方法論記事

尿由来の霊長類人工多能性幹細胞の作製と維持

DOI：

10.3791/64922

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2023年7月28日

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1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

この記事について

サマリー

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本プロトコルは、ヒトおよび非ヒト霊長類の尿由来細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に単離、増殖、および再プログラムする方法、ならびに新たに生成されたiPS細胞のフィーダーフリー維持のための指示書を記載している。

要約

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霊長類多能性幹細胞とその誘導体を研究する種間アプローチは、疾患、発生、および進化の分子および細胞メカニズムをよりよく理解するために重要です。霊長類人工多能性幹細胞(iPSC)をより利用しやすくするために、本論文では、尿由来細胞からヒトおよび非ヒト霊長類iPS細胞を非侵襲的に生成する方法と、フィーダーフリー培養法によるそれらの維持について紹介する。

尿は、非滅菌環境(動物のケージなど)からサンプリングし、初代細胞培養中に広域抗生物質カクテルで処理して、汚染を効率的に減らすことができます。尿由来細胞の増殖後、市販のセンダイウイルスベクター系の改変形質導入法によりiPS細胞が生成される。最初のiPS細胞コロニーは、5日後にすでに見えている可能性があり、早くても10日後に摘み取ることができます。酵素フリー解離バッファーによるルーチンの凝集継代は、50回以上の継代で生成されたiPS細胞の多能性をサポートします。

概要

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ヒト霊長類と非ヒト霊長類(NHP)のゲノム比較は、私たちの進化の歴史とヒト特異的形質の進化を理解するために重要です1。さらに、これらの比較は、保存されたDNA配列2を同定することによって、例えば、疾患関連変異体3に優先順位を付けることによって、機能の推論を可能にする。遺伝子発現レベルなどの分子表現型の比較は、ゲノム比較をより適切に解釈し、たとえば細胞表現型の違いを発見するために重要です。さらに、DNAレベルでの比較と同様に、機能的関連性を推測し、したがってヒト内の医学的に関連する変異をより適切に解釈する可能性があります4。これらの比較研究に包括的な分子表現型データを組み込むには、適切な生物学的資源(すなわち、種を超えたオーソログ細胞)が必要です。しかしながら、倫理的および実際的な理由により、特に発生中は、そのような同等の細胞にアクセスすることが困難または不可能である。人工多能性幹細胞(iPSC)は、インビトロでそのようなアクセスできない細胞型の生成を可能にし5、6、実験的にアクセス可能であり、霊長類の比較に使用されている6、7、8、9、10、11、12、13、14。

iPS細胞を作製するには、再プログラムする初代細胞を獲得する必要があります。尿から単離された細胞は、霊長類から非侵襲的にサンプリングでき、おそらく幹細胞のような分子プロファイルのために容易に再プログラムできるという利点があります15。霊長類のiPS細胞を維持するための培養条件は、リプログラミングと同じくらい重要です。古典的に、ヒト多能性幹細胞の培養には、未定義の血清ベースの培地と、胚性幹細胞(ESC)に必須栄養素と足場を提供するマウス胚性線維芽細胞(いわゆるフィーダー細胞)の共培養が必要でした16。化学的に定義されたフィーダーフリー培養システム17,18の開発以来、現在、市販のiPS細胞培養培地およびマトリックスには様々な選択肢がある。ただし、これらの培養条件のほとんどはヒトESCおよびiPS細胞用に最適化されているため、NHP iPS細胞培養ではあまりうまく機能しない可能性があります。このビデオプロトコルでは、尿路細胞培養由来のヒトおよびNHP iPS細胞を生成および維持するための手順を提供します。

2006年に線維芽細胞における定義因子の強制発現によるiPS細胞作製が初めて報告されて以来、本手法は様々な起源の様々な細胞型に適用されている19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 、32。このうち、尿由来の細胞のみが完全に非侵襲的に得ることができる。Zhouら33による前述のプロトコルに基づいて、広域抗生物質15を補充することにより、非滅菌サンプルからでも霊長類の尿から細胞を単離および増殖させることができます。特に、このプロトコルによってサンプリングされた尿由来細胞は、線維芽細胞の従来の再プログラミング(私たちの経験では20〜30日)よりも短い期間(コロニーが5〜15日で見えるようになる)でiPS細胞を産生する可能性が高いことを示し、十分に高い成功率を示します。これらの尿由来細胞は、間葉系幹細胞様細胞と膀胱上皮細胞の混合集団に分類され、高い初期化効率を生じさせた15。

初代細胞のばらつきに加えて、iPS細胞を生成するためのリプログラミング方法も使用目的によって異なります。ヒト体細胞に対する従来のリプログラミング手順は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによるリプログラミング因子の過剰発現によって行われ、これにより、ゲノム5,34,35への外因性DNAの組み込みが可能になりました。生成されたiPS細胞をゲノム的に無傷に保つために、研究者は多種多様な非組み込みシステムを開発しました-切除可能なPiggyBacベクター36,37、エピソームベクター38,39、センダイウイルス40やアデノウイルス41などの非組み込み型ウイルスベクター、mRNAトランスフェクション42、タンパク質トランスフェクション43,44、および化合物処理45.効率と取り扱いの容易さのために、センダイウイルスベースのリプログラミングベクターがこのプロトコルで使用されます。初代細胞の感染は、プレーティング前に5の感染多重度(MOI)で細胞およびウイルスの1時間の浮遊培養で行われる。この修正されたステップは、ウイルスが付着細胞培養物に直接添加される従来の方法と比較して、細胞表面とウイルスとの接触の可能性を高め、したがってより多くのiPS細胞コロニーをもたらす可能性がある15。

ヒトおよびNHP多能性幹細胞の継代は、凝集継代および単一細胞継代によって行うことができる。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)は、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを結合し、カドヘリンとインテグリンの付着活性を防ぐコスト効率の高いキレート剤です。EDTAは、接着分子が異なるため、未分化細胞が分化細胞より先に剥離するため、穏やかな選択的解離試薬としても使用されます。完全な解離は、プロテインキナーゼ(Rho/Rock)を介したミオシンの過活性化を含むRho/Rho関連コイルドコイルを介して霊長類iPS細胞の大量細胞死を誘導します。したがって、培養培地にRho/Rock阻害剤を補充することは、懸濁液中の単一細胞を必要とする実験に不可欠です46,47。このプロトコルでは、ルーチン継代法として凝集継代を推奨し、定義された細胞数の播種が必要な場合やサブクローニング中など、必要な場合にのみシングルセル継代を推奨します。

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プロトコル

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この実験手順は、人体実験に関する責任ある倫理委員会(20-122、Ethikkommission LMU München)によって承認されました。すべての実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施した。
注:ヒトおよびNHPサンプルを扱う実験を開始する前に、適切な倫理委員会から承認を得る必要があります。すべての実験手順は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行する必要があります。以下の各ステップは、生物学的安全キャビネット内で滅菌技術を使用して実行する必要があります。すべての緩衝液および培地組成物は、 補足表S1に見出すことができる。セルに加える前に、すべての培地が室温(22°C)に温められていることを確認してください。各遠心分離ステップは、特に言及しない限り、室温で実行する必要があります。

1.尿サンプルからの細胞の分離

注意: 人間のドナーがヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、およびC型肝炎ウイルス(HCV)に感染していないことを確認してください。NHPの場合、可能性のあるドナー/細胞に特定の病原体であるBウイルス(BV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、サルベータレトロウイルス(SRV)、およびサルT細胞リンパ球向性ウイルス(STLV)がないことを確認してください。

  1. 1ウェルあたり0.2%ゼラチンを500μL添加してゼラチンコート12ウェルプレートを作製し、プレートを動かして液体を分配する。必要になる前に、37°Cで少なくとも30分間置きます。
  2. 50mLのコニカルチューブでヒトの尿サンプルを収集します。霊長類の場合は、注射器で動物施設の床から尿を集めます。
    注:5mLの尿容量は、試行の42%で少なくとも1つのコロニーを分離するのに十分であることが証明されました。ただし、コロニーを分離する可能性を高めるために、より大量の~50 mLの尿を使用することをお勧めします。NHP尿は、できるだけ新鮮に、できれば排尿直後にサンプリングする必要があります。尿サンプルを4°Cで4時間保存しても、プロトコルの成功率に悪影響はありませんでしたが、より長い保存時間はテストされませんでした。
  3. 尿含有チューブを400 × g で10分間遠心分離し、チューブ内に約1 mLを残して上清を注意深く吸引します。
  4. ペレットを残りの1 mLの液体に再懸濁します。複数の尿管が採取された場合は、懸濁液を1本のチューブにプールします。
  5. 2.5 μg/mLのアムホテリシンを含む10 mLの尿洗浄バッファー( 補足表S1を参照)をチューブに加えて細胞を洗浄し、血清学的ピペットを使用して懸濁液を注意深く混合します。
  6. チューブを200 × g で10分間遠心分離し、上清を注意深く吸引し、チューブ内に約<0.2 mLを残します。
  7. 最初に処理された尿50 mLあたり0.5 μg / mLのアムホテリシンを含む1 mLの一次尿培地( 補足表S1を参照)に細胞ペレットを再懸濁します(50 mL未満の尿が処理された場合でも、1 mLで再懸濁します)。.
  8. ウェルからゼラチンを吸引し(ステップ1.1で調製)、およびステップ1.7からの懸濁液のプレート1mLを12ウェルプレートの1ウェルに入れる。必要な数のウェル、または利用可能な数ミリリットルの懸濁液に対して繰り返します。
    オプション:不衛生なサンプル採取による汚染を避けるために、100 μg/mLの抗菌試薬を細胞に加え、最初の継代まで細胞に添加します。
  9. プレートを37°C、5%CO2 インキュベーターに入れます。
  10. 既存の培地を除去せずに、5日目まで毎日ウェルあたり1 mLの一次尿培地を追加します。.
  11. 5日目に、プレートから4 mLの培地を吸引し、約1 mLの培地を残します。ウェルあたり1 mLのREMC培地(補足表S1を参照)を添加して、新しい培地と1:1の混合物を得ます。
  12. 最初のコロニーが現れるまで、毎日培地の半分をREMC培地に交換する(図1A、B)。したがって、1 mLの古い培地を除去し、1ウェルあたり1 mLの新鮮なREMC培地を追加します。

2.尿細胞の増殖

注:尿中細胞の継代は、培養が90%のコンフルエントに達する前に実施する必要があります。

  1. ステップ1.1に記載されているように、希望量のゼラチンコーティングされた12ウェルプレートを準備します。
  2. 古い培地を吸引し、1 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を加えて細胞を洗浄します。
  3. DPBSを吸引し、DPBSで希釈した0.5倍解離酵素を300 μL加えます。プレートを37°Cで5分間インキュベートします。
  4. 700 μLのREMC培地を加えて酵素反応を停止します。細胞が単一細胞に解離するまで、P1000ピペットを使用して懸濁液を静かにピペットでピペットします。
  5. 細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、チューブを200 × g で5分間遠心分離します。
  6. 上清を注意深く吸引し、ペレットを1 mLのREMC培地に再懸濁します。
  7. セルカウンター(血球計算盤または自動セルカウンター)を使用して細胞をカウントします。
  8. 尿中細胞の増殖のために、1mLのREMC培地中のプレート1.5×104 〜3×104 細胞を0.2%ゼラチンでコーティングした1つの12ウェルプレートに入れる。
  9. 培養が80%〜90%のコンフルエントに達するまで、その後の培地交換を1日おきに行います。したがって、古い培地を吸引し、1mLの新鮮なREMC培地を追加します。

3. センダイウイルスベクター感染によるiPS細胞の作製

メモ: 再プログラミング手順のワークフローについては、 図2Aを参照してください。リプログラミングに使用される尿中細胞はできるだけ若くすべきであるが、継代4の前にリプログラミング効率の顕著な損失は観察されない。センダイウイルスリプログラミングキットは、BL-2施設で使用する必要があります。層流のある生物学的安全キャビネットの下でウイルスを処理し、粘膜への曝露を防ぐために常に適切な安全装置を使用してください。

  1. 1ウェルあたり500μLの基底膜マトリックスを添加して基底膜マトリックス被覆12ウェルプレートを作製し、プレートを移動させて液体を分配する。プレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートし、基底膜マトリックスを900 μLのREMC培地で交換します。プレートは使用するまで37°Cで保管してください。
  2. 仙台リプログラミングキットのコンポーネントを37°Cの水浴ですばやく解凍します。センダイウイルス(ポリシストロニックKLF4-OCT3/4-SOX2、cMYC、およびKLF4)をMOI5で混合し、最大100μLのREMC培地を追加します。 式 (1) を使用します。
    細胞研究応用のためのウイルス体積式の計算式,MOI法,方程式
    注意: ウイルス力価はロット間で異なるため、製造元が提供する分析証明書で力価を常に確認してください。
    オプション:さらに、緑色蛍光タンパク質(GFP)センダイウイルスを形質導入効率のポジティブコントロールとして使用します。このために、ステップ3.3の間に別のチューブに追加の3.5×104 セルを準備します。
  3. 尿中細胞の解離については、手順2.2〜2.4に従います。セルカウンターを使用して細胞をカウントし、7×104 尿細胞を1.5mLチューブに移します。
  4. チューブを200 × g で5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく上清を注意深く除去します。ステップ3.2で調製した100 μLのSeV混合物にペレットを再懸濁します。懸濁液感染のためにチューブを37°Cで1時間インキュベートします。
  5. ステップ3.1で調製した基底膜マトリックスコーティングされた12ウェルプレート上に懸濁液をプレートする。日常的に、プレート1は1ウェルあたり104 細胞×2.5×104 細胞を重複して行う。
  6. 細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。形質導入の24時間後および3日目に、培地を1 mLの新しいREMC培地と交換します。
  7. 形質導入後5日目に、培地をPSC生成培地に変更し(補足表S1参照)、その後は1日おきに培地交換を行う。したがって、古い培地を取り除き、1ウェルあたり1mLのPSC生成培地を追加します。
    注:最初のコロニーが現れるまで最大15日かかる場合があります。
  8. コロニーのサイズが1 mmを超える場合は、個々のiPS細胞コロニーを選択します。これを行うには、顕微鏡下でp10ピペットで単一のコロニーをこすり、慎重に収集します。750 μLのPSC培地を含む基底膜マトリックスでコーティングされた12ウェルプレートの新しいウェルにコロニーを移します。
    オプション:プレートをDPBSですすぎ、ピッキング前に0.5 mM EDTAで1分間処理することで、さらなるステップの堅牢な培養をサポートできます。細胞が後で出現するコロニーを待つためにより長く培養される場合は、このEDTA処理ステップを実行しないでください。
  9. プロトコルのセクション4に記載されているように、37°Cおよび5%CO2 で細胞を増殖させ、その後1日おきに培地を交換します。ピックしたコロニーが直径2 mmに達したら、プロトコルのセクション5で説明されているように、定期的なiPS細胞継代を続行します。

4.中程度の変化

注:コロニーが継代に十分な大きさになるまで、培地を1日おきに交換する必要があります。

  1. 古い培地を吸引し、12ウェルプレートあたり750 μLの新鮮な培地を加えます。別の種類の培地に切り替えるには、継代の少なくとも1日後に培地を交換してください。

5.継代

注:iPS細胞コロニーが十分に大きくなったとき(直径>2 mm)、またはコロニーが互いに接触しようとしているときに、細胞を継代する必要があります。通常、iPS細胞は約5日ごとに分割することができます。定期的なメンテナンスには凝集継代(ステップ5.1)を使用し、定義された数の細胞が必要な実験にはシングルセル継代(ステップ5.2)を使用します。iPS細胞が大きく分化する場合、コロニーピッキング(ステップ5.3)は培養物の純度を向上させるのに役立ちます。

  1. 凝集継代
    1. 1ウェルあたり500μLの基底膜マトリックスを添加して基底膜マトリックス被覆12ウェルプレートを作製し、プレートを移動させて液体を分配する。プレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートします。基底膜マトリックスを500 μLのPSC培養液と交換し、使用するまでプレートを37°Cで保存します。
    2. 培養細胞から培地を吸引し、DPBS500 μLを注意深く加えて細胞を洗浄します。DPBSを取り外し、500 μLの0.5 mM EDTAをウェルに加えます。
    3. コロニーが剥離し始めるまで、プレートをRTで2〜5分間インキュベートします。顕微鏡下で細胞を注意深く観察します。
    4. コロニーの端が剥がれ始め、細胞間の隙間が見えるようになったら(図3A)、EDTAを取り外し、500 μLのDPBS を慎重に 加えます。
      注:細胞をプレートから剥離しないように、常にウェルの側壁にピペットで固定し、細胞に直接ピペットで置かないでください。
    5. DPBSを吸引し、p1000ピペットを使用して500 μLのPSC培養液でウェルを洗い流します。ピペットで上下に1x-5xして、コロニーを適切なサイズの塊に分散させます(図3A)。 ピペットを入れすぎないでください。
      注:iPS細胞が誤ってピペットで固まりすぎた場合は、10 μMのRock阻害剤Y-27632を培地に追加してください。iPS細胞は単一細胞として生存できないため、これは生存率を高めることができます。
    6. 細胞凝集懸濁液の1/10-1/50を新しいウェルに移します。この比率は、分割前のウェルのコンフルエンシー、播種細胞の所望の密度、およびiPS細胞クローンの好みに依存します。
    7. プレートを数回ゆっくりと前後に動かして、塊をウェル内に均等に分配します。プレートを37°Cで少なくとも30分間インキュベートして、塊を付着させます。
    8. 多くの浮遊死細胞が観察された場合は、培地を750 μLのPSC培養培地と交換します。それ以外の場合は、250 μLのPSC培地を追加します。プレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに入れます。
      注:30分後の培地置換は、特に不安定な細胞株(NHPなど)にとって重要です。
    9. コロニーが継代に十分な大きさになるまで、2〜3日ごとに培地を交換してください。中程度の変更の場合は、プロトコルのステップ 4 に従います。
  2. シングルセル継代
    1. ステップ5.1.1で述べたように、PSC培養液に10 μM Y-27632を添加して、基底膜マトリックスコーティング培養プレートを準備します。
      オプション:継代の1〜3時間前に10 μM Y-27632を細胞に追加して、感受性細胞株の生存率を高めます。
    2. 培地を吸引し、500 μLのDPBSを加えて細胞を洗浄します。DPBSを取り外し、300 μLの剥離溶液をウェルに加えます。
    3. プレートを37°Cで5〜10分間インキュベートします。顕微鏡下で細胞の十分な剥離が観察されたら、700 μLのPSC培養液またはDPBSを追加します。
    4. 細胞が単一細胞に解離するまで、p1000ピペットを使用して5〜10倍にピペットで上下させます。 細胞の損傷を防ぐために、ピペットをやりすぎないでください。
    5. 細胞懸濁液を少なくとも2 mLのDPBSを含む15 mLチューブに移し、剥離液を希釈します。
    6. チューブを200 × g で5分間遠心分離し、セルペレットを破壊することなく溶液を完全に吸引します。
    7. ペレットを10 μM Y-27632を添加した500 μLのPSC培養液に再懸濁します。
    8. ステップ5.2.1で調製した基底膜マトリックス被覆12ウェルプレートあたり5,000〜7,000個の細胞およびシードをカウントする。
      注:別のセル番号が必要な場合は、それに応じて大きいウェルまたは小さいウェルに変更してください。
    9. プレートを37°Cおよび5%CO2 で少なくとも30分間インキュベートして、細胞を付着させます。
    10. 多くの死細胞が観察された場合は、培地を750 μLのPSC培地+ 10 μM Y-27632と交換します。それ以外の場合は、250 μL + 10 μM Y-27632を追加します。
      注:このステップは、特に不安定な細胞株(NHPなど)にとって重要です。
    11. プレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに入れます。
    12. 分割後1〜2日目に培地をY−27632を含まないPSC培地に変更し、細胞が再び古典的なコロニー形態を示すことができるようにした(図3B)。
    13. コロニーが十分に大きくなるまで、2日ごとに培地を交換してください。中程度の変更については、プロトコルのセクション4に従ってください。
  3. コロニーピッキングによるiPS細胞の継代
    1. ステップ5.1.1に記載されているように、基底膜マトリックスコーティングされた12ウェルを準備します。
    2. 培地を吸引し、500 μLのDPBSを注意深く加えて細胞を洗浄します。DPBSを取り外し、500 μLの0.5 mM EDTAをウェルに加えます。
    3. プレートをRTで1〜3分間インキュベートし、コロニーの剥離が境界に見えるまで顕微鏡下で細胞を観察する。
    4. EDTAを取り外し、500 μLのDPBS を慎重に 添加します。 細胞を剥離することなく、500 μLのPSC培養液をウェルにゆっくりと添加する前に、液体を吸引します。
    5. p200ピペットを使用して、分化した細胞を回収することなく、顕微鏡下で目的のコロニーを選択します。これを行うには、細胞を含む培地を取り上げながらコロニーをそっと引っ掻きます。
    6. ピックした各コロニーを、ステップ5.3.1で調製した1つの基底膜マトリックスコーティングウェルに移します。p1000ピペットを使用して細胞を2〜5倍ピペッティングすることにより、細胞を小さな塊に解離します。
    7. プレートを37°Cおよび5%CO2で30分間インキュベートし、塊を付着させます。
    8. 多くの浮遊死細胞が観察された場合は、培地を750 μLのPSC培養培地と交換します。それ以外の場合は、250 μLのPSC培地を追加します。
      注:30分後の培地置換は、特に不安定な細胞株(NHPなど)にとって重要です。
    9. プレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに入れます。
    10. コロニーが継代に十分な大きさになるまで、2〜3日ごとに培地を交換してください。これを行うには、プロトコルのセクション4に従います。

6. 長期保存のための尿中細胞およびiPS細胞の凍結

注:通常、iPS細胞は細胞凍結培地中でカウントせずに塊として凍結されます。ピペッティングは、単一細胞への解離を避けるために最小限に抑える必要があります。尿中細胞の場合、日常的に、1チューブあたり1.5 ×10 4 〜3 ×10 4 細胞が凍結されるため、ユーザーは別の計数ステップを必要とせずに、12ウェルプレートの1ウェルで1つのチューブを直接解凍できます。

  1. 15 mLチューブで5 mLのDPBSを調製します。
  2. 尿中細胞の凍結については、プロトコルのステップ2.2〜2.4に従ってください。iPS細胞の凍結については、clump継代プロトコルのステップ5.1.2-5.1.5に従ってください。
  3. 懸濁液をステップ6.1で調製した15 mLチューブに移します。尿中細胞の凍結のために、血球計算盤を用いて細胞懸濁液10μLを数える。細胞を200 × gで5分間遠心分離し、上清を完全に吸引します。
  4. 細胞ペレットをチューブあたり400 μLの細胞凍結培地に再懸濁し、細胞を希望量のクライオチューブに分配します。
  5. クライオチューブをすぐに-80°Cに移します。 凍結したチューブを-80°Cで凍結してから1日後に-150°Cの冷凍庫または液体窒素に移し、長期保存します。

7. 尿中細胞とiPS細胞の解凍

  1. 尿細胞の融解のために、プロトコルのステップ1.1に記載されているように、所望の量のゼラチンコーティングされた12ウェルを準備します。iPS細胞の場合は、ステップ5.1.1に記載されているように、基底膜マトリックスコーティングされた12ウェルプレートを準備します。どちらの場合も、マトリックスを培地と交換しないでください。
  2. 4 mLのDPBSを含む15 mLチューブを準備し、37°Cで保存します。
  3. 凍結した細胞のバイアルを37°Cの水浴にすばやく入れて解凍し、浮遊氷が見えるまで解凍します。
    注意: 汚染を避けるために、水浴中でのインキュベーションの前後にクライオチューブをエタノールで拭いてください。
  4. 氷含有懸濁液に尿路細胞用のREMC培地500 μL、またはiPS細胞用のPSC培養培地500 μLを加え、ステップ7.2で調製した予熱した15 mLチューブに直ちに懸濁液を移します。
  5. チューブを200 × g で5分間遠心分離し、上清を完全に廃棄します。
  6. 尿中細胞の場合は、ペレットを1 mLのREMC培地に再懸濁します。iPS細胞の場合は、ペレットを750 μLのPSC培地に注意深く再懸濁します。 塊を無傷に保つために、ピペッティングしすぎないでください。
    オプション:培地に10 μM Y-27632を補充することで、融解後のiPS細胞の生存をサポートできます。
  7. ステップ7.1で調製した12ウェルプレートからマトリックスを吸引し、細胞懸濁液をウェルに注意深く移します。
  8. プレートを37°C、5%CO2 で一晩インキュベーターに入れます。
  9. 翌日、iPS細胞にはY-27632を、尿中細胞にはREMCを含まないPSC培養培地と交換します。
  10. インキュベーター内で37°Cおよび5%CO2 で細胞を増殖させる。
  11. 細胞が継代に十分な大きさになるまで、2〜3日ごとに培地を交換してください。中程度の変更については、プロトコルのセクション4に従ってください。

8. 免疫細胞化学

注:NANOG、OCT3/4、SOX2、TRA-1-60、EpCAMなどの多能性関連マーカーを標的とする抗体による免疫染色は、新しく生成されたiPS細胞の最も広く使用されている検証の1つです。抗体および希釈液の詳細については、 材料表を参照してください。

  1. iPS細胞は、使用の1〜3日前に適切な数の12ウェルプレートにプレートします。培地を吸引し、500 μLのDPBSを加えて細胞を洗浄し、DPBSを除去します。ウェルあたり400 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、細胞をRTで15分間固定します。
  2. 4%PFAを除去し、細胞をDPBSで3回洗浄します。ウェルあたり400 μLのブロッキングバッファーを加え、プレートをRTで30分間インキュベートします。
  3. ブロッキングバッファーを吸引し、400 μLの抗体希釈バッファー(ADB)で希釈した抗体を各ウェルに加えます。プレートを4°Cで一晩インキュベートします。
  4. 一次抗体を含むADBを除去し、細胞をDPBSで3倍洗浄します。
  5. DPBSを吸引し、ADBで希釈した二次抗体をウェルあたり400 μL添加します。プレートを暗所でRTで1時間インキュベートします。
  6. ADBを取り外し、DPBSで細胞を3回洗浄します。DPBSで希釈した1 μg/mLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をウェルあたり加え、RTで3分間インキュベートします。
  7. DAPI溶液を吸引し、細胞をDPBSで3回洗浄します。イメージング用に500 μLのDPBSを追加します。

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結果

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ヒトおよびNHP尿から細胞を単離する場合、単離直後に異なる種類の細胞を同定することができる。扁平上皮細胞、およびさまざまな小さな丸い細胞は、尿とともに排泄されます。女性の尿には、男性の尿よりもはるかに多くの扁平上皮細胞が含まれています(図1B-0日目; 補足図S1)。初代尿培地中での5日間の培養後、最初の接着増殖細胞が見られる(図1A、B−5日目)。この時点で、培地の半分は、最初のコロニーが現れるまで、毎日REMC増殖培地に置き換えられる。およそ13日目に、接着細胞は継代可能な大きなコロニーに成長する(図1B〜13日目)。これらのコロニーは、形態学的に異なる2つの細胞型から形成することができます.1つは、細胞が密接に付着して成長する上皮様表現型を持ち、もう1つは、細長い形状とより高い遊走能力を備えたより間葉系のような形態を示します(図1C

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ディスカッション

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iPS細胞は、他の方法ではアクセスできない細胞型を in vitroで生成できるため、貴重な細胞型です。リプログラミングの出発物質として、例えば、線維芽細胞はすべての霊長類種から容易に入手できるわけではないが、本論文は尿由来細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示する。これらの細胞は、非滅菌霊長類の尿サンプルからでも、広域スペクトルの抗生物質を培地に補給することにより、非侵襲的な方法で得ることができます。

プロトコルのいくつかの重要なステップは、いくつかの追加の議論の価値があります。まず、非滅菌尿から細胞を単離する場合、汚染のリスクを減らすために、広域スペクトルの抗菌試薬を培地に補給することが重要です。抗生物質の使用にもかかわらず微生物汚染の成長が明らかになった場合は、培養物を廃棄してその領域を消毒することをお勧めします。さらに、私たちの経験では、培養を継続しても、健康に成長する尿細胞は生成されません。第二に、細胞の再プログラムを開始する際には、過剰コンフルエントによるすべての細胞の剥離のリスクを回避し、iPS細胞獲得の可能性を高めるために、異なる数のS...

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開示事項

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著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

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この作業は、DFG EN 1093 / 5-1(プロジェクト番号458247426)によってサポートされました。M.O.は日本学術振興会海外特別研究員の助成を受けました。すべての図は BioRender.com で作成されました。フローサイトメトリーは、ミュンヘン生物医学センターのコアファシリティフローサイトメトリーの助けを借りて実施されました。京都大学ASHBiの志田誠さんと武藤知世さん、映像撮影のサポートに感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Accumax™ 細胞剥離液 (剥離液)Sigma-AldrichSCR006
アムホテリシン B溶液メルクA2941-100ML
抗ヒト TRA-1-60 マウス抗体 Stem Cell Technologies60064希釈率:1/200
抗ヒト TRA-1-60 PE標識抗体 Miltenyi Biotec130-122-965:1/50
Bambanker™(細胞凍結培地)日本ジェネティクスBB01
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
細胞培養マルチウェルプレート、12ウェル CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™II 自動セルカウンターサーモフィッシャーサイエンティフィックAMQAX1000
クライオキング® 1.5 mL チューブ 2D バーコード付き (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213にはさまざまな種類のクライオチューブを使用できます。2Dバーコードチューブには、サンプル情報を独自のチューブ情報とともにデータベースに保存できるという利点があります。
CytoTune™EmGFP 仙台蛍光レポーター (GFP 仙台ウイルス)サーモフィッシャーサイエンティフィックA16519
CytoTune™-iPS 2.0 仙台リプログラミングキット (仙台ウイルスリプログラミングキット)サーモフィッシャーサイエンティフィックA16518
DAPI 4',6-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸塩Sigma-Aldrich10236276001
DMEM HighグルコースTH。GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutamineFisher Scientific15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202希釈率: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207希釈:1/500
DPBS w/o カルシウム w/o マグネシウムTH.GeyerL0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit 抗体 (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524希釈率: 1/500
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL 円錐底Greiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL 円錐底Greiner BIO-ONE227261
ウシ胎児血清、認定、熱不活化、ブラジル(FBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo
豚の皮からのゼラチンSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™LDEVフリー、hESC認定、低成長因子基底膜マトリックスThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™補足サーモフィッシャーサイエンティフィック35050038
ヘラセル&トレード; 240i CO2 インキュベーターフィッシャーサイエンティフィック16416639
ヘレウス ヘラセーフ 安全キャビネットケンドロ51017905
ヒト EGF、プレミアムグレードミルテニー バイオテック130-097-749
ImageJ フィジーバージョン2.9.0
MEM非必須アミノ酸溶液(100X)サーモフィッシャーサイエンティフィック11140035
マイクロ遠心チューブPP、1.5 mLNerbe Plus04-212-1000
Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibodyR&DシステムMAB1368希釈:1/100
マウス抗α-平滑筋アクチン抗体R&D SystemsMAB1420希釈:1/100
マウス抗β-IIIチューブリン抗体R&D SystemsMAB1195Dilution: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb 細胞シグナル伝達技術4903S希釈:1/400
Normocure™(抗菌試薬)Invivogenant-noc
Oct-4 ウサギ抗体 細胞シグナル伝達技術2750S希釈:1/400
パラホルムアルデヒド (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
ペニシリン-ストレプトマイシン (10.000 U/ml) (PS)サーモフィッシャーサイエンティフィック15140122ペニシリン-ストレプトマイシンミックスには、100 U/mL のペニシリンと 100 & micro;g / mLストレプトマイシン。.
組換えヒトFGF-basicPeproTech100-18B
組換えヒトPDGF-ABPeproTech100-00AB
冷蔵卓上遠心分離機SIGMA 4-16KS
腎上皮細胞基礎培地ATCC PCS-400-030
腎上皮細胞増殖キットATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900Cell Signaling Technology4900S希釈率:1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAbNEB4755S希釈率:1/500
StemFit®Basic02日本遺伝学3821.00この培地の生産は中止されましたので、ヒト細胞株にはStemFit Basic04CTを、非ヒト霊長類にはStemFit Basic03を使用してください。
トリトンX-100 シグマ-アルドリッチT8787-50ML
トリプル&トレード;セレクト酵素(1x)、フェノールレッドなし(解離酵素)サーモフィッシャーサイエンティフィック12563011
ウォーターバスプレシジョンGP 05サーモフィッシャーサイエンティフィックTSGP05
Y-27632、二塩酸塩塩(Rock阻害剤)バイオゾールBYT-ORB153635
抗体希釈バッファー組成については補足資料を参照してください表 S1
ブロッキングバッファー組成については、補足表 S1
REMC 培地組成については、補足表 S1
一次尿培地組成については、補足表 S1
PSC 培養培地については、補足表 S1
PSC 生成培地組成については、補足表S1
洗浄バッファー組成については補足表S1を参照
希釈 凍結663441 顕微鏡 を参照してください 組成を参照してください尿を参照し、

参考文献

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