ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

サマリー

このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの 神経筋接合部の超微細構造分析に特に有用です。

要約

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)は、神経科学の分野で貴重なモデルシステムとして浮上しています。ショウジョウバエNMJでの共焦点顕微鏡の適用により、研究者はシナプスの存在量に関する定量的データとそれらの形態に関する詳細な洞察の両方を網羅するシナプス情報を取得することができます。しかし、TEMの拡散分布と限られた視認範囲は、超微細構造解析に課題をもたらします。本研究では、従来のアプローチを凌駕する革新的で効率的なサンプル調製法を紹介します。この手順は、平底のボトルまたは試験管の底に金属メッシュを配置することから始まり、次に固定された幼虫サンプルをメッシュに配置します。追加のメッシュがサンプル上に配置され、サンプルが 2 つのメッシュの間に配置されます。固定されたサンプルは、包埋手順に進む前に、完全に脱水され、浸透されます。その後、サンプルをエポキシ樹脂に平らにシート状に埋め込むことで、筋肉の位置決めや切片作成のための準備が可能になります。これらのステップにより、ショウジョウバエの幼虫のすべての筋肉を光学顕微鏡で視覚化することができ、その後の位置決めと切片作成が容易になります。余分な樹脂は、体節_A2と_A3の6^番目と7^番目の筋肉を見つけた後に除去されます。6^番目または7^番目の筋肉の連続的な超薄切片化が行われます。

概要

電子顕微鏡は、ナノスケール^レベル1で細胞の内部構造を視覚的かつ正確に示すことができる、生体材料の超微細構造を研究するための最も理想的な方法の1つです。しかし、サンプル調製プロセスが複雑でコストが高いため、電子顕微鏡は光学顕微鏡ほど普及していません。近年の電子顕微鏡技術の進歩により、画質の大幅な向上がもたらされ、それと同時に関連する作業負荷も大幅に減少しています。そのため、電子顕微鏡は、さまざまな分野で科学知識を進歩させる上で重要な役割を担っています²。

ショウジョウバエは、標的遺伝子の空間的および時間的発現を正確に制御するための遺伝子操作を行うための優れた動物モデルです³。その上、ショウジョウバエには、哺乳類のモデルと比較して成長期間が短く、飼育が容易であるという利点があります。したがって、ショウジョウバエは形態学研究で広く使用されています^4,5。

ショウジョウバエの幼虫では、神経筋接合部(NMJ)ブートンは筋肉に広く分布しており^6,7、NMJの免疫染色は、シナプスの量と形態に関する情報を容易に提供できる^8,9。A₂およびA₃セグメントの6^番目/7^番目の筋肉に位置するNMJボタンは、光学顕微鏡を使用した定量的および形態学的研究に適しています。これは、そのサイズと豊富^さ10,11のためです。したがって、ショウジョウバエの幼虫のNMJは、神経科学研究の有用なモデルと考えられている¹²。

しかし、TEMでNMJブートンの超微細構造を観測することは困難です。透過型電子顕微鏡の走査窓が狭いため、広く分布しているNMJボタン¹³の位置決めが困難である。他の理由は、 ショウジョウバエ の体壁がサンプル調製プロトコル⁷のアルコール脱水ステップ中にカールしやすいことです。

従来の研究では、通常、A₂ と A₃ セグメントの 6^番目と 7^番目の筋肉の間のボタンが、その豊富さとサイズ^14,15 のためにサンプル材料として選択されています。A2と_A3セグメントの6^番目と7^番目の筋肉は、他の筋肉よりも大きく、より多くのブートンを含んでいます。しかし、電子顕微鏡用に試料を作製すると、固定された試料は薄くなり、カールしやすくなり、_A2および_A3セグメントの6^番目と7^番目の筋肉の位置が不適切になっていました。

我々はここに、従来のサンプル調製方法と比較して、サンプルのカールを防ぐのにより効果的な新しい処理手順を報告する ^7,16、その後の脱水中にサンプルを平らに保つことにより、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部のより良い位置決めを容易にする。

プロトコル

注:この記事で使用した透過型電子顕微鏡サンプル調製法は、以前に報告されています¹⁶。サンプルによっては、試薬の選択と投与量の調整が必要であることに注意することが重要です。サンプル調製プロセスで使用される有毒な化学試薬は多数あるため、オペレーターは防護服や手袋の着用、ヒュームフードでの操作など、特定の保護措置を講じる必要があります。

1. 解剖、固定、留置の手順

1. 解剖
   1. さまよう後期3年生の幼虫をJan溶液で解剖し、標準的な手順¹⁷に基づいて全身壁を取得します。Janの溶液を次のように調製します:128 mM NaCl、2 mM KCl、4 mM MgCl₂、35 mMスクロース、5 mM HEPES、pH 7.4
      注: ショウジョウバ エの幼虫の体壁は、ショウジョウ バエの幼虫期の外側の覆いまたは外皮を指します。これには、キューティクル、表皮細胞、および幼虫の外骨格を形成するその下にある組織が含まれます。体壁は構造的な支持と保護を提供し、幼虫の体と外部環境との間の障壁として機能する¹⁷。
2. 固定
   1. 解剖室の幼虫の体壁を固定剤で一晩4°Cに固定します。固定液を調製するには、2%グルタルアルデヒドと2%ホルムアルデヒドを0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)に混合します
   2. サンプルをカコジル酸ナトリウム緩衝液で数回すすぎます。
   3. カコジル酸緩衝液中に1%OsO₄ を調製します。サンプルを1%OsO₄ に2時間固定した後、蒸留水で数回すすぎます。
      注:アルデヒドとOsO₄ による二重固定は、細胞の超微細構造のより良い保護を提供します。さらに、OsO₄ はサンプル組織を染色することができ、光とサンプルとの間のコントラストがより明白になることを可能にする¹⁸。
   4. ショウジョウバエの神経筋接合部サンプルを2%飽和酢酸ウラニルで2時間染色した後、脱イオン水で数回すすぎます(図1A)。
3. サンプルの配置
   1. 同サイズ(細孔径270μm)の丸い金属メッシュを2枚ハサミで切ります。
   2. あらかじめ平底ボトルの底に金属メッシュ(270μm)を敷いておきます。
   3. 固定された幼虫サンプルをメッシュに配置し、次に別のメッシュを配置して、サンプルが 2 つのメッシュの間に配置されるようにします。

2. 脱水症状

注:この論文では、エタノール勾配脱水法を使用しました。

1. エタノールの濃度勾配を増加させる中で、サンプルを順次(50%、70%、85%、95%各1回、100%2回)、それぞれ4°Cで20分間脱水します。
2. サンプルをプロピレンオキシドで室温で毎回5分間2回すすぎます(図1C)。

3. 潜入

注:浸潤は、TEMサンプル調製に必要なステップの1つです。浸潤は、脱水媒体を試料中の包埋媒体と徐々に置換し、細胞間を包埋媒体¹⁹で満たすことを可能にする。

1. サンプルをプロピレンオキシドとエポキシ樹脂の混合溶液に1:1と1:2の比率でそれぞれ1時間置き、続いて純粋なエポキシ樹脂を室温で2時間置きます。

4. 埋め込み

1. ポリエチレンフィルムを準備し、大きな正方形(約5×5 cm)と小さな中空の長方形のサポート(約2 × 2 cm)にカットします。小さな正方形を大きな正方形に接着します。
2. 大きな正方形の中央に十分なエポキシ樹脂を事前に配置します。
3. 筋肉側を上に向けて、事前に配置したエポキシ樹脂にサンプルを置きます。ステレオスコープを使用します。
4. サンプルに樹脂を数滴加え、PEフィルム(スペーサーより少し大きい)で覆います(図1D-E)。
5. サンプルを37°C、42°C、60°Cでそれぞれ24時間重合します(図1F)。

5. セクショニングの手順

1. 鋭利な刃で幼虫の体壁の余分な部分を取り除き、A₂ / A₃ セグメントを含む台形を保持します。
   注:一番上の線は13^番目の 筋肉の近くにあり、ベースラインはサンプルからエポキシ樹脂まで離れている必要があります。トップラインとベースラインの間の高さは約5〜8mmです。
2. サンプルの残りの部分から台形を取り除き、A / B接着剤で樹脂を充填したカプセルに接着します。
3. 光学顕微鏡下でA₂およびA₃セグメントの6^番目と7^番目の筋肉の位置を確認し(図1G)、接平面を6^番目の筋肉と平行に保ちます。
4. A₃ セグメントの両側に沿ってサンプルの 5 分の 1 を切り取ります。
   注:6^番目の 筋肉のほとんどを取り除き、7^番目の 筋肉の幅の1/3を保持します。
5. 極薄ミクロトームを使用して、サンプルの6^番目の 筋肉から始まる極薄切片を調製します。
   注:各スライスの厚さは約90 nmです。
6. 各銅メッシュにできるだけ多くのスライスをアタッチします。
7. 前述の¹⁶のように透過型電子顕微鏡法を実施する。

結果

ショウジョウバエの幼虫の体壁は、規則的なパターンで配置された30の識別可能な筋線維で構成されており、解剖および固定後の薄いスライスのように見えます²¹(図1A)。脱水プロセス中、サンプルは金属メッシュの存在により平坦なままです(図1B、C)。幼虫の体の筋肉は、エポキシ樹脂製の薄いプレートに埋もれており(図1D-G)、樹脂充填カプセルに簡単かつ正確に配置され、接着されています(図1H、I)。

ディスカッション

ショウジョウバエ の幼虫のサンプルは、サンプルが薄いため、脱水中に丸くなる傾向があり、神経筋接合部を正確に特定することが困難になり、サンプル調製の困難さと作業負荷が増加します。従来の改善は、サンプル⁷を短くすることですが、サンプルはまだ異なる程度にカールしていました。

私たちの方法では、2つの重要なステップがあります:まず、金属メッシュの制限により、サンプルは脱水プロセス全体を通じて平らのままです。また、重合過程では、温度変化による試料の折り畳みを防止するために、プラスチック製品の間に挟み込んで重合させることができるため、試料の観察や光学顕微鏡下での標的筋の位置把握が容易になります。しかし、この方法の欠点は、樹脂とプラスチックが付着するため、サンプルを回収しにくいという点です。

私たちの方法で得られる平らな樹脂シートは、従来の埋め込みブロックよりもトリミングと位置決めに優れています。サンプルの周りの樹脂をできるだけトリミングすることで、作業の難しさと労力を大幅に...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,2-エポキシプロパン	上海 凌鳳化学試薬 CO., LTD	JYJ 037-2015	浸透剤
ショウジョウバエ 株式	ブルーミントン	なし	この研究で使用した野生型対照のショウジョウバエ株はすべて W1118 であり、標準的な培養方法に従って飼育されました
平底ガラス試験管	Haimen Chenxing Experimental equipment Company	なし	平底ガラス試験管(ボトル)スポンジプラグ付(またはボトルストッパー)
K4M架橋剤	Agar Scientific	Cat# 1924B	埋め込み樹脂は、高度に架橋されたアクリレートとメタクリレートの処方に基づいています
K4M樹脂(モノマーB)	寒天科学	ロット#631557	樹脂モノマー
ポリビニルフィルム	海門晨興実験装置会社	なし	透明ポリエチレンフィルムは最高、厚さ約0.2mm
SPI Chem DDSA	SPI	SpI#02827-AF	ドデセニル無水コハク酸
SPI-Chem DMP-30 エポキシ	SPI	02823-DA	加速器
SPI-Chem NMA	SPI	SpI#02828-AF	エポキシ用硬化剤
SPI-PON 812 エポキシ	SPI	SPI#0259-AB	樹脂モノマー
スチールメッシュ	Yuhuiyuan Gardening Store(オンライン)	なし	銅またはステンレス鋼ネット
透過型電子顕微鏡	Hitachi H-7650	11416692	すべてのグリッド(サンプルが収集されたもの)をクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡で観察しました。
極薄ミクロトーム	ライカUC7超薄型ミクロトーム	595915	ライカUC7超薄型ミクロトームでは、すべての切片作成作業がダイヤモンドナイフを使用して行われます