方法論記事

心不整脈の複雑なメカニズムを調査するための革新的なツールキット

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DOI:

10.3791/64932

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2023年2月10日

1Department of Medicine I, University Hospital Munich (LMU), Ludwig-Maximilians-University Munich (LMU), 2Institute of Surgical Research at the Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, University Hospital, LMU Munich, 3DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), 4Interfaculty Center for Endocrine and Cardiovascular Disease Network Modelling and Clinical Transfer (ICONLMU), LMU Munich

この記事について

要約

議論された記事:

Tomsits, P., Schuttler, D., Kaab, S., Clauss, S., Voigt, N. Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質のマウス心房および心室筋細胞の分離。視覚化された実験のジャーナル。(165)、10.3791/61964(2020年)。

Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単一細胞光学活動電位測定.視覚化された実験のジャーナル。(166)、10.3791/61890(2020)。

Xia, R. et al. マウス洞房結節および房室結節からの常在性心臓マクロファージの分離と培養。視覚化された実験のジャーナル。(171)、10.3791/62236(2021年)。

Xia, R. et al. マウスの洞房結節および房室結節のホールマウント免疫蛍光染色、共焦点イメージング、および3D再構成。視覚化された実験のジャーナル。(166)、10.3791/62058(2020)。

Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. マウスの内因性心臓ペースメイキング欠陥を特定するための洞房結節発火率の微小電極アレイ記録.視覚化された実験のジャーナル。(173)、10.3791/62735(2021年)。

Scherschel, K. et al. マウス星状神経節の位置、解剖、分析。視覚化された実験のジャーナル。(166)、10.3791/62026(2020)。

Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. 完全長タンパク質の発現を保持しながら、mRNAからの内部翻訳開始部位の除去。視覚化された実験のジャーナル。(181)、10.3791/63405(2022年)。

Rotzer, R. D. et al. 意識のあるマウスの自発的な圧反射感度を決定するための、遠隔測定心電図と血圧トランスミッターの組み合わせの埋め込み。視覚化された実験のジャーナル。(168)、10.3791/62101(2021年)。

Tomsits, P. et al. マウスの不整脈を検出するための長期心電図記録の分析.視覚化された実験のジャーナル。(171)、10.3791/62386(2021年)。

Grab, M. et al. インターベンション計画とトレーニングのための3Dプリント心血管ファントムの開発と評価。視覚化された実験のジャーナル。(167)、10.3791/62063(2021年)。

編集記事

不整脈は非常に一般的であり、臨床的に非常に関連性があります。しかし、ほとんどの治療戦略は不整脈の原因メカニズムを標的とするのではなく、症状のみに焦点を当てているため、現在の治療は依然としてほとんど不十分です。したがって、新規で革新的で因果関係のある治療法を開発するには、複雑な疾患メカニズムの理解を深めることが緊急に必要とされています。

現在の JoVE メソッド コレクションの目的は、不整脈発生のさまざまな側面を包括的に調査できる、公平で多様なプロトコル セットを提供することです。

カルシウム恒常性の変化は不整脈発生の特徴の 1 つですが、複数の側面を考慮する必要があり、それぞれを研究するには特定の技術が必要なため、調査は依然として困難です 1,2。この方法コレクションでは、Tomsitsらは、同じマウスから心房および心室心筋細胞を単離し、L型カルシウム電流とカルシウム過渡現象の両方を同時に研究することを可能にするプロトコルを提供します3。したがって、このプロトコルにより、研究者はカルシウム障害をよりグローバルに調査し、同時に動物の数を減らすことができ、これは科学的および倫理的な大幅な改善を表しています。

それにもかかわらず、単離された細胞にパッチを当てることは、依然として複雑で労働集約的で低スループットの実験です4。これに対処するために、Seibertzらは、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞の活動電位を測定するための電位感受性色素を使用したプロトコルを提供しています5。この技術は(パッチクランプに必要なように)広範なトレーニングを必要とせず、比較的低コストの実験セットアップを使用して適用できるため、このプロトコルには幅広い用途があります。

心筋細胞に加えて、他の細胞型(線維芽細胞やマクロファージなど)も電気生理学において重要な役割を果たします6,7,8。伝導系における細胞型特異的効果を調査するために、Xiaらは、マウス9,10の洞結節(SAN)と房室結節(AVN)を特定し、続いてマイクロダイセクションと蛍光活性化細胞選別(FACS)を行ってマクロファージ9を単離して研究するか、またはホールマウント免疫蛍光イメージングによって。これにより、さまざまな細胞型の同定、三次元構造の評価、およびSAN/AVN10内の細胞型特異的タンパク質発現の研究が可能になります。

さらに、Kumarら11によって提示されたようなホールマウント準備で多電極アレイ(MEA)記録を実行できます。この方法は、比較的高速でシンプルであり、優れた空間分解能も提供するため、現在使用されている技術への優れた追加です。薬理学的介入が可能になり、心臓の他の特定の領域 (AVN など) に簡単に適用できます。

自律神経系は電気生理学において重要な役割を果たしており12、13、14 交感神経摘出術15、16、17、18 や心臓神経節のアブレーションなどの治療戦略が存在します19。それにもかかわらず、特に自律神経系の解剖学的構造はマウスでは容易にアクセスできないため、メカニズムの基礎はまだほとんど不明です。この号では、Scherschel et al. マウスにおける星状神経節の同定と解剖を可能にするプロトコルを提供し、さまざまな細胞型における遺伝子およびタンパク質の発現を研究します20。これにより、自律神経リモデリングの新しい側面の研究が可能になります。

細胞レベルで電気生理学を研究することは、基本的なメカニズムを研究するために重要です。しかしながら、細胞所見を検証し、同定された標的構造の(病態)生理学的関連性を確認するには、動物モデルにおける in vivo 研究が依然として必要である21。マウスが最も広く使用されていますが、特にトランスジェニックマウスの生成は複雑です。今号では、志村らがCRISPR-Cas9遺伝子編集を用いたプロトコルを発表し、切断タンパク質の複雑な調節的役割とその効果を in vivoで具体的に研究しています。このために、彼らは、コネキシン-43をコードするGJA1遺伝子に一点変異を有するトランスジェニックマウスモデルを生成しました。これにより、全長Cx43の正規表現が得られますが、切り捨てられたCx43の発現が減少します22。

in vivo研究の主な制限の1つは、実験中に動物を麻酔する必要性であり、これはさまざまな電気生理学的パラメーターに影響を与える可能性があり、したがって「真の」状況を表していない可能性があります23,24。一方、テレメトリックデバイスは、数週間から数か月の長期間にわたって、目覚めて自由に動くマウスの研究を可能にします25,26。Rötzer et al. は、マウスの心拍数と血圧を同時に記録する遠隔測定装置を埋め込む方法を説明しており、これにより、特に自律神経系と圧反射感度の調査が可能になります27。

テレメトリ デバイスは非常に強力なツールですが、これらの大規模なデータセットをどのように分析するかという大きな課題が残っています。この問題に対処するために、Tomsits らは、標準化された半自動方法で遠隔測定 ECG 記録を分析するプロトコルを開発しています28。プロトコルに従って、研究者は基本的な ECG パラメーター (心拍数や PR 間隔など) を取得し、個別に定義された不整脈 (一時停止、徐脈/頻脈など) をスクリーニングできます。重要なのは、信号品質を向上させるためのガイダンスを含む、遠隔測定心電図の記録と分析の課題と落とし穴についても議論していることです。

人工弁などの新しく開発された医療機器は、ヒトの患者に適用する前に、動物モデルで徹底的にテストされています29。しかし、健康な動物での研究は、人間の患者、特に以前に手術を受けた患者には完全には反映されない可能性があります30,31。このような制限を克服するために、Grabらは、個々の患者固有の心臓モデルの3Dプリンティングのためのプロトコルを提供します32。彼らのモデルは弾力性があり、生体力学的特性とヒト患者に似た血行動態特性に似ています。これらのモデルにより、特に複雑な解剖学的構造を持つ患者において、医師の教育、新しい介入手順やデバイスのテスト、個別化された治療戦略の計画が可能になります。

この JoVE メソッド コレクションで提供されるプロトコルは、電気生理学と不整脈を研究する多くの研究者をサポートします。このコレクションの主な強みは、従来の技術に改善と革新をもたらすだけでなく、不整脈発生のさまざまな側面を研究するための新しいアプローチも示していることです。したがって、このコレクションは、これらの複雑な疾患についての理解を広げ、最終的には不整脈患者のための革新的な治療法を開発するのに役立ちます。

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

著者は、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK;81X2600255、81X2600270、81X2600266)、コロナ財団(S199/10079/2019)、ERA-NET心血管疾患(ERA-CVD;01KL1910)、およびハインリッヒ・アンド・ロッテ・ミュールフェンツル財団の支援を受けました。資金提供者は原稿の準備に何の役割も持っていませんでした。

参考文献

  1. Denham, N. C., et al. Calcium in the pathophysiology of atrial fibrillation and heart failure. Frontiers in Physiology. 9, 1380(2018).
  2. Grandi, E., et al. Human atrial action potential and Ca2+ model: sinus rhythm and chronic atrial fibrillation. Circulation Research. 109 (9), 1055-1066 (2011).
  3. Tomsits, P., Schuttler, D., Kaab, S., Clauss, S., Voigt, N. Isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and L-Type calcium current. Journal of Visualized Experiments. (165), e61964(2020).
  4. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).
  5. Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-Cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (166), e61890(2020).
  6. Grune, J., et al. Neutrophils incite and macrophages avert electrical storm after myocardial infarction. Nature Cardiovascular Research. 1 (7), 649-664 (2022).
  7. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  8. Xia, R., et al. Cardiac macrophages and their effects on arrhythmogenesis. Frontiers in Physiology. 13, 900094(2022).
  9. Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), e62236(2021).
  10. Xia, R., et al. Whole-Mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058(2020).
  11. Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Microelectrode array recording of sinoatrial node firing rate to identify intrinsic cardiac pacemaking defects in mice. Journal of Visualized Experiments. (173), e62735(2021).
  12. Chen, P. S., Choi, E. K., Zhou, S., Lin, S. F., Chen, L. S. Cardiac neural remodeling and its role in arrhythmogenesis. Heart Rhythm. 7 (10), 1512-1513 (2010).
  13. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
  14. Gardner, R. T., Ripplinger, C. M., Myles, R. C., Habecker, B. A. Molecular mechanisms of sympathetic remodeling and arrhythmias. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (2), 001359(2016).
  15. Dusi, V., De Ferrari, G. M., Pugliese, L., Schwartz, P. J. Cardiac sympathetic denervation in channelopathies. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 27(2019).
  16. Dusi, V., et al. Left cardiac sympathetic denervation for long QT syndrome: 50 years' experience provides guidance for management. JACC Clinical Electrophysiology. 8 (3), 281-294 (2022).
  17. De Ferrari, G. M., et al. Clinical management of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia: The role of left cardiac sympathetic denervation. Circulation. 131 (25), 2185-2193 (2015).
  18. Schwartz, P. J., Ackerman, M. J. Cardiac sympathetic denervation in the prevention of genetically mediated life-threatening ventricular arrhythmias. European Heart Journal. 43 (22), 2096-2102 (2022).
  19. Qin, M., Zeng, C., Liu, X. The cardiac autonomic nervous system: A target for modulation of atrial fibrillation. Clinical Cardiology. 42 (6), 644-652 (2019).
  20. Scherschel, K., et al. dissection, and analysis of the murine stellate ganglion. Journal of Visualized Experiments. (166), e62026(2020).
  21. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nat Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  22. Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. Removal of an internal translational start site from mRNA while retaining expression of the full-length protein. Journal of Visualized Experiments. (181), e63405(2022).
  23. Bennett, K., Lewis, K. Sedation and anesthesia in rodents. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 25 (1), 211-255 (2022).
  24. Poon, Y. Y., et al. Disproportional cardiovascular depressive effects of isoflurane: Serendipitous findings from a comprehensive re-visit in mice. Lab Animal (NY). 50 (1), 26-31 (2021).
  25. Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260(2011).
  26. McCauley, M. D., Wehrens, X. H. Ambulatory ECG recording in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), 10(2010).
  27. Rotzer, R. D., et al. Implantation of combined telemetric ECG and blood pressure transmitters to determine spontaneous baroreflex sensitivity in conscious mice. Journal of Visualized Experiments. (168), e62101(2021).
  28. Tomsits, P., et al. Analyzing long-term electrocardiography recordings to detect arrhythmias in mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e62386(2021).
  29. Hytonen, J. P., Yla-Herttuala, S. Preclinical evaluation of coronary artery stents. Journal of Visualized Experiments. (186), e64038(2022).
  30. Gruzdeva, O. V., et al. Comparative analysis of the hemostasiological profile in sheep and patients with cardiovascular pathology as the basis for predicting thrombotic risks during preclinical tests of vascular prostheses. Sovremennye Tekhnologii v Meditsine. 13 (1), 52-56 (2021).
  31. Weisskopf, M., Kron, M., Giering, T., Walker, T., Cesarovic, N. The sheep as a pre-clinical model for testing intra-aortic percutaneous mechanical circulatory support devices. The International Journal of Artificial Organs. 44 (10), 703-710 (2021).
  32. Grab, M., et al. Development and evaluation of 3D-printed cardiovascular phantoms for interventional planning and training. Journal of Visualized Experiments. (167), e62063(2021).

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