方法論記事

タンパク質構造決定のためのクライオ電子顕微鏡分析の最近の進歩とベストプラクティス

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DOI:

10.3791/64907

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2023年2月10日

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1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, King’s College London, 2Bio Structure and Biophysics (BSB), Sanofi

この記事について

要約

議論された記事:

de Martin Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. 支持浮遊ブロックを用いた透過型電子顕微鏡における試料支持膜の調製.視覚化された実験のジャーナル。(170)、DOI:10.3791/62321(2021年)。

Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. 時間分解クライオ電子顕微鏡法のための高速グリッド調製.視覚化された実験のジャーナル。(177)、DOI:10.3791/62199 (2021年)。

Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-Electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton.視覚化された実験のジャーナル。(168)、DOI:10.3791/62271(2021年)。

Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A., Jr. 単一粒子極低温電子顕微鏡のための生物試料の手動ブロットおよびプランジ凍結.視覚化された実験のジャーナル。(180)、DOI:10.3791/62765 (2022年)。

Martynowycz, M. W., Gonen, T. 小分子の微結晶電子回折.視覚化された実験のジャーナル。(169)、DOI:10.3791/62313(2021年)。

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Fleck, R. A. クライオ電子トモグラフィー用のデュアルビーム走査型電子顕微鏡を使用して、ガラス質の生物学的サンプルからラメラを調製する.視覚化された実験のジャーナル。(174)、DOI:10.3791/62350 (2021年)。

Wypych, D., Kierecki, D., Golebiowski, F. M., Rohou, A. gP2S, CryoEM実験のための情報管理システム.視覚化された実験のジャーナル。(172)、DOI:10.3791/62377 (2021年)。

編集記事

直接電子検出器の出現とソフトウェアとハードウェアの改善以来、クライオ電子顕微鏡(クライオEM)は、研究者が高分子の構造を原子に近い詳細まで日常的に決定できる技術になりました1,2。この加速は、サンプルの調製からデータ収集、処理に至るまで、非常にペースの速い一連の新しい開発によって触媒されてきました。この手法を専門家でなくても広く民主化できるようにするために、より効率的でアクセスしやすいパイプラインが作成されました。驚くべきことに、「分解能革命」から10年も経たないうちに、クライオEMは学界と産業界の両方でタンパク質の特性評価に不可欠な技術になりました3,4。

クライオ EM 研究コミュニティの最も注目すべき側面の 1 つは、プロトコル、戦略、およびソフトウェアをオープンに共有する意欲です5。このテクノロジーと専門知識のオープン性は、開発の非常に速いペースに大きく貢献しましたが、いくつかのボトルネックにより、完全なアクセスが妨げられ続けています。このメソッドコレクションでは、多くのプロジェクトの主要なボトルネックであるクライオEMによる構造解析に適したグリッドの準備における最近の開発のいくつかを説明することを目的としています。また、クライオ EM 分析の新しいアプローチについて、この分野で現在開発中の新しいプロトコルについても説明します。

上記のように、実験室でのクライオEMの日常的な適用における現在のボトルネックの1つは、サンプルの前処理です。グリッドへのサンプル適用のレベルでは、いくつかの問題が発生する可能性があります:最も一般的には、氷中でのサンプルの好ましい方向と、空気と水の界面での変性です。サンプルを空気と水の界面からシールドすることは、サンプルが空気と接触するのを物理的に防ぐ炭素またはグラフェンのサポートフィルムを使用することにより、この問題の解決策の1つです。グリッドへの薄膜の塗布を容易にするために、de Martin Garridoら6 は、制御された方法で小さな水滴とサンプルを塗布できる3Dプリンターによって製造された支持浮遊ブロックを開発しました。このブロックを使用すると、グラフェン層とカーボン層が安価で使いやすい方法で堆積されます。

空気と水の界面での損傷を防ぐ別の方法は、タンパク質が大気にさらされる時間を制限することです。このために、Klebs et al.7 と Budell et al.8 によって開発された 2 つの異なる機器は、高速 (10 ミリ秒という低さ) グリッド準備のための新しいアプローチを使用し、粒子の配向に関する問題の可能性を減らします。これらのデバイスのもう一つの利点は、構造研究のエキサイティングな新境地である時間分解実験を実行できることです。

対照的なアプローチとして、Nguyenら9は 、非常に高価または構築が困難な市販または特注のデバイスがない場合に、クライオEM分析用のグリッドを凍結する方法を報告しています。彼らは、高価な機器を必要としない安価な自家製デバイスを使用して同様の品質のグリッドをどのように取得できるかを示し、クライオ EM の民主化に貢献します。

クライオ電子顕微鏡では、対象のサンプルは必ずしもタンパク質ではなく、低分子または細胞全体などの大きな生物学的システムである可能性があります。このようなサンプルの調製は独特であり、データ収集における特定の手順とさまざまな戦略が必要です。

微結晶電子回折 (MicroED) の場合、研究対象のサンプルは通常粉末の形で見られる小さな化学物質です。粉末は EM グリッドに直接塗布され、結晶形状が維持されます。次に、MartynowyczとGonen10に示されているように、データ収集は回折モードで実行されます。対照的に、細胞全体はクライオ EM 分析には厚すぎます。これに対処するために、Bissonらは、構造研究に適した薄いセクションを得るために、SEMを使用してそのようなサンプルに物理的にドリルで穴を開ける方法を報告しています11。

タンパク質濃度から顕微鏡設定、データ分析まで、タンパク質サンプルごとに多くのパラメータが変更されるため、サンプルから構造まで、プロセスの各ステップの記録を保持することが重要です。この目的を達成するために、Wypych ら 12 は、ユーザーがワークフローを整理し、将来の出版物に必要なすべての詳細を追跡できる Web ベースの情報管理ツールを開発しました。これは、特に業界環境において、クライオEMで自動化がますます普及しているため、特に重要です。

クライオEMは、過去10年間で、ハードウェアとソフトウェアの両方の面で目覚ましいペースで進歩してきました。ベストプラクティスの広範な普及と新しい方法の広範な採用を確実にするには、透明性の高い一連のプロトコルが必要です。この特集号は、この取り組みに寄与します。

謝辞

JBは、BBSRC(BB/R009759/2)とHFSP(RGY0080/2021)からの資金提供を認めています。

参考文献

  1. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  2. Smith, M. T. J., Rubinstein, J. L. Beyond blob-ology. Science. 345 (6197), 617-619 (2014).
  3. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. 91, 1-32 (2022).
  4. Wigge, C., Stefanovic, A., Radjainia, M. The rapidly evolving role of cryo-EM in drug design. Drug Discovery Today. Technologies. 38, 91-102 (2020).
  5. Tachibana, C. Democratizing cryo-EM: Broadening access to an expanding field. Science. 367 (6484), 1394(2020).
  6. de Martin Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. Preparation of sample support films in transmission electron microscopy using a support floatation block. Journal of Visualized Experiments. (170), e62321(2021).
  7. Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (177), e62199(2021).
  8. Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-Electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. (168), e62271(2021).
  9. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765(2022).
  10. Martynowycz, M. W., Gonen, T. Microcrystal electron diffraction of small molecules. Journal of Visualized Experiments. (169), e62313(2021).
  11. Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Fleck, R. A. Preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments. (174), e62350(2021).
  12. Wypych, D., Kierecki, D., Golebiowski, F. M., Rohou, A. gP2S, an information management system for CryoEM experiments. Journal of Visualized Experiments. (172), e62377(2021).

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