMoDCリンパ球共培養では、RVパルスMoDCに形態学的変化が見られ、MoDC成熟の特徴である樹状突起の伸長が見られました(図5)。14日目に、リンパ球の活性化は、同じ動物から新たに産生されたRVパルスMoDCを添加して共培養を再刺激することによって増強されました。

非パルスMoDCリンパ球共培養と比較して、パルスMoDCリンパ球共培養の16日目に、CD4+およびCD8+ T細胞の両方でKi-67およびCD25活性化マーカーがアップレギュレーションされたことにより、リンパ球増殖の有意な増加(p < 0.01)が実証されました(図6)。成熟RVパルスMoDC共培養由来のCD8+ T細胞は、非特異的群と比較して、Ki-67の8倍のアップレギュレーション(p < 0.01)を示しました(図7A)。同じ共培養におけるCD4+ T細胞は、対照と比較してKi−67において7倍の増加(p < 0.01)を示した(図7B)。これは、RVプライミングMoDCがRV抗原をナイーブリンパ球にうまく提示し、その後、生きている動物で起こるのと同様に、in vitro条件でそれらを活性化する能力を示しています。フローサイトメトリーを用いた細胞の解析に加えて、共培養はqPCRおよびELISAにも供され、RNA転写(Ki-67およびIFN-γ)および細胞外分泌(IFN-γ)を用いたRV特異的リンパ球活性化をそれぞれ定量化しました(図8)。これらの追加の検出方法は、フローサイトメトリーの結果をさらに検証するための確認テストとしても使用できます。qPCRによって実証されたKi-67およびIFN-γのRNA発現およびELISAによって示されたIFN-γレベルは、非特異的処理群と比較して、抗原特異的共培養において同様の増加パターンを示し、リンパ球増殖を示した。したがって、qPCRおよびELISAの結果は、フローサイトメトリーの結果と相関した。qPCRは、GAPDHをキャリブレーターとして使用したすべての共培養において、IFN-γ発現が>30%増加し、Ki-67発現が>5%増加したことを示しました(図8A、B)。非特異的処理群と比較して、RVパルスMoDCリンパ球共培養からの培養上清を用いてELISAで有意に高い濃度の分泌IFN-γ(**p > 0.01)を測定しました(図8C)。

図1:ウシMoDCベースの インビトロ アッセイの実験デザイン。 (A)ウシPBMCからのCD14+ 単球およびCD14- リンパ球細胞画分の採取および細胞選別。 牛の血液は、PBMCを収集するために密度勾配遠心分離によって処理され、続いて免疫磁気細胞分離カラムを使用した磁気ベースの細胞選別が行われ、その後、補充されたRPMI 1640培地で採取されたCD14+ ナイーブ単球細胞画分が培養されます。(B)5日間のインキュベーションおよびMoDCリンパ球共培養を伴う3%サイトカインカクテル(GM-CSF + IL-4)を用いたMoDCの産生。0日目に、単球をサイトカインカクテルの存在下で培養し、48時間インキュベートして分化を誘導します。2日目に、培養物を同じサイトカインカクテルで再刺激し、続いて72時間インキュベートし、ナイーブMoDCを産生します。5日目に、ワクチン抗原(狂犬病ワクチン)をナイーブMoDC細胞培養物に添加し、続いて48時間インキュベートする。7日目に、抗原パルスMoDCとナイーブリンパ球(CD14- 細胞画分)との共培養を行い、続いてインキュベーションを行います。9日目に、IL-2が共培養に追加されます。14日目に、活性化/プライミングされたリンパ球の濃縮/再刺激は、抗原パルスMoDCの添加によって行われ、続いて48時間のインキュベーションが行われます。最後に、16日目に、リンパ球増殖アッセイのために細胞および培養上清を回収する。略語:MODC =ウシ単球由来樹状細胞;PBMC =末梢血単核細胞;GM-CSF =顆粒球-マクロファージ-コロニー刺激因子。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:抗CD14結合マイクロビーズを使用してPBMCから採取したウシCD14+ 単球の形態と純度。 (A)完全培養液中で37°Cで4時間インキュベートしてマイクロビーズを除去し、ポリリジンコーティングされたスライド上に固定し、修飾ギムザ染色剤で染色したウシ単球の形態。スケールバー = 50 μm。 (B)抗CD14抗体(赤)およびFITC結合マウスIgG1アイソタイプコントロール抗体(緑)を使用して観察された98.6%の純度レベルで溶出されたCD14+ 細胞画分を示すフローサイトメトリーヒストグラム。略語:PBMC =末梢血単核細胞;FITC cont = フルオレセインイソチオシアネートコントロール。この図は、Kangethe et al., 201811から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3: in vitroで生成されたウシMoDCのエンドサイトーシス活性。 ナイーブMoDCの5日目までのトレーサー分子(FITCデキストラン)の取り込みを示すフローサイトメトリーヒストグラム。MoDCはトレーサー分子(青色)を用いて37°Cで60分間インキュベートし、MoDCはトレーサー分子(灰色)をバックグラウンドコントロールとして氷上でインキュベートした。略語:MODC =ウシ単球由来樹状細胞;FITC=フルオレセインイソチオシアネート。この図は、Kangethe et al., 201811から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4: in vitroで生成されたウシMoDC特異的細胞表面マーカーの表現型。 (A)MoDCのゲーティング戦略、および(B)抗ヒツジMHC II mAb、抗ウシCD86 mAb、抗ウシCD40 mAbを含む3つの異なるDC特異的mAb(青色)で染色した5日目のナイーブMoDCのフローサイトメトリーヒストグラム。すべて対応するアイソタイプコントロール(赤)と比較した。略語:DC =樹状細胞;MODC = ウシ単球由来DC;MHC II = 主要組織適合遺伝子複合体II.この図は、Kangethe et al., 201811から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:MoDCリンパ球共培養中の in vitro産生MoDCの成熟の兆候。 MoDCリンパ球共培養9日目の倒立顕微鏡による抗原パルスMoDCによる特徴的な伸長樹状構造の観察。(A)共培養リンパ球の非常にコンフルエントな領域内の成熟MoDC。(B)成熟MoDCは、共培養中のリンパ球が少ない領域で容易に区別できます。スケールバー= 50μm。略称:MODC = ウシ単球由来樹状細胞。この図は、Kangethe et al., 201811から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:MoDCリンパ球共培養におけるリンパ球によるKi-67およびCD25発現に対するドットプロットに採用されたシーケンシャルゲーティング戦略。 (A)MoDCリンパ球共培養16日目から採取した細胞の完全なゲーティング戦略。(B)CD4+依存性リンパ球由来のKi−67発現を、(C)CD8+リンパ球由来のFMO対照(mAbなし)およびマウスIgG1−kアイソタイプ対照mAbと比較した。ゲート型(D)CD8+および(E)CD4+リンパ球上のCD25発現をマウスIgG1アイソタイプ対照mAbと比較した。治療群は、RVパルスMoDCと共培養されたリンパ球を特異的に表し、対照群はMoDCの非存在下で培養されたリンパ球を表す。略語:MODC =ウシ単球由来樹状細胞;FMO =蛍光マイナス1;RV =狂犬病ワクチン。この図は、Kangethe et al., 201811から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:抗原によるプライミング後のCD4+およびCD8+リンパ球によるKi-67およびCD25発現のフローサイトメトリーデータ解析。 共培養16日目からのKi−67およびCD25発現。治療群(特異的)は、RVパルスMoDCで培養されたリンパ球として定義されます。非特異的グループは、非抗原パルスMoDCで培養されたリンパ球に対応します。対照群は、MoDCなしで培養されたリンパ球に対応します。横棒は、6つのテクニカル反復の平均を表します。(a)CD8 T細胞によるKi-67マーカーの細胞内発現および(B)CD4 T細胞による。(C)CD8 T細胞によるCD25マーカーの細胞表面発現および(D)CD4 T細胞による。略語:MODC =ウシ単球由来樹状細胞;RV =狂犬病ワクチン。この図は、Kangethe et al., 201811から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:狂犬病ウイルス抗原でプライミングされたMoDCによるTh1マーカー(IFN-γおよびKi-67)の活性化(qPCRおよびELISAによって検出)。 6回の技術反復で1匹の動物から取得したデータ。水平バーは平均を表します。3つのPCR複製は、 GAPDH 参照遺伝子で正常化した後のナイーブリンパ球と比較して倍率変化として示されています。(A) IFN-γ 式、(B)Ki-67 発現。(C)ELISAで検出された3つの処理群間の培養上清中のIFN-γ分泌の比較。特定のグループは、RVパルスMoDCで培養されたリンパ球として定義されます。非特異的グループは、非抗原パルスMoDCで培養されたリンパ球に対応します。対照群は、MoDCなしで培養されたリンパ球に対応します。略語:MODC =ウシ単球由来樹状細胞;RV =狂犬病ワクチン。この図は、Kangethe et al., 201811から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:マスターミックス組成物(RNAプライマーミックス)。

表2:2x PCR反応ミックス。 略語:RT =逆転写酵素;DTT = ジチオスレイトール。

表3:増幅に用いたプライマーセット50。

表 4: qPCR マスターミックス

表5:IFN-γ標準希釈シリーズ

補足ファイル1:相補的DNAの合成、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)のためのプロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S1:サイトカインカクテルの濃度を変え、3日間または5日間の培養におけるMoDCの抗原取り込み能。 GM-CSFおよびIL-4を含むサイトカインカクテルの異なる濃度(5%w/vおよび3%w/v)を3日間または5日間の培養で試験し、高性能抗原取り込みMoDC(トレーサー分子FITCデキストランを使用)を生成するための最良の組み合わせを評価しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:ジプテリアトキソイド(DT)およびブルータングウイルス血清型4(BTV)によるCD4およびCD8プライミング。16日目に(A)DTおよび(C)BTVでパルスした後のCD8細胞によるKi−67の発現、および(B)DTおよび(D)BVTでパルスした後のCD4細胞によるKi−67の発現。DTおよびBVT(特異的)、(C、D)CD40L、および非特異的プライミングおよび対照処理でパルスした培養物との比較を行った。水平バーは平均を示します。*p < 0.05, **p < 0.01 マン・ホイットニー検定による。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は開示する利益相反を持っていません。