一本鎖DNA免疫蛍光法を用いた卵巣癌細胞の複製ストレスの定量化(英語)

サマリー

ここでは、細胞内の一本鎖DNAのレベルを定量するための免疫蛍光ベースの方法について説明します。この効率的で再現性のある方法は、いくつかの卵巣癌に共通する特徴である複製ストレスを調べるために利用できます。さらに、このアッセイは自動分析パイプラインと互換性があり、効率がさらに向上します。

要約

複製ストレスは、いくつかの卵巣癌の特徴です。複製ストレスは、二本鎖切断、転写複製の競合、増幅された癌遺伝子など、複数のソースから発生する可能性があり、必然的に一本鎖DNA(ssDNA)が生成されます。したがって、ssDNAを定量することは、さまざまな細胞タイプおよびさまざまなDNA損傷条件または治療下での複製ストレスのレベルを評価する機会を提供します。新たな証拠はまた、ssDNAがDNA修復を標的とする化学療法薬に対する反応の予測因子になり得ることを示唆している。ここでは、ssDNAを定量するための詳細な免疫蛍光ベースの方法論について説明します。この方法論では、ゲノムをチミジン類似体で標識し、続いて非変性条件下でクロマチンで類似体を抗体ベースで検出します。ssDNAのストレッチは、蛍光顕微鏡下で病巣として視覚化できます。病巣の数と強度は、核内に存在するssDNAのレベルと直接相関しています。また、ssDNAシグナルを定量するための自動パイプラインについても説明します。この方法は迅速かつ再現性があります。さらに、この方法論の単純さは、薬物および遺伝子スクリーニングなどのハイスループットアプリケーションに適しています。

概要

ゲノムDNAは、さまざまな内因性および外因性のソースからの複数の攻撃に頻繁にさらされます¹。内因性損傷の頻度は、卵巣がんを含む複数のがんタイプで本質的に高い活性酸素種やアルデヒドなどの代謝副産物のレベルと直接相関しています^2,3。DNA損傷を効率的に解決することが不可欠です。そうでなければ、遺伝毒性病変を促進し、その結果、突然変異誘発を促進する可能性があります。遺伝毒性病変を修復する細胞の能力は、エラーのないDNA修復経路の機能およびDNA損傷に応答する細胞周期進行の効率的な調節に依存しています。特に、多くの卵巣癌はp53の機能的に不活性化する変異を持っているため、欠陥のあるG1 / Sチェックポイントがあり、修復されていないゲノム病変が存在するにもかかわらず、細胞がDNA複製を開始するように導きます^4,5。卵巣癌におけるDNA損傷の程度は、高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の50%以上が、エラーのないDNA修復経路であるBRCA1およびBRCA2を介した相同組換えに欠陥があり、約20%が遺伝子CCNE1に増幅があり、G1細胞を時期尚早にS期に押し込むという観察によってさらに悪化^します6....

プロトコル

注:卵巣がん細胞株であるOVCAR3がこれらのステップで使用されましたが、このプロトコルは、非卵巣源に由来するものを含む、他の複数の細胞株に広く適用できます。プロトコルの概略図を 図2に示します。

1.セルのメッキ

1. ポリ-L-リジンコーティングされたカバーガラスを作ります。
   1. オートクレーブ滅菌した直径12 mmのカバーガラスを、ポリ-L-リジン溶液を入れた50 mLのコニカルチューブに加え、ロッカーに15分間置きます。
   2. 組織培養フードで溶液を吸引します。滅菌水を加えてカバーガラスを洗い、カバースリップを含むチューブをロッカーに5分間戻します。この洗浄手順を3回繰り返します。
   3. コーティングされたカバーガラスを滅菌皿に広げ、残っている水を吸引します。カバーガラスを組織培養フード内で1時間、または水滴がなくなるまで乾燥させます。乾いたら、皿をパラフィルムで密封し、4°Cに置きます。
2. ポリL-リジンコーティングカバーガラスを24ウェルプレートの各ウェルに1枚入れます。ポリリジンカバースリップの使用は、抽出前のステップ中にカバースリップから細胞が剥離するのを防ぐために重要です。
3. OVCAR3細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したらトリプシン処理しま....

結果

代表的な画像および未処理の細胞および0.5 mMヒドロキシ尿素で24時間処理した細胞に由来する核からのIdU病巣の定量を 図4に示します。両方の核は染色されており、DAPIチャネルで識別可能です。これらの画像の分析は、各核の病巣の数を定量化することからなる。病巣の数は、複製ストレスの程度に比例する。

図1:ssDNA生成のメカニズム。 細胞内でssDNAを生成できるさまざまなメカニズムを示すための概略図。これには、(A)複製機構の失速、(B)転写機構の失速、Rループ、(C)DNA.......

ディスカッション

プロトコルで述べたように、アッセイが機能していることを確認するために、いくつかの実験的コントロールを含めることは価値があります。これらには、IdU処理されていないサンプルと一次抗体処理されていないサンプルが含まれます。両方のネガティブコントロールは、DAPIによって染色されているがIdUシグナルを含まない細胞を生成する必要があります。

実験条件と使用した細胞株に基づいて、最良の蛍光シグナルを得るために異なる抗体希釈が必要になる場合があります。シグナルが多すぎると個々の病巣を定量化できなくなる可能性があり、シグナルが少なすぎるとサンプル間の実験の違いを特定できない可能性があります。抽出前および透過処理時間を調整することは、未抽出の核質内容物から生じる可能性のあるバックグラウンドシグナルが多すぎる場合にも役立ちます。

このプロトコルでは、2つの集団倍加にわたってIdUを組み込む必要があるため、各細胞株の倍加時間を考慮することが重要です。倍加時間が異なる2つの細胞株を比較する場合、各細胞株の倍加時間に合わせてパルスするIdUの長さを.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3% パラホルムアルデヒド (PFA)	フィッシャーサイエンティフィ		スクロース 10 g + 100 mL 10X PBS + 水NC0179595して、容量を 925 mL にします。75 mL 40%メタノールフリーPFAを加え、混合し、50 mLのアリコートを調製してから保存 保存:-20°Cで保存します。C
5-ヨード-2'-デオキシウリジン (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.10 mMストックの場合:3.541 mg IdUを1 mL 1 N液体アンモニア に溶解します 保存:-20°Cで保存します。C
抗 BrdU 抗体	BD Biosciences	347580	保管: 4 °C で保管;C
抗マウス Alexa Fluor Plus 488 二次抗体	Thermo Scientific	A32766	感光性 - 暗所に保管 保管: 4 °C で保管;C
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマアルドリッチ	A7906-100GPBS	の体積に特定の質量を追加して作られました ストレージ:4°Cで保存します。C
サーキュラーカバーガラス	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3ソフトウェア	ニコン
OVCAR3	ATCC	HTB-161	成長培地: RPMI L-グルタミン、0.01 mg/mL ウシインスリンを補充; ウシ胎児血清の最終濃度 20% および 1X Pen Strep 保存: 凍結培地: 増殖培地 + 5% DMSO および -80 °C で保存;C
Poly-L-Lysine溶液	シグマアルドリッチ	P4832-50ML	保存:4°Cで保存します。
C ProLong Diamond 退色防止剤(DAPI	Thermo Scientific	P36962	保管:4°C;C
トリプシン-EDTA、0.25%	ジェネシー・サイエンティフィック	25-510	保管: 4 °C;C
水、滅菌ろ過	シグマアルドリッチ	W3500-6X500ML	ストレージ:4°Cで保存します。ハ

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