本プロトコルは、ヒトおよび非ヒト霊長類の尿由来細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に単離、増殖、および再プログラムする方法、ならびに新たに生成されたiPS細胞のフィーダーフリー維持のための指示書を記載している。
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この記事について
サマリー
要約
霊長類多能性幹細胞とその誘導体を研究する種間アプローチは、疾患、発生、および進化の分子および細胞メカニズムをよりよく理解するために重要です。霊長類人工多能性幹細胞(iPSC)をより利用しやすくするために、本論文では、尿由来細胞からヒトおよび非ヒト霊長類iPS細胞を非侵襲的に生成する方法と、フィーダーフリー培養法によるそれらの維持について紹介する。
尿は、非滅菌環境(動物のケージなど)からサンプリングし、初代細胞培養中に広域抗生物質カクテルで処理して、汚染を効率的に減らすことができます。尿由来細胞の増殖後、市販のセンダイウイルスベクター系の改変形質導入法によりiPS細胞が生成される。最初のiPS細胞コロニーは、5日後にすでに見えている可能性があり、早くても10日後に摘み取ることができます。酵素フリー解離バッファーによるルーチンの凝集継代は、50回以上の継代で生成されたiPS細胞の多能性をサポートします。
概要
ヒト霊長類と非ヒト霊長類(NHP)のゲノム比較は、私たちの進化の歴史とヒト特異的形質の進化を理解するために重要です1。さらに、これらの比較は、保存されたDNA配列2を同定することによって、例えば、疾患関連変異体3に優先順位を付けることによって、機能の推論を可能にする。遺伝子発現レベルなどの分子表現型の比較は、ゲノム比較をより適切に解釈し、たとえば細胞表現型の違いを発見するために重要です。さらに、DNAレベルでの比較と同様に、機能的関連性を推測し、したがってヒト内の医学的に関連する変異をより適切に解釈する可能性があります4。これらの比較研究に包括的な分子表現型データを組み込むには、適切な生物学的資源(すなわち、種を超えたオーソログ細胞)が必要です。しかしながら、倫理的および実際的な理由により、特に発生中は、そのような同等の細胞にアクセスすることが困難または不可能である。人工多能性幹細胞(iPSC)は、インビトロでそのようなアクセスできない細胞型の生成を可能にし5、6、実験的にアクセス可能であり、霊長類の比較に使用されている6、7....
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プロトコル
この実験手順は、人体実験に関する責任ある倫理委員会(20-122、Ethikkommission LMU München)によって承認されました。すべての実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施した。
注:ヒトおよびNHPサンプルを扱う実験を開始する前に、適切な倫理委員会から承認を得る必要があります。すべての実験手順は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行する必要があります。以下の各ステップは、生物学的安全キャビネット内で滅菌技術を使用して実行する必要があります。すべての緩衝液および培地組成物は、 補足表S1に見出すことができる。セルに加える前に、すべての培地が室温(22°C)に温められていることを確認してください。各遠心分離ステップは、特に言及しない限り、室温で実行する必要があります。
1.尿サンプルからの細胞の分離
注意: 人間のドナーがヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、およびC型肝炎ウイルス(HCV)に感染していないことを確認してください。NHPの場合、可能性のあるドナー/細胞に特定の病原体であるBウイルス(BV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、サルベータレトロウイルス(SRV)、およびサルT細胞リンパ球向性ウイルス(STLV)がないことを確認してください。
- 1ウェルあたり0.2....
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結果
ヒトおよびNHP尿から細胞を単離する場合、単離直後に異なる種類の細胞を同定することができる。扁平上皮細胞、およびさまざまな小さな丸い細胞は、尿とともに排泄されます。女性の尿には、男性の尿よりもはるかに多くの扁平上皮細胞が含まれています(図1B-0日目; 補足図S1)。初代尿培地中での5日間の培養後、最初の接着増殖細胞が見られる(図1A、B−5日目)。この時点で、培地の半分は、最初のコロニーが現れるまで、毎日REMC増殖培地に置き換えられる。およそ13日目に、接着細胞は継代可能な大きなコロニーに成長する(図1B〜13日目)。これらのコロニーは、形態学的に異なる2つの細胞型から形成することができます.1つは、細胞が密接に付着して成長する上皮様表現型を持ち、もう1つは、細長い形状とより高い遊走能力を備えたより間葉系のような形態を示します(図1C
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ディスカッション
iPS細胞は、他の方法ではアクセスできない細胞型を in vitroで生成できるため、貴重な細胞型です。リプログラミングの出発物質として、例えば、線維芽細胞はすべての霊長類種から容易に入手できるわけではないが、本論文は尿由来細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示する。これらの細胞は、非滅菌霊長類の尿サンプルからでも、広域スペクトルの抗生物質を培地に補給することにより、非侵襲的な方法で得ることができます。
プロトコルのいくつかの重要なステップは、いくつかの追加の議論の価値があります。まず、非滅菌尿から細胞を単離する場合、汚染のリスクを減らすために、広域スペクトルの抗菌試薬を培地に補給することが重要です。抗生物質の使用にもかかわらず微生物汚染の成長が明らかになった場合は、培養物を廃棄してその領域を消毒することをお勧めします。さらに、私たちの経験では、培養を継続しても、健康に成長する尿細胞は生成されません。第二に、細胞の再プログラムを開始する際には、過剰コンフルエントによるすべての細胞の剥離のリスクを回避し、iPS細胞獲得の可能性を高めるために、異なる数のS.......
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開示事項
著者は開示する利益相反を持っていません。
謝辞
この作業は、DFG EN 1093 / 5-1(プロジェクト番号458247426)によってサポートされました。M.O.は日本学術振興会海外特別研究員の助成を受けました。すべての図は BioRender.com で作成されました。フローサイトメトリーは、ミュンヘン生物医学センターのコアファシリティフローサイトメトリーの助けを借りて実施されました。京都大学ASHBiの志田誠さんと武藤知世さん、映像撮影のサポートに感謝いたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Accumax™ 細胞剥離液 (剥離液) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| アムホテリシン B溶液 | メルク | A2941-100ML | |
| 抗ヒト TRA-1-60 マウス抗体 | Stem Cell Technologies | 60064 | 希釈率:1/200 |
| 抗ヒト TRA-1-60 PE標識抗体 | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | :1/50 |
| Bambanker™(細胞凍結培地) | 日本ジェネティクス | BB01 | |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| 細胞培養マルチウェルプレート、12ウェル CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™II 自動セルカウンター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AMQAX1000 | |
| クライオキング® 1.5 mL チューブ 2D バーコード付き (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | にはさまざまな種類のクライオチューブを使用できます。2Dバーコードチューブには、サンプル情報を独自のチューブ情報とともにデータベースに保存できるという利点があります。 |
| CytoTune™EmGFP 仙台蛍光レポーター (GFP 仙台ウイルス) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 仙台リプログラミングキット (仙台ウイルスリプログラミングキット) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A16518 | |
| DAPI 4',6-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸塩 | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM Highグルコース | TH。Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | 希釈率: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | 希釈:1/500 |
| DPBS w/o カルシウム w/o マグネシウム | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit 抗体 (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | 希釈率: 1/500 |
| エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL 円錐底 | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL 円錐底 | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| ウシ胎児血清、認定、熱不活化、ブラジル(FBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | ||
| 豚の皮からのゼラチン | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™LDEVフリー、hESC認定、低成長因子基底膜マトリックス | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™補足 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 35050038 | |
| ヘラセル&トレード; 240i CO2 インキュベーター | フィッシャーサイエンティフィック | 16416639 | |
| ヘレウス ヘラセーフ 安全キャビネット | ケンドロ | 51017905 | |
| ヒト EGF、プレミアムグレード | ミルテニー バイオテック | 130-097-749 | |
| ImageJ | フィジー | バージョン2.9.0 | |
| MEM非必須アミノ酸溶液(100X) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11140035 | |
| マイクロ遠心チューブPP、1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&Dシステム | MAB1368希釈:1/100 | |
| マウス抗α-平滑筋アクチン抗体 | R&D Systems | MAB1420 | 希釈:1/100 |
| マウス抗β-IIIチューブリン抗体 | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | 細胞シグナル伝達技術 | 4903S | 希釈:1/400 |
| Normocure™(抗菌試薬) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 ウサギ抗体 | 細胞シグナル伝達技術 | 2750S | 希釈:1/400 |
| パラホルムアルデヒド (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10.000 U/ml) (PS) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15140122 | ペニシリン-ストレプトマイシンミックスには、100 U/mL のペニシリンと 100 & micro;g / mLストレプトマイシン。. |
| 組換えヒトFGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| 組換えヒトPDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| 冷蔵卓上遠心分離機 | SIGMA | 4-16KS | |
| 腎上皮細胞基礎培地 | ATCC PCS-400-030 | ||
| 腎上皮細胞増殖キット | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | 希釈率:1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | 希釈率:1/500 |
| StemFit®Basic02 | 日本遺伝学 | 3821.00 | この培地の生産は中止されましたので、ヒト細胞株にはStemFit Basic04CTを、非ヒト霊長類にはStemFit Basic03を使用してください。 |
| トリトンX-100 | シグマ-アルドリッチ | T8787-50ML | |
| トリプル&トレード;セレクト酵素(1x)、フェノールレッドなし(解離酵素) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12563011 | |
| ウォーターバスプレシジョンGP 05 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | TSGP05 | |
| Y-27632、二塩酸塩塩(Rock阻害剤) | バイオゾール | BYT-ORB153635 | |
| 抗体希釈バッファー | 組成については補足資料を参照してください表 S1 | ||
| ブロッキングバッファー | 組成については、補足表 S1 | ||
| REMC 培地 | 組成については、補足表 S1 | ||
| 一次尿培地 | 組成については、補足表 S1 | ||
| PSC 培養培地 | については、補足表 S1 | ||
| PSC 生成培地 | 組成については、補足表S1 | ||
| 洗浄バッファー | 組成については補足表S1を参照 |
参考文献
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al.
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再版と許可
