フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

過去10年間は、細胞生物学および分子生物学への単一細胞アプローチの世界的な普及によって特徴づけられました。シングルセルゲノミクス^1,2のステップに続いて、今日では、毎年急成長している新しいシングルセルオミクス技術を使用して、単一細胞の多くの成分(DNA、RNA、タンパク質など)を研究することが可能です。これらの技術は、ヒト細胞とモデル生物細胞の両方を使用して、免疫学、神経生物学、腫瘍学などの分野の新旧の質問に光を当てました³。個々の細胞間の違いを強調することにより、シングルセルオミクスは、造血幹細胞と前駆細胞(HSPC)の不均一性を中心に、離散的な均質集団の古典的なモデルから離れて、造血の新しいモデルの定義を促しました^4,5。

すべてのオミクス技術のいくつかの欠点の1つは、目的の細胞が破壊され、その機能を評価する可能性を妨げることです。逆に、単一細胞移植アッセイおよび系統追跡技術などの他の単一細胞法は、in vivoで個々の細胞の運命を評価することによって祖先細胞の機能性の読み出しを提供する^6,7。系統追跡技術では、目的の細胞を遺伝性遺伝子⁷または蛍光標識^8,9で標識し、複数の単一細胞の運命を同時に追跡できます。しかしながら、出発細胞の特性評価は、典型的には、フローサイトメ^トリー10によって評価されたいくつかの表面タンパク質の発現など、限られた数のパラメータに制限される。さらに、シングルセル系譜追跡技術では、通常、DNA/RNAシーケンシングまたはイメージングを介して、細胞標識の面倒な検出が必要です。この最後の点は、特に1回の実験でテストできる条件の数を制限します。

単一細胞の機能性を研究するために使用される別のクラスの方法は、単一HSPCのex vivo細胞培養システムである。 実行が容易なこれらのゴールドスタンダードアッセイでは、個々の細胞を96ウェルの細胞培養容器にソーティングし、培養後に、通常はフローサイトメトリーまたは形態素解析によって細胞子孫の表現型を特徴付けます。これらのアッセイは、主にHSPCの成熟細胞への長期分化、典型的には培養2〜3週間後に特徴付けるために使用されてきた^11,12。あるいは、それらは、ヒト幹細胞移植に対する医学的利益を約束して、ex vivo HSPCs13、^14、15、16、^17、18を維持および拡大しようとするために使用されている¹⁹。最後に、それらは短期培養²⁰を使用してHSPCの早期コミットメントを研究するために使用されており、この培養で生成される細胞数が少ないことが主な制限要因です。これらの異なる種類のex vivoアッセイの1つの欠点は、それらがin vivoの複雑さを部分的にしか反映していないことです。それでも、それらはヒトHSPC分化を研究するためのまれな方法の1つです。

既存のシングルセル法(シングルセルオミクス、系統追跡、ex vivo培養)から欠落している情報の1つは、HSPCダイナミクスを研究する際に考慮すべき重要なパラメーターである細胞分裂の正確な検出です²¹。フローサイトメトリーで分割数を評価する簡単な方法は、5-(および6)-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)²²などの可溶性「タンパク質色素」を使用することです。これらの分裂色素は染色された細胞の細胞質内に拡散し、半分に希釈され、細胞分裂ごとに2つの娘細胞に渡され、最大10の分裂を列挙することができます。いくつかの分割色素を組み合わせることで、複数の個体前駆細胞を同じウェルに播種することができ、それぞれの個体色素が異なる子孫の分離を可能にするようにする。これは、マウスリンパ球に最初に導入されたマルチプレックスクローンおよび分裂追跡のための細胞色素の使用の背後にある原理^です23,24。

ここでは、マウスおよびヒトのHSPCで使用するためのMultiGenアッセイの開発を紹介します。これにより、多くの単一細胞を同時に試験して、分化、分裂、および親族関係の特性をex vivoでテストできます。このハイスループットで、実行が容易で、安価なアッセイにより、細胞の表現型、実行された分裂数、およびウェル内の他の細胞との細胞の親族関係とクローン関係をすべて同時に測定できます。対称的および非対称的な運命のコミットメント、自己複製と分化のバランス、および特定のコミットメントの運命に必要な分割の数を定量的に評価するために使用できます。このプロトコルには、蛍光活性化セルソーター(FACS)とプレートリーダー付きフローサイトメーターに加えて、細胞培養に必要な機器が必要です。ヒトHSPCでのアッセイを実行するための技術プロトコルに加えて、細胞^{ファミリー25}の概念に関連する細胞特性を評価するために必要な統計的テストを含む詳細な分析フレームワークも提供します。このプロトコルは、マウスHSPCコンパートメント^26,27を記述するためにすでに正常に使用されています。

以下のプロトコルは、磁気的に富化されたCD34⁺ 細胞を出発物質²⁸として使用する。このようにして、異なる血液源(例えば、臍帯血、骨髄、末梢血)からヒトHSPCを効率的に染色および単離することができる。CD34^- 画分は、異なるタイプの実験対照を設定するためのプロトコルの一部として使用されるため、廃棄しないことが重要です。上記の細胞量と体積は、実験ワークフローと必要性に応じてスケールアップまたはスケールダウンできます。同様に、このプロトコルは、細胞ソーティングおよびフローサイトメトリーのステップに使用される抗体を改変するだけで、異なるタイプの前駆細胞の研究に適合させることができます。

以下のプロトコルでは、匿名化された臍帯血をHSPCソースとして使用し、サンルイ病院臍帯血バイオバンク(承認AC-2016-2759)およびヘルシンキ宣言によって定義されたガイドラインに従って収集されました。

注意: 開始する前に、 材料の表 に記載され、プロトコルに記載されているように、このプロトコルに必要なすべての試薬と機器が利用可能であることを確認してください。関連する試薬を新鮮に準備し、明示的に言及されていない限り、保管しないでください。

1. 細胞色素染色

注:このセクションでは、CFSEとバイオレット染料(CTV)細胞分裂染料の4つの組み合わせによる染色について説明します。細胞色素溶液を添加しなくても、すべてのチューブを同時に処理します。全ての工程は、以下の細胞培養工程を可能にするために無菌条件下で行われる。所要時間:約100分

1. 磁気選別プロトコル²⁹に従って臍帯血ユニットを処理する。大きなCD34^- 画分と小さいCD34⁺ 画分の2つの画分が利用可能であることを確認してください。両方のチューブを300 x gで5分間回転させます。ペレットを乱すことなく上清を吸引する。
2. CD34⁺ 画分については、ウシ胎児血清(FBS)を含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)1 mLに再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞密度は、3 x 10⁶ 細胞/ mLを超えてはなりません。この場合は、それに応じて音量を調整してください。CD34^- 画分については、FBSなしでDMEMに再懸濁し、容量を最大6 x 10⁶ 細胞/ mLに調整します。
3. 250 μLのCD34⁺画分を4本の15 mLポリプロピレンチューブに分注します。チューブに次のようにラベルを付けます:CD34 + / CF(CFSE_only)、CD34 + / CV(CFSE_high CTV_low)、CD34 + / VC(CFSE_low CTV_high)、およびCD34 ⁺ / VI(CTV_high)。250 μLのCD34^-画分を別の4本の15 mLポリプロピレンチューブに分注します。チューブに次のようにラベルを付けます:CD34^-/ CF(CFSE_only)、CD34-/ CV(CFSE_high CTV_low)、CD34-/ VC(CFSE_low CTV_high)、およびCD34^-/ VI(CTV_high)。CD34^-画分由来の残りの細胞は廃棄することができる。
4. CFSE_high と CFSE_low という名前の 2 つの CFSE ソリューションを準備します。CFSE_high(10 μM)の場合、FBSなしのDMEM1.1 mLとCFSEストック(5 mM)溶液2.2 μLを混合します。CFSE_low (5 μM) の場合は、FBS なしの DMEM 550 μL と CFSE ストック (5 mM) 溶液 0.55 μL を混合します。
5. CFチューブとCVチューブに250 μLのCFSE_high溶液、VCチューブに250 μLのCFSE_low溶液、FBSなしのDMEM250 μLをVIチューブに加えます。細胞懸濁液と細胞色素を効率的に混合するには、チューブをほぼ90度傾け、CFSE溶液をチューブ壁に堆積させます。次に、チューブを垂直に保持して2つの溶液を混合し、ピペットを3〜4回使用して、CFSE溶液と再懸濁された細胞との迅速な混合を確保します。37°Cで正確に8分間インキュベートします。

FACS ソート
このプロトコルで提示されたソートゲーティング戦略は、広く受け入れられている戦略12、30、31に基づいている。図1に示すゲーティング戦略では、出発物質はCD34+磁気濃縮によって以前に精製された臍帯血前駆細胞であり、これは系統陽性細胞のごくわずかな割合を説明しています。4つの細胞内色素の組み合わせ(図のCTVなど)にはタイトなゲートを使用し、次の分析中にピークの分解能を向上させ、正しい細胞集団をゲートすることが不可欠です(図1D)。図に表示されているケースでは、ゲートは最大かつより明確に定義された母集団を選択します。細胞分裂色素の組み合わせごとに複数の近い集団が存在することは、私たちの経験では、生物学的な違いを表すものではありません。代わりに、a)最適ではない染色手順、またはb)細胞の開始プールにおける大きな不均一性(特にサイズ)を示している可能性があります。これは、臍帯血または他の複雑な生物学的供給源(例えば、骨髄穿刺、末梢血)から開始する場合、予想外ではない。ゲートが厳密に定義されていない場合、異なる色素の組み合わせを徐々に希釈すると、特に条件CVとVCに対して、後のピークがマージされる可能性があります(図2D)。次善ゲーティングの別の悪影響は、不均一な開始集団が浅いピークにつながる可能性があるため、細胞培養後に異なるピークを効率的に区別できないことです。

図1:セルソーティングのためのゲーティング戦略。 (A)FSC-A対SSC-A、デブリおよび汚染細胞を除外する。(b)FSC-A対FSC-H、ダブレットおよび細胞凝集塊を除外する。(c)Lin対FSC-Hが、Lin+である細胞を除外する。(d)CTV対CFSEを、色素組合せCF、CV、VC、およびVIで染色した細胞を一義的に同定する。ゲートは、均質な人口を含めるのに十分厳密でなければなりません。(e)CD34対CD38を、CD34+CD38−の多能性区画から制限された前駆細胞CD34+CD38+(HPCsとも呼ばれる)から分離する。(f)CD45RA対CD90は、CD34+CD38-集団から、造血幹細胞に富む最も未熟な前駆細胞(CD90+CD45RA−)、LMPP(CD90中期CD45RA+)、およびよりコミットされたMPP(CD90−CD45RA−)の間で分離する。(G)それらの細胞色素組合せ染色および(H)表面マーカーCD90およびCD45RAの発現についてここに表されるソートされた事象のインデックス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞培養後のフローサイトメトリー解析
図2のデータは、さまざまな骨髄系前駆細胞および前駆体をサポートできる複数のサイトカインの存在下で72時間培養したヒト臍帯血HSCの代表です。パネル2A〜2Dは、個々の細胞の各々の親族関係を確立するために必要なゲーティングを表し、一方、パネル2E〜2Gは、細胞表現型形成を可能にする。図中のMEPsの存在の減少は、おそらくこの代表的な実験に使用された培養条件の結果です(図2F)。異なるサイトカインおよび培養条件を使用して、実験のために異なる開始細胞を選択するのと同様に、各サブセットの相対的なパーセンテージを変化させる。

図2:フローサイトメトリー解析のためのゲーティング戦略。 (a)FSC-A対SSC-A、デブリおよび汚染細胞を排除する。(b)FSC-A対FSC-H、ダブレットおよび細胞凝集塊を除外する。(C)CTV対CFSE、ゲートラベルにより、データ分解能に影響を与える可能性のある自動蛍光イベントを除外できます。(D) CTVとCFSEの比較。細胞分裂色素希釈に基づいて、4つの集団を厳密にゲートすることが非常に重要です。(e)CD34対CD38、コミットされた前駆体(CD34-)、制限された前駆細胞(HPC)(CD34+CD38+)、および未熟な前駆細胞(CD34+CD38-)を区別する。(F)CD45RA対CD123、CMP(CD123+CD45RA−)、MEP(CD123−CD45RA−)、およびGMP(CD123+CD45RA+)の3種類の制限前駆細胞を区別する。(G)CD45RA対CD90、CD34+CD38-から、HSC、LMPP、およびMPPを同定する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ピークの定義と割り当ての手順(図3および図4)はプロトコルの重要な側面であり、厳密なゲートの定義が必要です。ピーク定義(図3)では、信頼性の高い同定のために少なくとも1,000イベントが必要です。この意味で、「バルク」ウェルの細胞選別ステップ中により多くの細胞を単離することが有益である可能性があります。図4は、複数のファミリーを含む単一ウェルの4つの例を示しています。この図は、図2Dと図3のゲーティングの重要性、特に各ファミリと各ピークの識別にとっての重要性を明確にしています。図4Aは、ゲートCF内のすべてのセルが互いに非常に近く、単一のピークに容易に割り当てることができるため、簡単な例を示しています。図4Cは、図4Dのヒストグラムに明確に示されているように、2つのよく離れたピークに一義的に分布するファミリーの別の例を示しています。図4E,Gは、多数のイベントに基づく厳密なゲーティングの重要性を明らかにしています。どちらも近いイベントはほとんど表示されませんが、染料の組み合わせゲートの外側にあります。これらのイベントは、シングルウェル分析のみに基づいて、VIゲートとCFゲートに誤って含まれる可能性があります。最後に、図4F、Hは、複数のピークに広がるファミリーの2つの異なる例を示しており、1つは2つの同様の強度ピークの例(図4F)と1つは2つの等しくない強度ピーク(図4H)を示しています。

図3:フローサイトメトリー解析のピーク定義。 (A-D) ピークは、個々のピークごとに適切な表現を保証するために、少なくとも500のイベントを登録するように定義する必要があります。(A) CFSE-A 強度のヒストグラム。いくつかのピークを同定することができ、それぞれが分裂細胞の異なる集団に対応する。(B,C)導出されたパラメータの強度についてのヒストグラムは、CFSE−CTV混合物、CV(B)およびVC(C)をそれぞれ表す。(D)CTV-A強度のヒストグラム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ピーク割り当て 。 (A,B) このウェルでは、CFゲートで1つのピークしか検出できません。(C,D)ほぼ等しい強度の2つのピークが、VIゲートのこのウェルで検出できます。ピークはよく解決されています。(E,F)同等の強度の2つのピークは、VIゲートのこのウェルで検出できます。バルク井戸を使用して設定された戦略に基づいて、ゲート内のイベントのみが考慮されています。(G-H)強度が等しくない2つのピークが、このウェルのゲートCFで検出できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

データ表現と統計的検定
図5は、細胞培養の72時間後に行われた2つの別々の実験の異なるタイプのデータ表現を示す。HSCとMPPは、細胞分裂と分化の特性を変化させると思われる2つの異なる細胞培養培地で培養されています。これらのメディアは "Diff" (Differentiation)32 および "GT" 33 という名前が付けられています。1つ目は、エリスロポエチン(EPO)と顆粒単球コロニー刺激因子(GM-CSF)を含むため、骨髄系と赤血球の分化を促進し、2つ目は遺伝子治療の臨床試験の文脈で開発されており、HSPCの高い割合を維持および増幅することを目的としています。 図5A は、条件「Diff」の代表的なヒートマップであり、様々な細胞ファミリーを表し、 細胞の運命と分裂の両方において。このヒートマップでは、各行は個々のファミリを表し、各正方形は個々のセルを表し、列は同じ世代のすべてのセルをグループ化しています(たとえば、第2世代のセルは少なくとも2回分割されています)。単一の細胞型で構成され、同じ数の分裂を示す非常に均質なファミリー(例:ファミリー#63)と、2世代にわたる3つの細胞タイプを含む不均一なファミリー(例:ファミリー#84)を区別することができます。この分析の細胞回収率は約70%であるため、すべての細胞が異なる世代で回収されることによって定義される完全なファミリー(たとえば、第1世代の1つの細胞のファミリーと第2世代の2つの細胞のファミリー)はほとんど観察されません( 図5AのID番号の横にハッシュタグを表示)。不完全な検出を説明する複数の説明があり、技術的(染色の問題、プロトコルによる細胞損失)または生物学的(細胞死および/またはアポトーシス)である可能性があります。技術的な制限は、個々のサンプルに関連するデッドボリュームを減少させるように設計されたアナライザーを使用し、細胞培養プレート内で直接細胞染色を実行して容量ピペッティングを減らすことによって克服できます。逆に、細胞死の量を決定するための直交的な方法(例えば、生細胞イメージング実験 を介して)は、不完全な検出をもたらす技術的および生物学的要因を区別するのに役立つ。

図5Bはバルク アッセイを実施したかのように、細胞型組成物に対する培養条件の影響を可視化する方法を示す。ここで、Diff条件は、より多くの運命を促進し、CD34+ 細胞(CD34-を除くすべての細胞型として定義される)の割合が高い。信頼区間は、基本的なブートストラップ を介してスクリプトで計算され、250,000のブートストラップデータセットがあります34。 図5 の他のすべてのヒストグラムは、同じ方法で計算された信頼区間を示していることに注意してください。 表5 は、各世代のファミリー数とセル数に関するすべての情報を要約したものです。

図5Bii は、スクリプト「2_bar_plot」で実行された統計的検定の出力をグラフィカルに表しています。統計的枠組みの正式な説明が利用可能です26。簡単に言うと、このフレームワークは、観察されたすべての細胞間の独立性を必要とする古典的な統計とは対照的に、同じファミリーの細胞が依存していると仮定しながら、統計的仮説検定を可能にします(それ自体がテスト可能な仮定)。図に示されている特定のケースでは、統計的検定は、培養中に存在するさまざまな細胞タイプの頻度として測定されるMPPの細胞運命の選択が、使用される細胞培養条件とは無関係であるという仮説に挑戦します。まず、G検定統計量を使用して、異なる細胞培地からの細胞タイプ頻度間の不一致を評価します( Biiの例では、この統計量は赤いバーで表されます)。次に、データのランダム化が順列 によって 実行され、2つの細胞培養条件間で細胞のファミリー全体が交換されます。これは、各セット内のファミリー数を元のデータと一致しながら、ファミリー関連セル間の依存性を維持するためです。G検定統計量は、ランダム化されたデータセットから計算されます。 5Bii で表される青色の値は、250,000順列のG検定統計量です。最後に、元のデータセットが置換されたデータセットの分布からどの程度逸脱しているかを評価するために、 p 値が計算されます。この例では、元の統計量は分布から大きく逸脱しているため、 p値が小さくなり、MPPの細胞運命は培養条件とは無関係であるという仮説が棄却されます。

図5C は、最大世代当たりの細胞ファミリーの割合を表し、異なる条件が細胞ファミリー当たりの細胞分裂をどのように変化させるかを探る。このデータプロットは、72時間で、Diff条件で培養された細胞がGT条件の細胞よりも多くの分裂を完了することを示しています。表されるのは各ファミリごとの最大世代数であるため、世代 1 と 2 のセルを表示する 1 つのファミリは、世代 2 と見なされます。 図5B に用いたのと同じ統計的枠組みを使用して、細胞分裂と培養条件との間の独立性を統計的に検定することができる。

図5D は、さまざまな祖先タイプ(HSCまたはMPP)の最初の分割の対称性/非対称性のタイプを調べています。2つの娘細胞を姉妹細胞として決定的に確立できる唯一の世代である第1世代の完全な細胞ファミリーについては、4つの異なるタイプの対称性/非対称性を定義することができます:「Sym Undiff」というラベルは、両方の娘が起源細胞の表現型を保持するファミリーを表します。「Sym Diff」とは、両方の娘が同じ表現型を持ち、起源の細胞とは異なることを意味します。「Asym Undiff」とは、1人の娘が起源細胞の表現型のみを保持することを意味します。最後に、「Asym Diff」は、両方の娘が異なる表現型を持ち、それらのどれも起源の細胞と同じではない家族を説明します。これらの対称/非対称運命を評価する際に統計的検出力を得るには、第1世代に子孫が見られるより多くの家族を観察するために、早い時点でMultiGen分析を実行することが望ましい。

最後に、 図5E は、分裂数の関数としての細胞型の割合を表し、分裂間の分化パターンの進行に関する洞察を得る。たとえば、図に表示されているデータは、細胞がCD34- 状態に進行し、検出された細胞の50%以上がこのクラスでわずか3回の分裂後に進行することを示唆しています。さらに、MPPは、細胞のごく一部が元の表現型を保持するため、自己複製分裂を好まないと推測することが可能です。これらの結論のいくつかは、前の図に示されている統計的枠組みを使用してテストできます。

図5:臍帯血HSPCを使用した1つの72時間実験のデータ表現の例。 (A)選択したデータセットのヒートマップ(HSC、「差分」培地、培養72時間後)。プロットは、親族関係(行)、実行された分割数(列、生成と呼ばれる)、および表現型(色)に従って、すべての個々のセル(正方形)を表します。(バイ)条件GTと条件Diffの間で、HSCとMPPの細胞子孫の細胞型の比率を比較するヒストグラム(Bii)グラフは、培養72時間でMPPの「2_bar_plot」スクリプトで実行された統計的テストを表し、「Diff」サイトカインカクテルと「GT」を比較します。実験値は赤で表示され、250,000順列 によって 生成された値は青で表示されます。G検定の p. 値は、検定に使用されたファミリの数とともに右上隅に表示されます。(C)培養条件ごとのHSCとMPPについて、各世代(合計314家族)の家族の割合(合計314家族)を比較したヒストグラム。信頼区間は、250,000個のブートストラップされたデータセットで計算されます。(D)第1世代に2つの細胞を持つファミリーの娘細胞の運命間の対称性/非対称性のタイプを表すヒストグラム:Sym Undiff(両方の娘が起源細胞の表現型を保持する)、Sym Diff(両方の娘が同じ表現型を持ち、起源の細胞とは異なる)、Asym Undiff(1つの娘だけが起源細胞の表現型を保持する)、 とAsym Diff(両方の娘は異なる表現型を持っており、それらのどれも起源の細胞に似ていません)。(E)「Diff」カクテルで培養したMPPについて、世代ごとに分類された細胞タイプの寄与のヒストグラム。n = 204個の細胞と97個のファミリー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表5:各実験条件ごとに分析したファミリーおよび細胞数(由来細胞および細胞培養培地)の説明。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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