方法論記事

Coherent ラマン顕微鏡:計装からアプリケーションまで

DOI：

10.3791/64882

⸱

2023年1月20日

1Department of Chemistry, University of Washington

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

議論された記事:

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. 化学イメージングのためのハイパースペクトル誘導ラマン散乱とコヒーレント反ストークスラマン散乱顕微鏡の直接比較.視覚化された実験のジャーナル。(182)、E63677(2022)

De la Cadena, A. et al. 広帯域刺激ラマンに基づくマルチプレックス化学イメージング

散乱顕微鏡。視覚化された実験のジャーナル。(185)、E63709(2022)。

Shi, L., Wei, M., Min, W. ラマン色素による高度に多重化された組織イメージング.視覚化された実験のジャーナル。(182)、E63547(2022年)。

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. 組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング。視覚化された実験のジャーナル。(180)、E63484(2022)。

Miao, K., Lin, L. E., Qian, C., Wei, L. 膨潤組織の振動イメージングと分析により可能になるラベルフリー超解像イメージング。視覚化された実験のジャーナル。(183)、E63824(2022)。

Yuan, Y., Lu, F.刺激ラマン散乱顕微鏡によるタイムラプス生細胞イメージング用のフレキシブルチャンバーです。視覚化された実験のジャーナル。(186)、E64449(2022年)。

Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S.2光子蛍光と刺激ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のin vivoイメージング。視覚化された実験のジャーナル。(178)、E63411(2021)。

編集記事

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去10年間で、コヒーレントラマン顕微鏡(CRM)を細胞および組織イメージングに適用することへの関心が急増しています1,2。CRMは、コヒーレント反ストークスラマン散乱(CARS)顕微鏡と誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡という2つの一般的なバリエーションを備えた強力な化学イメージング技術です。SRSは、非ラマンバックグラウンド干渉の影響が少なく、濃度3に線形依存性があるため、CARSと比較してますます人気が高まっています。CRMは、ラマン分光法と同様の分子振動情報を取得しますが、取得速度が大幅に向上します4。これは、高いピーク強度を持つ一対のパルスレーザーによるコヒーレント振動励起によって達成されます。CRMは、高い空間的および時間的分解能で空間分解能の化学マッピングを提供するため、がん診断、脂質代謝、細胞代謝、薬物輸送、その他多くの分野で重要な用途が見出されています5,6,7,8。ただし、この技術の広範な採用を妨げる大きなボトルネックの 1 つは、技術的な複雑さと標準化されたプロトコルの欠如です。市販のレーザーや顕微鏡はすでに入手可能ですが、現在この分野で使用されているほとんどすべてのシステムには、レーザー、光学、顕微鏡、検出器のさまざまなレベルのカスタマイズが含まれており、この分野への参入やこの技術の採用に関心のある研究者にとって大きな障壁となっています。アクセスの欠如は、生物学的応用をさらに妨げます。このメソッドコレクションの目的は、機器、新しいイメージングアプローチ、およびin vitro/in vivo細胞または組織イメージングアプリケーションに関する詳細な例とガイダンスを提供することです。この分野の専門家からの7つの出版物をここに要約しました。

Clarkらは、感度、空間分解能、およびスペクトル分解能の観点から、ハイパースペクトルSRSとCARSを並べて比較しています9。どちらの技術も、スペクトルチャープされた広帯域フェムト秒レーザーを使用して狭帯域ラマン分解能を達成する一般的に採用されているアプローチであるフェムト秒レーザーのスペクトル集束で実装されます。直接比較することで、検出の違いを評価し、さまざまな化学イメージングアプリケーションに適したモダリティを選択することができます。

De la Cadena らは、広帯域 SRS 画像を迅速に取得できる新しいマルチプレックス SRS 法を発表しました10.この技術は、カスタム差動マルチチャンネルロックインアンプ検出に基づいており、最大32チャンネルの同時検出が可能です。さらに、詳細なノイズ特性評価が示され、レーザーノイズを除去するためのバランス検出方法が実証されます。このプロトコルは、マルチプレックスSRSシステムの構築に関心のあるユーザーに実用的なガイダンスを提供します。

SRSイメージングにおける高度に多重化されたラマン色素の使用を実証しています11。プレレゾナンス増強により、SRSが標準的な免疫蛍光に匹敵する感度を提供できることを実証しました。この方法は、従来の免疫蛍光法におけるスペクトル分解可能なチャネルの限界を回避し、多くのタンパク質を同時にモニタリングし、それらの相互作用を研究することができます。この強力な方法の採用を促進するために、サンプル処理とラマン色素染色に関する詳細なガイダンスが提供されます。

SRSと膨張顕微鏡を組み合わせた超解像イメージング技術である、腫れた組織の振動イメージングと分析(VISTA)を発表します12。VISTAは、蛍光イメージングに関連する障害を回避し、78nmまでの空間分解能で生体サンプルでラベルフリーの超解像体積イメージングを実現します。さらに、深層学習アルゴリズムを利用して、細胞や脳組織内のタンパク質凝集体を含む多成分セグメンテーションを実現します。

Espinoza et al. 組織診断アプリケーションのためのタンパク質と脂質のリアルタイム 2 色 SRS イメージングの使用を紹介します13.2色SRSイメージングは、病理学アプリケーション用のH&E相当画像を生成できます。このプロトコルは、同時2色SRSイメージングのための直交変調技術とスペクトルフォーカシングの実装の詳細を記述します。2色SRS画像から疑似H&E画像への変換もマウス脳組織で実証され、組織診断の応用例が示されています。

Yuan et al. 生細胞の長期 SRS イメージングのための柔軟なチャンバー システムを発表しました14.既存の生細胞観察チャンバーのほとんどは、明視野および蛍光イメージング用に設計されています。これらは、高いNA対物レンズとコンデンサーを必要とするため、SRS検出と互換性がありません。著者らは、一定の温度、CO2、および湿度を維持したフレキシブルチャンバーを使用した24時間のタイムラプスSRSイメージングを実証しました。

最後に、Wuらは、in vivo 二光子蛍光(TPEF)とSRSイメージングを同時に実証しています15。2つの別々のレーザーシステムを組み合わせて、両方のイメージングモダリティで最適な感度を実現し、補完的な情報を提供します。 インビボ 組織のSRSイメージングには、偏光解除された後方散乱光のエピ検出が必要なため、特有の課題があります。このプロトコルでは、TPEF-SRS顕微鏡の最適なセットアップの詳細と、マウスの脊髄の in vivo イメージングにTPEF-SRS顕微鏡をどのように使用できるかについて説明します。

この出版物のコレクションは、CRM インストルメンテーションと技術的進歩における現在の最先端を表しています。メソッド開発とアプリケーションの両方に関心のある研究者は、セットアップを比較し、独自のシステムを構築または最適化するためのベンチマーク(感度、分解能など)を確立するのにこのコレクションが役立ちます。これらのプロトコルで提供されるガイドラインとベストプラクティスは、既存および将来の in vitro および in vivo アプリケーションに情報を提供します。CRMテクノロジーの大規模な採用は、キーで革新的なアプリケーションと完全なCRMソリューションの商業化をまだ待っています。それにもかかわらず、再現性と信頼性を確保し、CRM16 のより広範な実装を促進するには、イメージング アプローチとベンチマークの標準化が不可欠です。

CRMの分野は急速に成長しています。感度、特異性、分解能の限界を押し広げる技術開発により、この技術は新たな領域に押し上げられ続けています。たとえば、SRS の空間分解能は回折限界17,18 を超え始めています。電子プリ共鳴SRSの感度は、現在、蛍光19の感度に近づいています。蛍光と比較して、CRM には明確な利点があります。例えば、重水素トレースの使用により、細胞内分解能での小分子の代謝動態のin vivo研究が初めて可能になりました20。小さなタグにより、24以上の標識ターゲット21の高度に多重化されたラマン検出を行うことができる。人工知能の進歩により、CRM の高い情報量と分子固有の特徴を活用して、微妙な空間的およびスペクトル的特徴の違いを持つオブジェクトをセグメント化および分類することにより、CRM の新しい機能が可能になります22。CRM におけるこれらの技術的進歩は、生物学的イメージングと生物医学イメージングの両方におけるアプリケーションを加速し、拡大する準備ができています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、国立衛生研究所(NIH R35 GM133435)からの財政的支援とイーライリリー若手研究者賞

に感謝します。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  2. Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
  3. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: Beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  4. Freudiger, C. W., et al. Label-Free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  5. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  6. Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).
  7. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  8. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  9. Clark, M. G., Brasseale, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct comparison of hyperspectral stimulated Raman scattering and coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for chemical imaging. Journal of Visualized Experiments. (182), e63677(2022).
  10. Dela Cadena, A., et al. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (185), e63709(2022).
  11. Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-Multiplexed tissue imaging with Raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547(2022).
  12. Miao, K., Lin, L. E., Qian, C., Wei, L. Label-Free super-resolution imaging enabled by vibrational imaging of swelled tissue and analysis. Journal of Visualized Experiments. (183), e63824(2022).
  13. Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-Time, two-color stimulated Raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (180), e63484(2022).
  14. Yuan, Y., Lu, F. A flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (186), e64449(2022).
  15. Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63411(2021).
  16. Manifold, B., Fu, D. Quantitative stimulated Raman scattering microscopy: Promises and pitfalls. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 269-289 (2022).
  17. Qian, C., et al. Super-resolution label-free volumetric vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 3648(2021).
  18. Graefe, C. T., et al. Far-Field super-resolution vibrational spectroscopy. Analytical Chemistry. 91 (14), 8723-8731 (2019).
  19. Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
  20. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  21. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
  22. Manifold, B., Men, S., Hu, R., Fu, D. A versatile deep learning architecture for classification and label-free prediction of hyperspectral images. Nature Machine Intelligence. 3, 306-315 (2021).

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Hyperspectral Stimulated Raman ScatteringCoherent Anti Stokes Raman ScatteringChemical ImagingMultiplex Chemical ImagingStimulated Raman Scattering MicroscopyTissue ImagingVibrational ImagingLive cell ImagingIn Vivo ImagingReal time ImagingSuper resolution Imaging

関連記事