方法論記事

インピーダンスに基づくリアルタイム細胞解析を用いたウイルス感染時のヒト臍帯静脈内皮細胞の変化のモニタリング

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DOI：

10.3791/64887

⸱

2023年5月5日

 ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

この記事について

サマリー

現在の研究では、リアルタイム細胞解析(RTCA)システムを使用して、ウイルス感染中のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の変化を監視するプロトコルについて説明します。

要約

内皮細胞は、すべての血管およびリンパ管の内面を覆い、血液またはリンパ液とその周囲の組織との間の体液および溶質交換を調節する半透膜バリアを形成します。ウイルスが内皮関門を通過する能力は、人体へのウイルスの拡散を促進する重要なメカニズムです。多くのウイルスは、感染時に内皮透過性を変化させたり、内皮細胞バリアを破壊したりして、血管漏出を引き起こす可能性があることが報告されています。現在の研究では、市販のリアルタイムセルアナライザーを使用して、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)のジカウイルス(ZIKV)感染中の内皮の完全性と透過性の変化を監視するリアルタイム細胞分析(RTCA)プロトコルについて説明します。ZIKV感染前後に記録されたインピーダンス信号を細胞指数(CI)値に変換し、解析した。RTCAプロトコルは、ウイルス感染中の細胞形態学的変化の形で一過性の影響を検出することができます。このアッセイは、他の実験セットアップにおけるHUVECの血管完全性の変化の研究にも役立つ可能性があります。

概要

内皮細胞(EC)は、すべての血管とリンパ管の内面を覆っています。それらは接着、タイトギャップ接合によって接続され、血液またはリンパ液と周囲の組織との間に半透性のバリアを作成します1,2。無傷の内皮細胞間接合部は、高分子、溶質、および液体の輸送を調節するために重要であり、対応する組織および器官の生理学的活動に不可欠です3。内皮バリアは動的であり、特定の刺激によって調節される4。内皮バリア機能の破壊または喪失は、ウイルス感染8,9,10,11を含む多くの疾患の病因における急性および慢性炎症における疾患病態生理の特徴です5,6,7。フラビウイルスの場合、非構造タンパク質NS1は、カテプシンL、シアリダーゼ、およびエンドグリコシダーゼヘパリナーゼの発現と活性化の増加の結果として、内皮グリコカリックス様層の破壊を介して、内皮透過性を変化させることができることがわかった9。病状態では、内皮単層の完全性が損なわれ、細胞間接合部が破壊され、内皮の損傷と機能障害12、最終的には複数の臓器系にわたる広範な病理学的症状につながる可能性があります13,14。ECのウイルス感染は、細胞シグナル伝達経路と細胞遺伝子発現プロファイルの変化をもたらし、体液バリア機能に影響を与え、ECの破壊を引き起こし、血管漏出を誘発する可能性があります10,15。ECのジカウイルス(ZIKV)感染は、血管透過性の変化を引き起こし、内皮バリア機能不全を引き起こし、血管漏出を引き起こす接合部の完全性を破壊することがわかっています10,15。研究によると、ZIKVは重度の先天性欠損症に関連しています。しかし、これが起こる正確なメカニズムについてはあまり知られていません16,17。したがって、感染中の内皮バリアの変化を理解することは、病気のメカニズムを理解するために重要です。

ECは現在、さまざまな生理学的および病理学的プロセスのための重要な実験的in vitro血管モデルシステムとして使用されています18、19、20、21。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、in vitroで血管内皮および血管生物学を研究するための一次非不死化細胞系として広く使用されています22,23,24,25。HUVECは、1970年代初頭にヒトの臍帯の臍帯静脈からin vitro培養のために初めて単離された26。HUVECは丸石のような形態をしており、実験室で容易に増殖することができます。コンフルエント状態で長期間維持した後のせん断応力により、細胞形状の伸びが観察される。HUVECは、ワイベル小体とパラデ小胞(WPB)、ピノサイトーシス小胞、核近くに位置する少量のフィブリル、枝分かれをめったに示さない管状のミトコンドリア、凝縮したクロマチンの細かい粒状パターンを持つ楕円体核、および各核に存在する1〜3個の核小体の存在によって特徴付けることができる27.HUVECは多くの形態学的特徴を示しますが、光学検査だけではHUVECの同定は達成できません。血管内皮(VE)-カドヘリンの免疫蛍光染色などのアッセイは、HUVEC28、29、30、31の血管完全性のモニタリングに一般的に使用されています。

この研究では、HUVECの感染のリアルタイム細胞解析(RTCA)プロトコルについて説明します。RTCAシステムは、細胞の接着に導電性の表面を提供する微小電極を含む特殊な金コーティングプレートを使用します。細胞が微小電極表面に付着すると、微小電極を通る電子の流れを妨げる障壁が形成されます。微小電極によって生成されるインピーダンスの測定は、細胞の付着、増殖、および移動を含むいくつかの細胞プロセスに関する情報を得るために用いることができる32。報告されたアッセイは、インピーダンスベースの細胞アッセイであり、リアルタイムセルアナライザーと組み合わせることで、生細胞の増殖、形態変化(細胞の縮小など)、および細胞接着品質を非侵襲的かつラベルフリーの方法で連続的に測定できます。本研究では、リアルタイムセルアナライザーを用いて、ZIKV感染時のHUVECの内皮の完全性と形態学的変化をモニターします。簡単に説明すると、この装置は、培地(導電性溶液)の存在下で、特殊な金微小電極でコーティングされたマイクロタイタープレートで透過する電子の流れを測定します。細胞の接着や細胞数や形態の変化は、電子の流れを乱し、インピーダンスの変動を引き起こしますが、これを装置で捉えることができます(補足図1)。ZIKV感染前後のHUVECの増殖、増殖、付着の差を電気インピーダンス信号でリアルタイムに記録し、細胞指数(CI)値に変換します。感染前のCI値は、CI値正規化のベースラインとして使用されます。CI値の変化は、感染時の細胞形態学的変化または細胞接着喪失を反映している33。この研究結果は、RTCAプロトコルにより、VE-カドヘリンの免疫蛍光染色などのエンドポイントアッセイと比較して、ウイルス感染中の一過性効果または細胞形態学的変化を検出できることを示しています。RTCA法は、他のウイルスに感染した際のHUVEC血管の完全性の変化を解析するのに有用である可能性があります。

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プロトコル

1. 細胞調製

  1. HUVECの調製
    1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、HUVECの培養に必要な成長因子、ホルモン、およびタンパク質を含む0.01%内皮細胞増殖サプリメント(ECGS)を添加した12 mLの内皮細胞培地(ECM)を含む75 cm2(20 μg/mLのコラーゲン1型でコーティング)細胞培養フラスコで7.5 x 10 5 HUVEC細胞/mLを増殖させます。 および0.01%ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)。細胞培養インキュベーターで37°C、5%CO2でインキュベートします(図1)。

2. RTCA実験のセットアップ

  1. RTCAで抵抗の検証を実行
    1. デスクトップの RTCAソフトウェア アイコンをダブルクリックして、アプリケーションを起動します。ログインウィンドウが表示されるので、ユーザー名とパスワードを入力してログインします。
    2. A1ウェルを内側に向けて、96ウェルRTCA抵抗プレートを細胞培養インキュベーターにあるRTCAステーションに配置します。
    3. RTCAソフトウェアの Exp Notes タブで、実験名、デバイスSN、およびデバイスタイプ(QCプレート)を入力します。
    4. RTCAソフトウェアのセルタブのレイアウトタブで、すべてのウェルをハイライトし、ハイライトされたウェルを右クリックして、すべてのウェルがオンになっている(グレー表示されている)ことを確認します。
    5. RTCAソフトウェアの Schedule タブで、 Step_1をクリックします。 「Sweeps: 10」と「 Interval: 30 s」と入力します。[ 適用] をクリックします。ソフトウェアの左上隅にある [開始/続行 ]をクリックして、検証の実行を開始します。
      注:ウェルとRTCAステーションの接続に問題がないことを確認するには、「Plate Scanned.Connections OK」と表示されます。
  2. データ解析のための抵抗検証実行
    1. [ セル インデックス ] タブで、実行の完了時にデータを確認します。すべての信頼区間値は0.063未満である必要があります。
    2. [ セル インデックス ] タブの下部で、生のスキャン データを確認します。生のスキャン データには、40.0 ± 2.0 (行 A と H)、67.5 ± 2.5 (行 B と G)、93.6 ± 2.9 (行 C と F)、117.6 ± 3.2 (行 D と E) の繰り返し値パターンが示されます。
    3. 検証の実行を停止するには、[プレート] >[リリースプレート]をクリックします。これで、96ウェルRTCA抵抗プレートをRTCAステーションから取り外す準備が整いました。
  3. RTCAのバックグラウンド読み取りの取得
    1. コラーゲンタイプ1でコーティングされた特殊な金微小電極プレート(20 μg/mLのコラーゲンタイプ1でコーティング)を60 μL/ウェルのハンク平衡塩溶液(HBSS;重炭酸ナトリウム入り、塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムなし)で2回洗浄します。
    2. 残りのHBSSを廃棄し、50 μL/ウェルのECMを添加します。ECMを含む特殊な金微小電極プレートを、A1ウェルを内側に向けて、細胞培養インキュベーターにあるRTCAステーションに配置します。
    3. RTCAソフトウェアの Exp Notes タブで、実験名、デバイスSN、およびデバイスタイプ(96ウェルフォーマット)を入力します。
    4. RTCAソフトウェアのセルタブのレイアウトタブで、使用するウェルをハイライトし、ハイライトされたウェルを右クリックして、すべてのウェルがオンになっている(グレー表示されている)ことを確認します。
    5. RTCAソフトウェアの Schedule タブで、 Step_1をクリックし、ソフトウェアの左上隅にある Start/Continue をクリックして、バックグラウンドの読み取り値を取得します。
      注意: 「プレートスキャン」を観察して、ウェルの接続が正しいことを確認してください。Connections OK」と表示されます。
    6. バックグラウンドの読み取り値が得られると、特殊な金微小電極プレートを細胞播種する準備が整い、RTCAステーションから取り出す準備が整います。
  4. 特殊金微小電極板でのHUVEC調製
    1. 50 μL/ウェルの馴化培地、1 x 104 細胞/ウェル(馴化培地:10%FBS、0.01%ECGS、および0.01%P/Sを添加したECM)を含む特殊な金微小電極プレートにHUVECを播種します。A1ウェルを内側に向けてプレートをRTCAステーションに戻し、5%CO2を含む37°Cの細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。
      注:細胞計数計を用いて、希釈係数2の細胞懸濁液について細胞カウントを行いました。
    2. 「 スケジュール」 タブで、左上隅にある「 ステップの追加 」をクリックします。 [Step_2 ]をクリックし、[スイープ:601]と[間隔:2分] を変更します。Step_2をクリックし 、 ソフトウェアの左上隅にある [開始/続行 ]をクリックします。
    3. 20時間のインキュベーション後、 ウェルグラフ タブのCI値がプラトーを示した場合、プレートは感染の準備が整っています。RTCA ソフトウェアの Schedule タブで、 Abort Step をクリックします。
    4. これで、特殊な金微小電極プレートをRTCAステーションから取り外す準備が整いました。

3. HUVECにおけるウイルス感染

  1. ウイルス希釈
    1. ZIKVストック培養は-80°Cに保たれます。 この研究では、極低温バイアルに保持されているウイルスストックを除去し、1.5 mL 遠心分離チューブ内の無血清 ECM で ZIKV ストックを希釈して、0.1 および 1 の感染多重度 (MOI) を達成します。
      注:ZIKVストックは、Vero細胞で増殖を行い、ZIKV上清34を回収することによって、以前に調製した。
  2. 細胞単層の感染
    1. 各ウェルからコンディショニング培地(10%FBS、0.01%ECGS、および0.01%P / Sを添加したECM)を取り出し、廃棄します。各ウェルを60 μLのHBSS 2xですすぎます。井戸の側面の助けを借りてHBSSを挿入します。セル単層を撮影しないでください。
    2. 希釈率が最も高いものから低いものへと、無血清ECMで希釈した各ウイルスサンプルを40 μLウェルに加えます。希釈液ごとにウェルを 3 倍にし、感染せずに 6 つのウェルを維持します (ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールトロンビン)。セル単層を撃たないでください。代わりに、井戸の側面の助けを借りて希釈したウイルスを追加します。挿入のたびに新しいピペットチップを使用してください。
      注:トロンビンは、HUVECの内皮透過性を急速に高めることができるため、ポジティブコントロールとして選択されました。
    3. プレートを細胞培養インキュベーターで37°C、5%CO2 でインキュベートし、ウイルスを吸着させます。15分ごとにプレートを5回振り回して、細胞単層全体にウイルスを吸着させます。
  3. オーバーレイ細胞培養培地の添加
    1. 1時間のインキュベーション後、ウイルス懸濁液を最低濃度から最高濃度まで除去して廃棄します。
    2. 感染細胞を60 μLのHBSS 2xで洗浄します。2% FBSを添加したECMでウェルをオーバーレイします。ポジティブコントロールウェルでは、2% FBS を添加した ECM でトロンビンを 20 U/mL に希釈し、ウェルにトロンビン含有 ECM 培地を重ね合わせます。セル単層を撃たないでください。代わりに、ウェルの側面の助けを借りてオーバーレイメディアを追加します。
  4. 感染した特殊な金微小電極プレートをRTCAステーションに戻す
    1. 「スケジュール」タブで、左上隅にある「ステップの追加」をクリックします。[Step_3] をクリックし、[スイープ: 3,601] と [間隔: 2 分] を変更します。
    2. 表示されるポップアップウィンドウで[ OK ]をクリックします。A1ウェルを内側に向けて、感染した特殊な金微小電極プレートを細胞培養インキュベーターにあるRTCAステーションに入れます。
    3. Step_3をクリックし 、 ソフトウェアの左上隅にある [開始/続行 ]をクリックします。

4. データ分析とデータのエクスポート

  1. 各ウェルの実験情報の追加
    1. 「 レイアウト 」タブで、「 セル 」タブをクリックします(図2A)。ターゲットセル情報を入力し、各ウェルのウェルタイプを決定するには、ウェルをハイライト表示し、ソフトウェアの下部にターゲットセルの名前、番号、および色を入力します。[ Apply ](適用)をクリックします(図2B)。
    2. [セル]タブで各ウェルのウェルタイプを選択して決定するには、ウェルをハイライト表示し、ウェルタイプ(サンプル、ポジティブコントロール、またはネガティブコントロール)を選択して、[設定]をクリックします。
    3. [Layout]( レイアウト )タブで、[Treatment]( 処理 )タブをクリックします(図2C)。処理情報を入力するには、井戸をハイライト表示し、処理名、処理の濃度、単位、色を入力します。[ Apply ](適用)をクリックします(図2D)。
    4. 処理タブで各ウェルのウェルタイプを選択して決定するには、ウェルをハイライト表示し、ウェルタイプ(サンプル、ポジティブコントロール、またはネガティブコントロール)を選択して、設定をクリックします。
      注: 選択項目ごとに、複数のウェルを同時にハイライト表示することができます。
  2. CI値の正規化
    1. [データ分析]タブの右側を右クリックし、[Y軸]ドロップダウンボックスから[正規化されたセルインデックス]を選択します(図3A)。下部のX軸セクションで、特殊な金微小電極プレートを感染のために取り外した最後の測定時点として、正規化された時間を選択します(図3B)。
      注:ソフトウェアによって実行される正規化プロセスでは、選択した正規化ポイントがウイルスや処理の添加前である限り、ウェルシードと付着の違いによるばらつきのほとんどが除去されます。したがって、最適な正規化の時点は、ウイルスや治療薬を追加する前の最後の時点である必要があります。正規化する時点は、[Step_2]の[スケジュール]タブで確認できます。示されている合計時間は、正規化する時点です(図3C)。
  3. RTCAソフトウェアを使用した取得データのプロット
    1. [データ分析] タブで、ウェルを強調表示して [追加<< をクリックすることで、グラフに追加するウェルを選択します。これで、時間グラフに対して正規化されたセルインデックスをコピーしてエクスポートする準備が整いました。必ず [平均] チェックボックスにチェックを入れてください。
  4. RTCAソフトウェアを使用したデータのエクスポート
    1. RTCAソフトウェアの左上隅にある Plate>Export Experiment Info...をクリックします。チェックボックスをオンにして、エクスポートするデータを選択します。[ OK] をクリックします。
      注: 生データ(生のCI値)は、 セルインデックス>すべて にチェックを入れるとエクスポートできます。
    2. エクスポートファイルを保存するフォルダを選択します。「 保存」をクリックします。実験情報のエクスポートを示すポップアップウィンドウが表示されます。エクスポートが完了すると、エクスポートされた実験情報を表示する準備ができていることを示す別のウィンドウが表示されます。

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結果

ZIKV感染前は、特殊な金微小電極でコーティングしたマイクロタイタープレート上で培養したHUVEC単分子膜で記録されたCIは8を超えており、強い接着性が示唆されています。CIインデックスが8未満のプレートまたはウェルは廃棄する必要があります。その後、HUVECを0.1および1のMOIでZIKVに感染させ、細胞インピーダンスを7日間記録しました。MOI0.1(水色の線)でZIKV P6-740に感染したHUVECのCI値は、陰性の感染対照(茶色の線; 図4)。MOI1(青線)の高用量ZIKV P6-740で感染したHUVECでは、11HPIという早い時期にCI値が低下し始めました。24 HPIでは、MOIが0.1および1の状態でECがZIKVに感染した場合、正規化CI値がそれぞれ5%および7%低下した(0.949、0.929)。ZIKV感染時の正規化CI値の50%の減少は、それぞれ0.1および1のMOIで96HPIおよび66.75HPIで記録された。正規化CI値は107HPIで最低点に達し、MOIが0.1と1のZIKV感染時にそれぞれ51%と60%(0.4915、0.3984)減...

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ディスカッション

寛容な細胞における細胞殺ウイルス感染は、通常、細胞形態および生合成の実質的な変化と関連している36。細胞の萎縮、細胞の肥大、および/または合胞体の形成など、ウイルスによって引き起こされる細胞形態学的変化は、細胞変性効果(CPE)としても知られており、特定のウイルス感染に特徴的である37。ECでは、CPEは細胞の破壊と各EC間のタイトジャンクションの破壊として説明され、したがって内皮バリアの破壊を引き起こします38,39。HUVECのCPEは、単層細胞の剥離と組織培養血管からの浮遊として説明できます。接着細胞の剥離や浮遊などの感染細胞の形態変化は、RTCA法を用いて連続的に検出することができます。この手法は電気インピーダンスに基づいており、数秒ごとにリアルタイムでセルを監視できます。これにより、細胞増殖、形態学的変化の定量化が可能になり、HUVECの場合、刺激による内皮の完全性および細胞バリア機能の変化をモニターするために使用す...

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開示事項

著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。

謝辞

本研究は、マレーシア高等教育省の高等教育センター・オブ・エクセレンス(HICoE)プログラム(MO002-2019)の支援と長期研究助成制度(LRGS MRUNフェーズ1:LRGS MRUN/F1/01/2018)の助成を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL微量遠心チューブNest615601
37 °5% CO2SanyoMCO-18AIC
75 cm2組織培養フラスココーニング430725U
抗生物質溶液 ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S)Sciencell0503
生物学的安全キャビネット、クラス IIホルテンHB2448
コラーゲン 1 型SIgma-AldrichC3867
内皮細胞増殖サプリメント (ECGS)Sciencell1052
内皮細胞培地 (ECM)Sciencell1001
E-plate 96アジレント・テクノロジーズ社
ウシ胎児血清 (FBS)Sciencell0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma-AldrichH9394
血球計算盤Laboroptik LtdNeubauer Improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)Sciencell8000
倒立顕微鏡ZEISSTELAVAL 31
Latitude 3520ノートパソコンDell -
マルチチャンネルマイクロピペット(10-100 & マイクロ;L)Eppendorf3125000036
マルチチャンネルマイクロピペット(30 - 300 &L)エッペンドルフ3125000052
試薬予約TarsonsT38-524090
RTCA抵抗板 96Agilent Technologies, Inc.
RTCA Software Pro (Version 2.6.1)アジレント・テクノロジーズ株式会社
5454433001シングルチャンネルピペット(10 - 100 & マイクロ;L)Eppendorf3123000047
シングルチャンネルピペット(100 - 1000 µL)Eppendorf3123000063
シングルチャンネルピペット(20 - 200 & micro;L)エッペンドルフ3123000055
xCELLigence Real-time Cell Analyzer SP (型式:W380)アジレント・テクノロジーズ株式会社00380601030https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232
付きCインキュベーター 0523236800105232350001

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