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方法論記事

重水素(2H)標識法を用いたヒトにおけるin vivo脂肪組織動態の測定

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DOI:

10.3791/64883

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2023年7月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

この記事について

サマリー

ここで提示するのは、重水素(2H)標識法を使用してヒトのin vivo脂肪組織動態を測定するためのプロトコルです。

要約

白色脂肪組織は、全身のエネルギー恒常性を維持するために必要な高度に可塑性のある器官です。脂肪組織の質量と脂肪の質量または分布の変化は、脂肪細胞とトリアシルグリセロールの合成と分解(すなわち、ターンオーバー)の変化によって調節されます。脂肪形成が肥満および関連疾患の病因に関与しているため、皮下脂肪組織の拡張(すなわち、肥大と過形成)および代謝回転の方法と大きさが代謝の健康に影響を与える可能性があることを示唆する証拠があります。脂肪代謝回転が人間の健康に果たす潜在的な役割にもかかわらず、脂肪細胞の生体内動態に関する知識は不足しています。これは、部分的には、脂肪組織中の細胞の代謝回転速度が遅いことと、in vivoでそれらの代謝前駆体を直接標識することの実際的な複雑さによるものです。ここでは、重水素(2H)標識水の消費を通じて、ヒトの生体内脂肪動態と代謝回転率を測定する方法について説明します。プレ脂肪細胞および脂肪細胞のDNAのデオキシリボヌクレオチド部分に2Hを取り込むことで、細胞の形成と死(脂肪代謝回転)を正確に測定できます。全体として、これはin vivo脂肪動態を測定するための革新的なアプローチであり、他のin vitro評価とは大きく異なります。

概要

肥満は、過剰な白色脂肪組織(AT)を特徴とする疾患であり、II型糖尿病および心血管疾患の発症の重大な危険因子です1。白色ATは、トリアシルグリセロール(TG)の形でエネルギーを蓄える高度に可塑性な器官であり、代謝恒常性2に不可欠です。白色ATは、成人期に拡大、縮小、およびリモデリングする能力を保持し3、AT質量は、脂肪細胞体積の動的変化(TG合成および分解による )、前脂肪細胞の増殖および分化 による 継続的な脂肪細胞形成(すなわち、過形成または脂肪形成)、および脂肪細胞死4によって決定されます。

証拠は、皮下AT代謝回転(例えば、脂肪細胞の形成と死亡)と心血管代謝の健康との間に重要な関連性があることを示唆しており5,6,7,8、そして肥満関連障害の病因における脂肪生成の役割は議論の余地があります4。しかし、ヒトにおけるin vivo ATの代謝回転については、ATの細胞成分の代謝回転速度が遅いことや、代謝前駆体をin vivoで直接標識することの複雑さなど、ほとんど知られていません。in vitro法はいくつかの洞察を提供してきましたが、これらのアプローチはATの自然環境内での包括的なin vivo評価を提供していません。

ヘラーシュタイン研究室9は、重水(2H2O)からの安定同位体重水素(2H)をAT(図1)10に取り込むことにより、in vivoATの代謝回転を評価する方法を開発した。マウスとヒトで検証されたこのプロトコルには、体水の2H濃縮を増加させるための2H2Oの初期ランプアップが含まれ、その後、安定したプラトーに近い濃縮値を維持するための適切な毎日の摂取が含まれます。2H2Oからの2H(すなわち、重水)は、脂肪細胞のDNA中のデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース(dR)部分に取り込まれ、質量分析および質量同位体分布分析(MIDA)の適用により、DNA中の同位体濃縮を測定する9,10,11 .DNA中のプリンデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分を安定同位体前駆体で標識することは、ピリミジンヌクレオチド塩基部分(例えば、3H-チミジンまたはブロモ-デオキシウリジン)による標識を含む方法など、従来の方法に比べていくつかの利点があります。注目すべきは、DNAの複製における塩基の内因性再取り込み、特にピリミジンの内因性再取り込みが、以前には標識取り込みの解釈を混乱させなかったことである12。さらに、安定同位体標識をdRに組み込んでも、3H(トリチウム)やブロモ-デオキシウリジンなどの放射性または遺伝毒性物質が組み込まれるのとは対照的に、遺伝毒性はありません。したがって、この手法を動物モデルや人間に長期間使用しても安全です。

2H標識DNA合成の測定は、細胞分裂のS期を通る細胞の通過を示し、新たに形成された前脂肪細胞および脂肪細胞(前脂肪細胞分化による)または脂肪生成13を同定する。代謝回転が速い細胞(単球など)は、DNAを迅速に置換し、2H濃縮でプラトーに達するため、アッセイの内部参照が提供されます。脂肪細胞からのDNAの2H濃縮と単球(参照細胞)のそれ、または統合体の2H2O測定の比により、新たに合成された脂肪細胞の割合を計算することができます。ここでは、このプロトコルは、2H代謝標識プロトコルを介してヒトにおけるインビボ脂肪細胞代謝回転(脂肪形成)速度を測定する方法を記載しており、これには、負の免疫選択を介して脂肪細胞を精製し、前脂肪細胞集団を濃縮する洗練された技術を含む14。

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プロトコル

ペニントン生物医学研究センターの治験審査委員会 (IRB) は、すべての手順を承認し (#10039-PBRC)、すべての被験者は書面によるインフォームド コンセントを提供しました。

1. 8週間 2H2O-ラベリング期間

  1. 滅菌プラスチック容器に70%または99.9%の重水素標識水(2H2O)のアリコートを投与します。
  2. 参加者に、99.9% 濃縮 2H2O の 35 mL 用量または 70% 濃縮 2H2O の 40 mL 用量を 1 週 1 日 3 回 1 回 (プライミング期間) に飲み、2 週目から 8 週目に 1 日 35 mL または 50 mL を 1 日 2 回飲むように指示します。
    注:一過性のめまいまたはめまいは、 2H2O摂取の唯一の既知の悪影響であり、内耳の毛包によって知覚されるバルク水流の急激な変化に関連しています。.したがって、一過性めまいやめまいのまれな発生を避けるために、参加者に少なくとも ~2 時間間隔で用量を服用するように指示します15。同じ理由で、1回の投与を2倍にすることで、飲み忘れを補わないでください。上記のように(≥2時間間隔で)用量を投与すると、この副作用は人間の被験者(数百人の被験者の<1%)で非常にまれになります。.
  3. 採尿を通じて 2H2O摂取量への準拠を監視して、体水中の 2H濃縮を測定し、空のバイアルを毎週戻してカウントします。
    1. 活性炭とフィルターを使用して尿サンプルを洗浄します。
      1. 活性炭1mLを入れた10mLのチューブに8mLの尿を加えます。
      2. サンプルをロッカーに10分間置き、800 x g で5分間遠心分離して、木炭がチューブの底に移動するようにします。0.2 μmシリンジフィルターでサンプルをろ過します。
    2. 体内水分(尿)中の 2H2Oの濃縮度を同位体比質量分析(IRMS)で測定します。
      注: 2H2O濃縮は、ガスクロマトグラフィー-質量分析16、IRMSと組み合わせた高温変換元素分析装置(TC/EA)17、キャビティリングダウン赤外分光法(IRIS)18、または質量分析計に取り付けられたH/Device(例えば、IRMS)19を含む、異なる方法で分析することができる。
    3. 8週間の標識期間中に尿中で測定された平均 2H2O濃縮を使用して、前駆体 2H2O曝露と新たに合成されたAT細胞の割合を計算します(以下のセクション7およびセクション8を参照)。

注: 2H2Oラベリングプロトコルは、8週間のラベリング期間中、体水中の 2H濃縮を1.0%〜2.5%の範囲内でプラトーに近い状態に保ちます(図2)10。

2.ヒト被験者からの脂肪組織生検コレクション

  1. ポビドンヨード溶液で皮膚を洗浄した後、局所麻酔(例:2%リドカイン/ 0.5%ブピバカイン)を投与し、皮膚に~0.75cmの切開を行い、無菌条件下で針脂肪吸引技術 を介して 皮下AT生検を収集します13。
  2. 5 mLの室温(RT)1 M HEPES緩衝液(pH 7.3)を含む滅菌50 mLチューブを秤量します。すぐにATをHEPESバッファーのあるチューブに入れて処理します。
  3. ATが入った50mLチューブの重量を量り、重量を記録します。

3. 精製脂肪細胞の単離

  1. 1型コラゲナーゼ/HEPES(2 mg/mL)溶液を2 g/mL ATに加えます。
  2. ATを消化するには、37°Cで1時間振とう(100rpm)しながらウォーターバスでインキュベートし、無傷の大きなAT片がいくつか混ざり合った均質な混合物が得られるまで培養します。
  3. チューブを500 x g でRTで8分間遠心分離し、脂肪細胞と間質血管画分(SVF)を分離します。
  4. 上部の脂肪層(脂肪細胞)をやさしく取り除き、別のチューブに移します。チューブの底でペレット(SVF)を乱さないでください。
  5. 前述した14のように、免疫磁気細胞分離法を用いて脂肪細胞を精製する。
    注:この重要なステップは、造血細胞、内皮細胞、幹細胞など、細胞の回転が速い他の細胞タイプが浮遊脂肪細胞に付着し、測定値に影響を与える可能性があるため、脂肪細胞を「洗浄」するために行われます。
    1. ~400 μL の脂肪細胞を 5 mL チューブに入れて、免疫精製を陰性にします。
    2. FcRブロッキング抗体(100 μL/mL)を添加します。
    3. 内皮細胞(抗ヒトCD31;1:100)、造血細胞(抗ヒトCD45;1:400)、および間葉系幹細胞(抗ヒトCD34;1:100)のマーカーに対するビオチン化抗体のカクテルを脂肪細胞溶液に室温で15分間加えます。
    4. ビオチン選択カクテル(100 μL/mL)を脂肪細胞溶液に加え、よく混合し、室温で15分間インキュベートし、穏やかに傾け/回転させます。
    5. 磁性ナノ粒子をピペッティングで上下に混合し、脂肪細胞溶液に粒子(50 μL/mL)を加えてよく混合し、室温で10分間インキュベートし、緩やかに回転させます(10 rpm)。
    6. PBS/2% FBS/1 mM EDTAバッファーを脂肪細胞溶液に添加し、総容量1 mLにします。
    7. チューブを磁石に入れ、5分間放置します。
    8. 磁石を手に取り、1回の連続動作でチューブを含む磁石を反転させ、内容物を新しい5mLチューブに注ぎます。注ぐ間はチューブを叩かないでください。抗体に付着した細胞は磁性ナノ粒子に結合して除去されますが、免疫精製された脂肪細胞は保持されます。
    9. 精製した脂肪細胞を液体N2で急速凍結し、DNA抽出まで-80°Cで保存します。

4. 前脂肪細胞の単離

  1. 前駆脂肪細胞の濃縮集団を単離するには、SVF20の短期培養後にプラスチックに付着する能力を活用するためのプロトコルを採用します。
  2. 層流フードで、SVFペレットを赤血球溶解バッファー5mLに再懸濁し、室温で5〜10分間(十分に混合)し、800 x gで遠心分離します。上清を取り除き、ペレットをアルファ(α)MEM中の10%FBSに再懸濁します。
  3. 細胞をプラスチック培養皿に載せ、組織培養インキュベーターで37°C、5%CO2 雰囲気で8~12時間播種します。
  4. ~8-12時間後、層流フード内のPBSで培養プレートから非接着性細胞を穏やかに洗浄します。
  5. PBSを吸引した後、0.25%トリプシン/1 mM EDTAを1〜1.5 mLを培養皿に加え、接着細胞(前脂肪細胞の濃縮集団)を剥離します。培養皿をインキュベーターに37°Cで5~8分間置き、細胞を持ち上げます。
  6. プレートに10%FBS/αMEMを添加し、プレートをよく洗浄してプレートからすべての細胞を採取します。細胞溶液を15 mLまたは50 mLのチューブに移し、800 x g で8分間遠心分離します。
  7. 上清を取り除き、DNA抽出までペレット(前脂肪細胞)を-80°Cで保存します。

5.血液単球の単離

注:単球は、(ほぼ)完全にひっくり返った細胞集団を表すように分析され、単球における2H濃縮の測定は、各個体における2H2O曝露の参照マーカーとして使用することができる。あるいは、ボディの2H2O濃縮を測定し、2H2O曝露を計算するために使用することもできます。

  1. ヒト被験者から新鮮な全血をEDTAを含むバキュテナーチューブに採取します。
  2. 血液を1,000-2,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
    注意: ブレーキは使用しないでください。
  3. プラズマの最上層を取り除きます。プラズマのすぐ下にある白いバフィーコートに触れないように注意してください。
  4. トランスファーピペットでホワイトバフィーコートを吸引し、50mLチューブに移します。バフィーコートに~10mLのPBSを加えます。
  5. 10 mLの密度勾配培地をそっと加えて、バフィーコートを重ねます。
    注意: ピペットの先端がチューブの底に触れていることを確認し、底に密度勾配培地の透明な層ができるように慎重に排出します。気泡の導入は避けてください。
  6. ブレーキをオフにして、チューブを800 x g で30分間遠心分離します。
  7. 白い層(単核画分)をピペットで取り出し(~10mL)、トランスファーピペットの先端を境界に近づけて円を描くように動かしますが、上層には触れません。新しい50mLチューブに移し、PBS10mLを加えます。800 x g で5分間遠心分離し(ブレーキは使用しないでください)、上清を捨てます。
  8. 5 mLの赤血球溶解バッファーをペレットに加えます。混ぜ合わせ、RTで2分間放置します。
  9. 赤血球溶解バッファー/ペレット溶液に 0.1% BSA を含む PBS 5 mL を加え、800 x g で 5 分間遠心分離し、上清を捨てます。
  10. 免疫磁気ビーズを使用して単球をCD14+ 細胞として単離します。CD14+ 細胞の単離は、製造元のプロトコルに従って行ってください。
  11. 単離した単球をDNA抽出まで-80°Cで保存します。

6. DNA調製(単離、加水分解、誘導体化)

  1. 製造元の指示に従って、DNA抽出キットを使用して、前脂肪細胞、脂肪細胞、および血液単球からDNAを分離します。
  2. デオキシリボヌクレオシドを遊離するには、1 mL の S1 ヌクレアーゼ、1 mL のホスファターゼ酵素、および 36.8 mL の 5x 加水分解バッファーを含む 50 mL の酵素加水分解カクテルを 16 mm x 100 mm (10 mL) スクリューキャップ付きガラス管に含んだ 50 μL の酵素加水分解カクテルで 37 °C で一晩 (~200 μL) 酵素分解します。さらに、水ブランク、加水分解カクテルブランク、DNA抽出キットのカラムブランク、および500 ngのDNA標準試料を含めます。
    1. 5倍加水分解バッファーを調製するには、94 mLの分子生物学グレードの純水を滅菌ビーカーに入れます。酢酸ナトリウム3.08gと硫酸亜鉛21.5mgを秤量し、水を加え、溶けるまで混ぜます。氷酢酸でpHを5.0に調整し、pHペーパーで試験します。水を加えて総容量100mLにします。
    2. ホスファターゼ酵素を調製するには、酸性ホスファターゼのバイアルを1 mLの純水に再懸濁します。
    3. 0.5 U/μL S1ヌクレアーゼ酵素を調製するには、2.5 μLのS1ヌクレアーゼを2 mLの1x加水分解バッファーに希釈します(1 mLの5x加水分解バッファーを4 mLの純水に加えます)。
  3. 加水分解物を誘導体化してペンタフルオロベンジルヒドロキシルアミン(PFBHA)誘導体にします。具体的には、16 mm x 100 mm(10 mL)スクリューキャップチューブに、標準試料とブランクを含む消化されたDNAサンプルに、100 μLのペンタフルオロベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩(PFBHA;1 mg/mL)と75 μLの氷酢酸を直接添加します。ボルテックス(短時間)し、バイアルにキャップをし、加水分解物サンプルを100°Cに30分間設定した加熱ブロックに置きます。
  4. サンプルを取り出し、室温まで~5分間冷まします。冷却後、ヒュームフードの下の各チューブに2 mLの無水酢酸と100 μLの1-メチルイミダゾールを加えます。チューブを100°Cのヒートブロックに5分間セットします。
  5. サンプルを取り出し、15~20分間冷まします。冷めたら、各サンプルに3 mLの分子生物学グレードの水を加え、短時間ボルテックスして10分間放置します。
  6. 2 mLのジクロロメタン(DCM)をチューブに加え、サンプルを15秒間激しくボルテックスして、誘導体を有機相に抽出します。
  7. 800 x g で5分間遠心分離し、相を分離します。底部のジクロロメタン層を清潔な1.6mL GCバイアルに慎重に移します。
    注:水相を移さないでください、これはバックグラウンドを増加させます。
  8. 窒素で~20分間蒸発させて乾燥させ、DCMと残留酢酸を除去した後、RTの速度真空で~10分間乾燥させて試薬の痕跡をすべて除去します。

7. DNAのガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS)分析

  1. 乾燥したら、PFBHA誘導体を150 μLの酢酸エチルに再懸濁し、キャップをします。次に、DB-225カラムを搭載したガスクロマトグラフィー(GC)/質量分析(MS)装置で、メタンネガティブ化学イオン化を使用し、m/z 435、m/z 436、m/z 437の選択的イオンモニタリングモードでイオンを回収し、DNAへの 2Hの取り込みについて分析します(M0、M1、およびM2 質量同位体、 それぞれ)。使用する機器の製造元の指示に従ってください。
    1. GC条件を次のように設定します:カラム:30 m x 0.25 mm ID x 0.25 μmフィルムコーティング;クロマトグラフ:1.0 mL/minの定流量のヘリウムキャリアガス。パルススプリットレス注射;インジェクター温度:250°C;MSトランスファーライン:325°C;オーブン条件:初期温度100°C、2分間保持、40°C/分で220°Cの温度までランプ、7.5分間保持、40°C/分で320°Cまで2回目のランプ、1分間保持します。合計上映時間は16.0分です。一般的な dR 溶出時間は、1 番目のピークと 2 番目のピークでそれぞれ 10.5 分と 10.8 分です。
    2. MS条件を次のように設定します:メタン陰性化学イオン化源、単一イオンモニタリングモードでの検出。dRについて収集されたイオン:m/z 435、m/z 436、およびm/z 437(それぞれM0、M1、およびM2 質量同位体を表す)。
      注意: ライナーの下部にあるシリコン処理されたグラスウールの小さなプラグで、開いたガラスライナーをシリコン化します。このライナーは頻繁に交換してください(~100回の注入ごと)。
  2. 非濃縮(天然存在量)dR導関数の質量同位体存在量M1比を次のように計算します。
    M1比率=M1個体数/(M0、M1、M2個体群の合計)
    次に、標識されたサンプルのdR中のM1比率から自然存在量M1比率を差し引いて、濃縮度(過剰同位体存在量、または%EM1)21を計算します。
  3. 分析したサンプル中のM0イオン存在量の範囲にわたるM0イオン存在量の範囲にわたって、ベースライン(未濃縮)DNA標準の質量同位体存在量を同時に測定します。
    注:このステップは、GC/MS22で測定した同位体比の「存在量感度」を補正するために不可欠です。
  4. 非標識標準試料で測定された M0 イオン存在量と測定された質量同位体 M1 比のグラフを作成し、M1 質量同位体にとって最も正確なオンカラムサンプル濃度を決定します(つまり、既知の計算された天然存在量 M1 比、つまり「スイートスポット」に最も近い場所)。この非濃縮dR導関数のM1比は0.1669です。
  5. 実験サンプルを注入して、M0ピーク領域のこの「スイートスポット」にできるだけ近づくようにします。未濃縮標準試料の M1 比と M0 ピーク面積の 2 次回帰を使用して、各サンプルの特定の M0 濃度における「調整済み自然存在量」M1 比を推定します。これを脂肪細胞サンプルのM1比から差し引くと、自然の存在量を超える濃縮率、つまり%EM1(図3)23が得られます。
  6. 8週間にわたって積分された身体2H2O曝露(尿中で測定)または中間測定された単球濃縮(ステップ7.5)に基づいて、質量同位体分布分析(MIDA)式24を使用して、脂肪細胞の理論上の最大M1濃縮(EM1 *)を計算します。

8. 新規に合成された細胞の分画、または in vivo 脂肪生成の計算

  1. 次の式を使用して、 in vivo 脂肪生成または新しく合成された前脂肪細胞または脂肪細胞の形成の尺度である新しい細胞の割合(%)を計算します。
    新規細胞の割合(%)=[(サンプル[脂肪]細胞中のM1 濃縮)/EM1*(理論上の最大M1 濃縮)]×100
    注:*単球の2H濃縮は、方程式の分母としても使用できます。単球におけるこの測定は、各個体における2H2O曝露の参照細胞マーカーを表し、測定体2H2O値からの理論上の最大M1濃縮の計算を確認するために使用され得る。

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結果

2H2O標識プロトコル(セクション1)は、図2に示すように、8週間の標識期間10の期間中、体水中のプラトーに近い2H濃縮を1.0%〜2.5%の範囲に維持する。以前の研究では、セクション2〜8で詳述されているように、脂肪細胞のDNAに2Hを組み込むことにより脂肪動態を評価するために2H2O標識プロトコルを利用し、in vivo脂肪生成(前脂肪細胞増殖と脂肪細胞形成の両方)は、肥満の女性の皮下腹部(scABD)デポーと比較して皮下大腿骨(scFEM)で高かったと報告されました(図5)13.追加のデータは、皮下ATデポにおける前脂肪細胞および脂肪細胞形成率が、体脂肪全体の割合と正の関連があることを示しました(図6

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ディスカッション

in vitro評価はATの自然環境を網羅していないため、白色AT代謝回転のダイナミクスと肥満および関連する代謝性疾患におけるその役割に関する新しい知識を提供するためには、in vivo評価が必要です。脂肪動態を評価するためのレトロスペクティブ放射性炭素年代測定法の使用は有益であるが 7,25、このアプローチは、前向き介入研究中の動的変化を捉えるのには適していない。2H標識法は、ヒトにおけるin vivo脂肪細胞の形成と代謝回転の生理学的測定を提供することが検証されており、他の評価とは大きく異なります。近年、このアプローチは、げっ歯類26とヒト13,27,28の両方における新規の脂肪動態を評価し...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

著者らは、Pennington Biomedical Research Centerの質量分析コアに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-メチルイミダゾールミリポアシグマ336092
2H2OSigma Aldrich
無水酢酸Aldridge539996
ACK Lysing Buffer (赤血球溶解バッファー)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS Agilent
Anti-human CD31 (PECAM-1) BiotinInvitrogen13-0319-82
Anti-human CD34 BiotinInvitrogen13-0349-82
Anti-human CD45BioLegend304004
Antibiotic Antimycotic SolutionMilliporeSigmaA5955
Collagenase type 1Worthington Biochemical株式会社LS004196
デオキシリボース(2-デオキシd-リボース)ミリポアSigma31170
酸化重水素ミリポアSigma756822
DB-225カラム(30m、0.25mm、0.25um)J&W Scientific122-2232
ジクロロメタン (DCM)MilliporeSigma34856
DNA standard (仔牛胸腺 DNA)MilliporeSigmaD4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (DNA extraction kit)Qiagen69504
Easy Sep Human Biotin kitStem Cell Technologies17663
EasySep Human CD14 Positive Selectionカクテル幹細胞技術18058C
酢酸エチルフィッシャーEX0241-1
ファルコン 5 mL 丸底ポリスチレン試験管VWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
GC バイアル (2 mL)フィッシャーC-4011-1W
GC バイアル インサートフィッシャーC-4011-631;C-4012-530
氷酢酸フィッシャーAC14893-0010
ガラス管(加水分解用)フィッシャー14-959-35AA
HEPES バッファーサーモフィッシャー15630080
ハイクロン 水、分子生物学グレードトーマス・サイエンティフィSH30538.02
MEM アルファフィッシャー・サイエンティフィック32561-037
PFBHA(o-(2,3,4,5,6)-ペナットフルオロベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩)ミリポアシグマ194484
pH指示薬ストリップフィッシャー987618
ホスファターゼ酸カルバイオケム(VWR)80602-592
S1ヌクレアーゼ(麹菌由来)ミリポアシグマN5661
硫酸ナトリウムミリポアシグマ23913
ック

参考文献

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