グラフェン電極アレイを用いた脳マッピング

Summary

侵襲性を低減し、時空間分解能を向上させるためのグラフェンアレイベースの脳マッピング手順を紹介します。グラフェンアレイベースの表面電極は、長期的な生体適合性、機械的柔軟性、および複雑な脳における脳マッピングへの適合性を示します。このプロトコルにより、複数の形式の感覚マップを同時に逐次的に構築することができます。

Abstract

皮質マップは、大脳皮質の感覚運動刺激に対する位置依存的な神経応答の空間的構成を表し、生理学的に関連する行動の予測を可能にします。皮質マップを取得するために、貫通電極、脳波、陽電子放出断層撮影、脳磁図、および機能的磁気共鳴画像法などの様々な方法が用いられてきた。ただし、これらの方法は、時空間分解能が低く、信号対雑音比(SNR)が低く、コストが高く、生体適合性が低いか、脳に物理的損傷を引き起こすために制限されています。本研究では、従来の方法の欠点を克服し、優れた生体適合性、高い時空間分解能、望ましいSNR、および組織損傷の最小化を提供する電気コルチコグラフィーの特徴として、グラフェンアレイベースの体性感覚マッピング法を提案します。この研究は、ラットの体性感覚マッピングのためのグラフェン電極アレイの実現可能性を実証しました。提示されたプロトコルは、体性感覚野だけでなく、聴覚、視覚、運動野などの他の皮質にも適用でき、臨床実装のための高度な技術を提供します。

Introduction

皮質マップは、大脳皮質の感覚運動刺激に対する応答特性を表す一連の局所パッチです。それらはニューラルネットワークの空間的形成であり、知覚と認知の予測を可能にします。したがって、皮質マップは、外部刺激に対する神経応答を評価し、感覚運動情報を処理するのに役立ちます1,2,3,4。皮質マッピングには、侵襲的および非侵襲的な方法が利用可能です。最も一般的な侵襲的方法の1つは、^5,6,7,8をマッピングするための皮質内(または貫通)電極の使用を含む。

貫通電極を用いたオンデマンドの高解像度皮質マップの評価は、いくつかの障害に直面しています。この方法は、まともなマップを取得するには面倒であり、臨床使用のために実装するには侵襲的すぎるため、さらなる開発が禁止されています。脳波記録(EEG)、陽電子放出断層撮影(PET)、脳磁図(MEG)、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)などの最近の技術は、侵襲性が低く再現性が低いため、人気が高まっています。ただし、法外なコストと解像度の低さを考えると、限られた数のケースで使用されます9,10,11。近年、信号信頼性に優れたフレキシブル表面電極が注目されています。グラフェンベースの表面電極は、長期的な生体適合性および機械的柔軟性を示し、回旋脳において安定した記録を提供する¹²、¹³、^14、15、16。私たちのグループは最近、皮質表面での高解像度記録と部位特異的神経刺激のためのグラフェンベースのマルチチャンネルアレイを開発しました。この技術により、感覚情報の皮質表現を長期間追跡することができます。

この記事では、30チャンネルのグラフェン多電極アレイを使用して体性感覚皮質の脳マップを取得する手順について説明します。脳の活動を測定するために、グラフェン電極アレイを皮質の硬膜下領域に配置し、前足、前肢、後足、後肢、体幹、およびひげを木の棒で刺激します。体性感覚誘発電位(SEP)は、体性感覚領域について記録されます。このプロトコルは、聴覚、視覚、運動野などの他の脳領域にも適用できます。

Protocol

すべての動物の取り扱い手順は、仁川国立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました(INU-ANIM-2017-08)。

1.手術のための動物の準備

注:この実験では、性別バイアスのないSprague Dawley Rat(8〜10週齢)を使用してください。

1. 90 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンカクテルでラットを腹腔内に麻酔します。.手術中ずっと望ましい麻酔深度を維持するために、ラットが目覚めの兆候を示したときに、追加の45 mg / kgケタミンと5 mg / kgキシラジンカクテルを提供します。
2. ラットが深い麻酔下にあることを確認し、つま先ピンチ、テールピンチ、角膜反射などの体の反射を定期的にチェックします。
3. トリマーを使用して目と耳の後ろの間の毛皮を剃ります。
4. 眼科用軟膏を目に塗り、乾燥を防ぎます。

2.皮質表面露出の手術

1. ラットの頭を定位固定装置に固定します 定位固定アダプター。手術中に体温を37°Cに維持するには、ラットを温度制御された加熱パッドの上に置きます。
2. 剃った部分をアルコールとポビドンヨードのスクラブを交互に3回滅菌します。
3. 鉗子で頭皮をしっかりとつかみ、注射器でリドカイン0.1mL(2%)を直接頭皮に注入し、手術部位に局所麻酔を誘導します。
4. メスで長さ2〜3cmの正中線を切開し、頭皮を引き離して頭蓋骨を露出させます。
5. 頭蓋骨を露出させるために蚊の鉗子で頭皮を固定します。
6. 鉗子で頭蓋骨の表面を引っ掻いて骨膜を取り除きます。
7. 鈍い 後頭蓋骨の上の筋肉を解剖して、脊髄上部の軸の上に大槽を露出させます。
8. 大槽を刃で切開して脳脊髄液を排出し、大槽の切開部内に滅菌ガーゼを入れて脳脊髄液を常に吸収し、脳浮腫を防ぎ、炎症を最小限に抑えます。
9. 鉛筆を使用して、右半球のブレグマから前後軸で3 mm、右横方向に6 mmの長方形の窓を頭蓋骨に印を付けます。
   注意: マーキングは、上矢状洞破裂を避けるために、正中線から1mmの距離を確保する必要があります。
10. 固定装置座標に従ってマークされた領域をドリルし、骨ロンジャーで頭蓋骨を取り除きます。
11. 硬膜を取り除くには、26 Gの針の先端を90°に曲げ、硬膜に穴を開け、硬膜を持ち上げ、その穴に鉗子を挿入し、鉗子で引き裂きます。
12. 生理食塩水で湿らせたガーゼを体性感覚皮質に置き、乾燥を防ぎます。

3. 記録系に接続したグラフェン電極アレイの作製

1. オムネティクスコネクタを備えたグラフェン電極アレイを準備します。
   1. 生理食塩水を適用して損傷を与えることなくグラフェン多電極アレイを取り外します。
   2. 基準線とアース線の外側カバーをコネクタから取り外します。
2. ヘッドステージとグラフェン電極アレイをコネクタに接続します。
3. ヘッドステージにリンクされているインターフェースケーブルを録音システムに接続します。
4. グラフェン電極アレイ複合体を脳定位固定アームに固定します。
5. すべてのチャネルからの神経信号をキャプチャするには、所定の定位固定座標に従って、曲がらずに体性感覚野上にアレイを配置します。
6. 後頭骨の後ろの組織の下に基準線を置き、接地された光学テーブルにアース線を接続します。

4.マッピングのための物理的刺激と記録SEP

1. ニューラル信号記録ソフトウェアを開きます。
2. 録音ソフトウェア環境の設定:(1)SEPのサンプリングレートとノッチフィルター(60または50Hz、家庭用電力の周波数)を設定して、電源ラインからノイズを除去します。
3. ウィスカマッピングの場合は、細いスティックでウィスカを曲げます。
4. ボディマッピング用の木の棒で前足、前肢、後足、後肢、体幹を常に突く。
5. データ取得システムに指示された時間、神経信号を記録します。

5.動物の安楽死

1. すべての記録手順の後、>5%イソフルランを使用して麻酔でラットを犠牲にし、頸部解剖を行います。

6. 皮質マッピングのためのSEP測定

1. 信号解析のためにコードネーム read_Intan_RHS2000_file.m の MATLAB を開きます。
   注:read_Intan_RHS2000_file.mは「https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software」からダウンロードできます。
2. [実行]ボタンをクリックし、ファイル名拡張子が「.rhs」の録音ファイルを選択して、ファイルが処理されて読み取られるのを待ちます。
3. コマンド「plot(t, amplifier_data("チャンネル番号",:))」を入力して、記録データの2Dラインプロットを作成し、SEPを見つけて、すべてのチャンネルのSEPの振幅を計算します。
   注意: 「チャンネル番号」にチャンネル番号を入力します。たとえば、"plot(t, amplifier_data(1,:))" と指定すると、チャンネル 1 の 2D 折れ線グラフが作成されます。さらに、実験者が応答の振幅を計算するときに、各チャンネルから記録された応答を選択します。
4. SEPの振幅に応じてグリッドを異なる色相で着色してデータを取得します。
   注: MATLAB コマンド "imagesc" は、地形図をより迅速に取得するのに役立ちます。

Results

このプロトコルは、グラフェンマルチチャンネルアレイが脳の表面にどのように取り付けられるかを記述します。体性感覚マップは、物理的刺激に対する神経応答を取得し、応答の振幅を計算することによって構築されました。図1にこの実験の概略 図 を示す。

図2A は、グラフェン電極アレイの構造特性を示しています。電極間に基板の貫通穴があります。これらの穴は、電極が皮質表面にしっかりと接触するのに役立ちます(図2B)。皮質への電極の強い接着は、より少ないノイズで神経信号を記録するのに役立ちます。

図2C (左)は、異なる色でコード化されたひげ、体幹、足、および手足を刺激することによって獲得された位置依存性神経応答を示しています。ラットのミニチュア体であるラットホムンクルスは、体性感覚皮質マップの各色サイズの実...

Discussion

提示されたプロトコルは、グラフェン電極アレイを使用してラットの体性感覚応答にアクセスしてマッピングする方法を説明する詳細な段階的なプロセスを提供します。プロトコルで取得されたデータは、各身体部位にシナプス的にリンクされた体性感覚情報を提供するSEPです。

このプロトコルのいくつかの側面を考慮する必要があります。脳浮腫を予防し、炎症を軽減するために脳脊髄液を抽出する場合、実験者は大槽の前にある脳幹を損傷しないことが重要です。

顔のひげは、暗くて狭い環境など、周囲に関する触覚的な感覚情報を提供します。したがって、げっ歯類のウィスカーは、たわみ方向、刺激強度、および刺激されたウィスカーの位置を通じて物体を感知するのに十分に発達しています。体性感覚皮質は、各ウィスカーの曲げ方向、強度、および位置に異なる方法で応答します^18,19。したがって、このプロトコルでは、すべてのウィスカーが一定の強度と方向で刺激されます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
麻酔薬を注射	1mL注射器	KOREAVACCINE CORPORATION
3mLシリンジ	KOREAVACCINE CORPORATION
骨ロンジャー	ファインサイエンスツール	16220-14	Gbrain
			FALCONツール
ドリルビット	Osstem
を研削グレーフ虹彩鉗子わずかに湾曲した鋸歯状の	vubuudu-02-73010		組織を削除します頭蓋骨からまたはホールドワイパー
グラフェン多電極アレイ	Gbrain
イソフルラン	Hana Pharm Corporation
ケタミン	ユハン株式会社
リドカイン(2%)	ダイハン医薬品		局所麻酔薬
Matlab R2021b	Mathworks		データ分析 ソフトウェア
蚊止血剤	ファインサイエンスツール	91309-12	頭皮軟膏を固定
	アルコン		目が乾くのを防ぎます
povidone	グリーンファーマシューティカルコーポレーション		は、切開部を消毒します
RHS 32ch Stim/Record headstage	intan technologies	M4032	コネクタをインターフェースケーブルに接続し、intan RHS stim/amplifierチップを含む
RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI インターフェースケーブル	intan technologies	M3206	グラフェン電極をヘッドステージ
RHS Stim/Recording Controller ソフトウェアに接続します	intan technologies		データ収集ソフトウェア
RHS 刺激/記録コントローラー	intan technologies	M4200
生理食塩水	JW 医薬品
メス	ハンマッハ	HSB 805-03
定位固定装置			被験者を固定
滅菌 皮下注射針	KOREAVACCINE CORPORATION		は、硬膜
ブンアイリス組織鉗子	KASCO	50-2026	膜外科
用ブレードno.11	FEATHER		は頭皮の
外科用sicssors	ファインサイエンスツール	14090-09	頭皮をinscisし、硬膜
木製スティック			ウィスカー刺激
ラジン	バイエル韓国		麻酔に使用