eGFPの構成的発現を有する リーシュマニア 種株の開発

サマリー

ここでは、pLEXSYシステムを用いてeGFPの遺伝子を安定な統合導入遺伝子として発現するL. パナメンシス 株および L.ドノバニ 株を作製するために用いられる方法論について述べる。トランスフェクトされた寄生虫を限界希釈によってクローニングし、両方の種で最も高い蛍光強度を有するクローンを、薬物スクリーニングアッセイでさらに使用するために選択しました。

要約

リーシュマニア属の原虫寄生虫は、世界中の何百万人もの人々に影響を与えるさまざまな臨床症状を伴う疾患であるリーシュマニア症を引き起こします。L.ドノバニに感染すると、致命的な内臓疾患を引き起こす可能性があります。パナマ、コロンビア、コスタリカでは、L. panamensisが皮膚および粘膜皮膚リーシュマニア症の報告された症例のほとんどに関与しています。これまでに利用可能な方法論で多数の薬物候補を研究することは、細胞内形態の寄生虫に対する化合物の活性を評価するため、またはin vivoアッセイを実行するために非常に面倒であることを考えると、非常に困難です。この研究では、18S rRNA(ssu)をコードする遺伝子座に組み込まれた増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)をコードする遺伝子の構成的発現を伴うL.パナメンシス株およびL.ドノバニ株の生成について説明します。eGFPをコードする遺伝子を市販のベクターから取得し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅して濃縮し、BglIIおよびKpnI酵素の制限部位を追加しました。eGFPアンプリコンをアガロースゲル精製により単離し、酵素BglIIおよびKpnIで消化し、同じ酵素セットで以前に消化したリーシュマニア発現ベクターpLEXSY-sat2.1にライゲーションしました。クローニングした遺伝子を有する発現ベクターを大腸菌内で増殖させ、精製し、インサートの存在をコロニーPCRにより検証した。精製したプラスミドを直鎖化し、L. donovaniおよびL. panamensis寄生虫のトランスフェクションに使用した。遺伝子の組み込み性はPCRによって検証された。eGFP遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより評価した。蛍光寄生虫を限界希釈によってクローニングし、蛍光強度が最も高いクローンをフローサイトメトリーを用いて選択した。

概要

リーシュマニア属の原虫寄生虫は、広範囲の臨床症状を伴う疾患であるリーシュマニア症を引き起こす。この病気は98カ国で流行しており、年間発生率は0.9〜160万例と推定されています¹。人間に病原性のあるリーシュマニア種は、2つの亜属、すなわちLに分けられます。(リーシュマニア)とL。(ヴィアンニア)。Lに属するいくつかの種による感染。L. donovaniやL. ininftumなどの(リーシュマニア)亜属は、内臓リーシュマニア症(VL)を引き起こす可能性があり、治療せずに放置すると致命的です²。Lに属する種。(Viannia)亜属は、中南米、特にパナマ、コロンビア、コスタリカの皮膚リーシュマニア症(CL)および粘膜皮膚リーシュマニア症(MCL)のほとんどの症例に関連しており、L.パナメンシスがこれらの臨床症状の主な病因物質です^3,4。

五価アンチモン、ミルテフォシン、アムホテリシンBなどの薬剤を含む既存の抗リーシュマニア化学療法は、毒性が高く、高価です。さらに、ここ数十年間の薬剤耐性の増加は、世界中の患者の効果的な治療を妨げる要因に追加されています⁵。リーシュマニア属の種間、特に新世界と旧世界の種の間で、薬物感受性に関して実質的な違いが示されています^6,7。これらの理由から、種固有のアプローチに特に注意を払いながら、新しい抗リーシュマニア薬の同定と開発に努力する必要があります。従来の方法論で医薬品候補の大規模なライブラリを研究することは、これらの方法論が細胞内アマスティゴテスに対する化合物の活性を評価するため、またはin vivo^{実験を実行する}ために非常に面倒であることを考えると、非常に困難です8。したがって、レポーター遺伝子の実装やハイコンテント表現型スクリーニングアッセイの開発など、これらの欠点を軽減する新しい技術を開発する^{必要がありました9。}

レポーター遺伝子の使用は、ハイスループットおよびin vivoアッセイの開発を容易にするため、薬物スクリーニングプロセスの効率を高める可能性を示しています。いくつかのレポーター遺伝子を発現する組換えリーシュマニア寄生虫は、さまざまな研究グループによって生成されています。β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子は、エピソーマルベクターを用いていくつかのリーシュマニア種に導入されており、寄生虫の細胞外および細胞内形態での薬物スクリーニングには限られた有用性が示されています10,11,12,13,14,15.これらのアプローチには、エピソーム構築物の排除を避けるために培養中に強い選択圧が必要であること、およびレポーター遺伝子の活性を明らかにするための追加の試薬の使用が必要であるという制限があります。逆に、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびその変異体である増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)は、その柔軟性および感度、ならびにフローサイトメトリーまたは蛍光測定を用いたスクリーニングプロセスを自動化する可能性のために、in vitro薬物スクリーニングアッセイのための多数のトランスジェニックリーシュマニア株の生成に使用されてきた^15、 16、¹⁷、^18、19。有望な結果にもかかわらず、これらのトランスジェニック株の培養物は、GFP遺伝子のコピー数がすべての寄生虫で同じではなかったため、蛍光レベルが非常に不均一でした。さらに、蛍光を維持するには、GFP遺伝子がエピソーム構築物に導入されたため、培養中の寄生虫に対して一定の選択圧が必要でした。

前述の理由から、多くの努力が安定した組換え株を生産するための新しい方法論の開発に焦点を合わせてきました。これらの努力は、リボソーム遺伝子のより高い転写率を利用して、リボソーム遺伝子座へのレポーター遺伝子の統合に大きく依存してきました²⁰。β-ガラクトシダーゼ21、IFP 1.4、iRFP²²、tdTomato²³をコードする遺伝子を組み込んだL. infantumおよびL. amazonensis株を作製し、薬物スクリーニングアッセイにおける有用性を評価しています。さまざまなグループが、相同組換えを介してそのコード遺伝子を18SリボソームRNA遺伝子座(ssu遺伝子座)に組み込むことにより、GFPを構成的に発現するL.ドノバニ株を開発しました^24,25;それらは、細胞内アマスティゴテスを含むトランスフェクトされた集団において安定した均一なGFP発現を示し24,25、そしてそれらは薬物スクリーニングアッセイ^24,25,26において首尾よく実施された。Bolhassaniら²⁷は、組み込み導入遺伝子としてGFPを発現するL.メジャーおよびL.インファンタムの株を開発しました。彼らは、もともとL.タレントラエを宿主として使用するシステムにおけるタンパク質のトランスジェニック発現のために設計された組み込みベクターpLEXSYを使用しました²⁸。pLEXSY-GFPベクターは、GFP²⁴、²⁵、^27、29、30を構成的に発現する異なるリーシュマニア株の生成に非常に効率的であることが示されています。これらの寄生生物において、蛍光は均質であり、細胞内形態で維持され、感染したマウスの足蹠病変において検出することができる²⁷。

本研究では、pLEXSYシステムを用いて、eGFPをコードする遺伝子を統合導入遺伝子として発現するL. パナメンシス 株および L.ドノバニ 株を作製するために使用される方法論について説明します。このプロセスで生成された菌株は、天然および合成起源の分子の潜在的な抗リーシュマニア活性を評価する薬物スクリーニングアッセイを実行するために私たちの研究室で使用されます。

プロトコル

サンプルを無菌状態に保つために、寄生虫培養を含むすべてのステップは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)フード内で、または地域の健康と安全の規制に従って実行する必要があります。このプロトコルの概要を 図1に示します。

図1:pLEXSY-2.1ベクターファミリーを用いてeGFP発現L.パナメンシスおよびL.ドノバニ寄生虫を生成するためのプロトコルの要約スキーム。この記事で説明されている6つの主要なセクションすべてがここに描かれています。1)pLEXSY-2.1ベクターへのeGFP遺伝子の増幅と挿入:標的遺伝子を増幅し、酵素KpnIおよびBglIIの認識部位を追加し、eGFPアンプリコンとpLEXSYプラスミドの両方を両方の酵素で順次消化し、その後T4リガーゼとライゲーションします。2)pLEXSY発現プラスミドの直鎖化:pLEXSY+eGFPコンストラクトをSwaIで消化して、7〜8 kbpの発現カセットの直鎖化および精製を行います。3)トランスフェクションおよび4)ポリクローナル選択:リーシュマニア前鞭毛虫は、エレクトロポレーションによって発現カセットでトランスフェクトされ、組換え寄生虫の抗生物質選択のために培養に戻されます。寄生虫の蛍光はフローサイトメトリーで確認されます。5)ゲノム組込みの確認および6)限界希釈によるクローニング:pLEXSY-eGFP発現カセットの組込みは、発現カセットにハイブリダイズするフォワードプライマーおよび発現カセットに存在しない染色体配列にハイブリダイズするリバースプライマーを用いて、診断PCRによって確認される。トランスフェクトされた培養物は、限界希釈によるクローニングによって蛍光寄生虫を濃縮することができ、平均蛍光強度が最も高いクローンをさらなる用途のために選択することができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. pLEXSY-2.1ベクターへのeGFP遺伝子の増幅と挿入

1. eGFP遺伝子の増幅
   注:このプロトコルは、リーシュマニア種の染色体18S rRNA遺伝子座(ssu)への発現カセットの組み込み後の標的タンパク質の構成的発現にpLEXSY-2.1ベクターファミリー(材料表を参照)を使用するため、最初のステップは、pLEXSY-2.1ベクターへの挿入を可能にする制限部位を含む配列をeGFP遺伝子に導入することです。この場合、eGFPは細胞質ゾルで発現するだけでよいので、酵素BglIIおよびKpnIの制限部位をそれぞれeGFP遺伝子の5'末端および3'末端に付加した。KpnIによるクローニングにより、標的タンパク質が6残基のC末端ポリヒスチジンタグに融合され、続いてpLEXSY-2.1プラスミドにコードされた終止コドンが続き、目的のタンパク質をさらに精製します。このため、リバースプライマー配列は終止コドンを含まない。
   1. eGFPのプラスミドソースに応じて、NEBcutter(http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)³¹ などの制限解析ツールを使用してターゲット配列を解析し、クローニングに使用される制限酵素(BglIIおよび KpnI)またはトランスフェクション前のベクター直鎖化に使用される酵素である SwaIの内部部位が含まれていないことを確認します。
   2. BglIIおよびKpnI制限配列を含むeGFP増幅用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計します。一例として、このプロトコルのeGFPソースはpEGFP-N1-1Xプラスミド³²であり、プライマー配列はBolhassaniらによって報告されたものであった²⁷:
      フォワードプライマー(EGFP1):5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3'(太字はBglII制限部位)。
      リバースプライマー(EGFP2):5'-GCCTCTAGATTAggtacccttgtacagctcgtc-3'(太字はKpnI制限部位)。
   3. 高忠実度ポリメラーゼを使用して標的遺伝子を増幅し、コード配列を確実に保存します。一例として、 プライマーEGFP1 および EGFP2について、Bolhassaniらによって報告されているようにPCRサイクリングプロトコルを実行する²⁷。94°Cで2分間の初期変性を行い、続いて94°Cで30秒、57°Cで30秒、72°Cで1分間の30サイクルを実行します。 72°Cで10分間の最終伸張ステップを実行します。 プライマーを最終濃度0.2 μMで添加します。
   4. 従来のPCR産物精製キットを用いて断片を精製するか、または標準的な酢酸ナトリウムおよびエタノール沈殿を、他の箇所に記載されるように³³。
2. pLEXSY-2.1発現ベクターへのeGFPの挿入
   1. 製造元の指示に従って、 BglIIおよび KpnIを使用してeGFP-PCR製品の末端をトリミングします。
      1. まず、製造元の指示に従って、最低の塩濃度を必要とする酵素(この場合は KpnI)の反応を設定し、37°Cで1時間インキュベートします。
      2. 次に、100 mM NaClと10単位の BglIIを加え、15分間インキュベートします。ステップ1.1.4で説明したように、反応を精製します。
   2. ステップ1.2.1で説明した逐次消化プロトコルに従って、 bglIIおよび KpnIでpLEXSY発現ベクターを消化します。
   3. pLEXSYベクターとeGFP遺伝子を1:3のモル比を用いてT4リガーゼでライゲーションする(ベクター:インサート)。100 ngの消化されたpLEXSYと28 ngの消化されたeGFP産物を、最終濃度の1xおよび3単位のT4 DNAリガーゼのリガーゼバッファーを含む20 μL反応物に簡単に加えます。4°Cで一晩インキュベートします。
   4. XL-10、DH5α、DH10Bなどのコンピテント 大腸菌 細胞を、標準的な形質転換プロトコル³³を使用して、ステップ1.2.3で得られたライゲーション産物で形質転換します。形質転換細胞をルイラ・ベルターニ(LB)-アンピシリン寒天培地にプレートし、30°Cで24時間インキュベートして組換えクローンを選択します(pLEXSYプラスミドは、37°Cよりも30°Cの方が 大腸菌 で安定です)。
   5. コロニーPCRによるプラスミド中のインサートの存在についてのスクリーニング。
      1. 個々のコロニーを選び、ヌクレアーゼフリー水20 μLに再懸濁し、95°Cで15分間加熱し、1 μLのライセートをコロニーPCRのDNAテンプレートとして取ります。ステップ1.1.2に記載したeGFP増幅用のフォワードプライマー(この例では EGFP1)と、プライマーA264(5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAG-3')をリバース^{プライマー29}として使用する。
      2. プライマーA264は、pLEXSY-2.1発現ベクターのインサートの終止コドンから80 bp後にアニールするように設計されています。一例として、プライマーペア EGFP1 +A264については、94°Cで2分間の初期変性、続いて94°Cで30秒、50°Cで30秒、72°Cで1分間の30サイクルからなるPCRサイクリングプロトコルを使用する。 72°Cで10分間の最終伸張ステップを実行します。 プライマーを0.2 μMの最終濃度で添加します。
         注:このプライマーセットを使用した予定の製品は、859 bpの長さです。 プライマーEGFP1 およびA264のアニーリング部位を 図2に示します。
   6. 市販のプラスミド単離キットまたは標準アルカリ沈殿³³を使用して、その後のトランスフェクションのために陽性クローンから精製プラスミドDNAを調製します。30°Cで50 mLの一晩培養を行い、最低10 μgのプラスミド/陽性クローンを単離します。

2. pLEXSY発現プラスミドの線状化

1. 精製したpLEXSY-eGFPプラスミドを10 μg以上使用して、 SwaI(認識部位:5'-ATTTAAAT-3')で消化します。25°Cで3〜4時間消化し、65°Cで20分間熱失活します。
2. 消化産物をアガロースゲル電気泳動で実行し、得られた断片を分離します。この消化により、 大腸菌における複製および選択に必要な要素を表す2.9 kbpフラグメントと、線形化された発現カセットを表す7〜8 kbpフラグメントの2つのフラグメントが生成されます。
3. 市販のアガロースゲル抽出キットを用いて発現カセットを精製する。

3. エレクトロポレーションによるL. パナメンシス および L.ドノバニ のトランスフェクション

注: リーシュマニア 文化は、他の場所³⁴に記載されているように行われます。本実施例では、 L. panamensis および L. donovani promastigotesをSchneider昆虫培地で培養し、20%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)および50 μg/mLゲンタマイシンを添加し、26°Cでインキュベートした。

1. トランスフェクションあたり約4 x 10⁷ 寄生虫を使用するのに十分な対数期または初期定常期前鞭毛虫になるまで、寄生虫培養を増殖させます。固定期に達する前の培養フラスコあたりの最大細胞密度は、 リーシュマニア 種および菌株が実験室条件にどの程度適合しているかによって異なり得る。必要に応じて、複数の培養フラスコの内容物をプールします。
2. 寄生虫培養液を2,000 x g で室温(RT)で3分間遠心分離します。
3. ペレットを4°Cのエレクトロポレーションバッファー(21 mM HEPES、137 mM NaCl、5 mM KCl、0.7 mM Na₂HPO₄、および6 mM グルコース;pH 7.5)²⁷ に再懸濁して、1 x 10⁸ 寄生虫/mLの濃度を得ます。氷の上に10分間置きます。
   注意: エレクトロポレーションバッファーは、使用前にろ過して滅菌する必要があります。
4. 並行して、最大容量50 μLの水または10 mMトリスバッファー(pH 8.0)およびd = 2 mmのエレクトロポレーションキュベット中に2〜10 μgの直鎖状pLEXSY-eGFPコンストラクトを含むプレチルチューブ。
5. 線状プラスミドを含むチューブに350 μLの予冷した寄生虫を加え、400 μL全体を氷上のエレクトロポレーションキュベットに移します。並行して、プラスミドDNAを含まない寄生虫細胞を陰性対照としてエレクトロポレーションする。
6. 次の 2 つのプロトコルのいずれかを使用してエレクトロポレートします。
   指数関数的減衰:450 V、450 μF、1パルス
   時定数:450 V、T = 3.5 ms、1パルス。
   注:これらのプロトコルは、PCおよびCEモジュールを備えた市販の遺伝子パルサー(材料表)を使用して実行されました。
7. キュベットを氷上に10分間戻し、電気穿孔した寄生虫を5 mLの適切な培地に移します。この例では、20%(v / v)FBSを添加したシュナイダーの昆虫培地を使用しました。26°Cで20時間インキュベートします。

4. 培養におけるポリクローナル選択

1. エレクトロポレーションの約20時間後、培養物を顕微鏡で観察する。寄生虫集団の少なくとも半分は、視覚的に良好な形態と運動性を示す必要があります(振動する鞭毛が培地内を移動する、および/またはアクティブな寄生虫凝集体を形成するドロップ状の前鞭毛)。使用するpLEXSYプラスミドに応じて適切な選択的抗生物質を追加します。この例では、選択マーカーとしてストレプトトリシンアセチルトランスフェラーゼを含むpLEXSY-sat2.1が使用されています。したがって、ノルセオトリシンを選択的抗生物質として0.1 mg / mL濃度で使用してください。.
2. プラスミドDNAの有無にかかわらずエレクトロポレーションした寄生虫の間に明確な違いが見られるまで、培養物を顕微鏡で追跡します。
3. フローサイトメトリーで寄生虫の蛍光を検証します。
   1. 固定相培養液1 mLを2,000 x g でRTで3分間遠心分離します。 PBSで2回洗浄し、最終ペレットを1 mLのPBSに再懸濁します。
      注:eGFPの蛍光は、ほとんどの市販サイトメーターのFL1チャネルで検出できます。前方散乱と側方散乱のゲイン設定、およびFL1チャネルはサイトメーターによって異なる場合があります。この例では、CyFlowスペース(シスメックス)サイトメーターを使用しました。
   2. サンプルを実行し、0.5 μL/sの速度で20,000個のイベントを収集し、前方散乱(FSC)、側方散乱(SSC)、蛍光1(FL-1)チャンネルのゲイン値をそれぞれ225.0、200.0、520.0に設定します。非蛍光性寄生虫を含む対照サンプルを実行して、FSC対SSCドットプロットで寄生虫集団を決定します。
   3. 寄生虫集団を含むゲート(G1)を作成し、そのゲートを通してFL-1チャネルをフィルタリングして、プロマスティゴテスの自家蛍光を決定し、FL-1チャネルの範囲ゲート(G2)を設定します。
   4. トランスフェクトした寄生虫を実行して、蛍光があるかどうかを確認します。G1の蛍光性寄生虫の割合とG2の蛍光強度の平均を記録します。

5. ゲノム統合の確認

注:pLEXSY-eGFP発現カセットの集積は、発現カセットにハイブリダイズするフォワードプライマー(使用するpLEXSY-2.1ベクターによって異なります)および発現カセットに存在しない染色体 ssu隣接配列にハイブリダイズするリバースプライマーF3002(5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3')を用いた診断PCRによって確認できます。本実施例では、F2999フォワードプライマー(5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3')をpLEXSY-sat2.1発現カセット内でハイブリダイズそのまま使用する。診断用PCRのための統合発現カセットおよびプライマーアニーリング部位の概略図を 図2に示す。

1. 2〜5 mLの固定期寄生虫培養物から、従来のフェノール/クロロホルム抽出³⁵ または市販のキットを使用してゲノムDNAを精製します。
2. pLEXSY-sat2.1の診断PCRは、94°Cで2分間の初期変性、続いて94°Cで30秒、53°Cで30秒、72°Cで1分間の30サイクルからなるサイクリングプロトコルを使用して実行します。 72°Cで10分間の最終伸張ステップを実行します。 プライマーを0.2 μMの最終濃度で添加します。

図2:統合式カセットの概略図。Chr−S(灰色)とラベル付けされたボックスは、発現カセットが組み込まれている18S rRNA遺伝子座(ssu)の隣接する染色体配列を表す。統合発現カセットは、ssu遺伝子座への相同組換えのための5'および3'配列(青)、タンパク質産生増強のための追加のリーシュマニアリボソームプロモーター(赤)、eGFP遺伝子(緑)、選択マーカー遺伝子(黄色)、および3つの非翻訳領域(薄い灰色)で構成されています)、すなわちutr1、2、および3は、リーシュマニア寄生虫におけるeGFPおよび選択マーカーの最適化された発現のための転写後mRNAプロセシングのためのスプライシングシグナルを提供します。コロニーPCRによるインサートの存在の検証(ステップ1.2.5)に使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーのアニーリング部位は、それぞれcpcr-fwd(EGFP1プライマー)およびcpcr-rev(A264プライマー)とラベル付けされた黒い矢印でマークされており、859 bpの産物を区切っています。診断用PCRによるゲノム組込みの検証(ステップ5)に使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーのアニーリングサイトは、それぞれsat-fwd(F2999プライマー)およびssu-rev(F3002プライマー)とラベル付けされた黒い矢印でマークされており、2,271 bpの産物を区切っています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. 限界希釈によるクローニング(オプション)

1. フローサイトメトリーで蛍光を確認した後、組換え寄生虫の希釈液を5つの前鞭毛虫/mL³⁶の濃度で調製します。
2. この希釈液100 μLを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。このようにして、プレートは、0.5個の前鞭毛虫/ウェルの平均密度で播種され、これにより、ウェル³⁶当たり複数の寄生虫を有する可能性を最小化しながら、いくつかのウェルが単一の寄生虫を確実に受け入れる。
3. プレートを少なくとも12時間邪魔しないでください。寄生虫の成長を伴うウェルが検出されるまで、100倍の最小倍率でプレートを顕微鏡で追跡します。
4. プレートウェルが寄生虫でいっぱいになったら、その内容物を使用して5 mLの培養液を接種します。これには1〜2週間かかります。
5. クローン播種培養物が固定期に達したら、ステップ4.3で説明したように、フローサイトメトリーを使用して蛍光を検証します。蛍光寄生虫の割合およびFL-1チャネルで測定された平均蛍光強度に基づいて、さらなるin vitro および in vivo アッセイに使用するクローンを選択します。蛍光原虫が98%〜99%のクローンを目指し、平均蛍光強度が最も高いものを選択します。

結果

pLEXSY-eGFPコンストラクトを構築し、コンピテント大腸 菌 細胞を形質転換した後、eGFPインサートを備えたコンストラクトを含むコロニーは、セクション1.2で説明されているコロニーPCRを実行した後、約859 bpの産物を生成します(図3A)。 SwaIを用いた陽性コロニーからの精製プラスミドの全消化は、ゲル電気泳動において2つの特徴的な断片、 すなわち大腸菌における複製および選択に必要なすべての要素を含むPLEXSYベクターの部分である2.9 kbp断片、およびトランスフェクションに使用される直鎖化発現カセットを表す7〜8 kpb断片を与えるべきである(図3B)。

トランスフェクション後、ポリクローナル選択はほぼ定性的に行われます。抗生物質による選択中の寄生虫培養の状態は顕微鏡で監視され、寄生虫の形態と運動性に特別な注意が払われます。トランスフェクトされた寄生虫の培養物の回収に成功した後、eGFPを効...

ディスカッション

様々なレポーター遺伝子の長所と短所は、いくつかの原虫寄生虫で研究されています。その中で、GFPとeGFPは本質的に蛍光であり、定量とイメージングが容易です。これらのタンパク質の蛍光活性は、蛍光顕微鏡、蛍光測定、またはフローサイトメトリーを用いた最小限の操作で検出できます。GFP発現Lを生成するための研究はほとんど行われていない。(Viannia)株は、旧世界リーシュマニア種¹⁵、¹⁶、^18、24におけるレポーター遺伝子としてのGFPおよびその誘導体の堅牢性が実証されているにもかかわらず。Varela et ^al.37は、エピソーム導入遺伝子としてGFPを発現するL.パナメンシス株を開発した。軸状前鞭毛虫と細胞内無鞭毛虫の両方のフローサイトメトリー分析は、薬物スクリー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルマイクロプレート	コーニング	CLS3340	平底透明、黒色ポリスチレン、滅菌、蓋
アガロース	Sigma-Aldrich	A4718
アンピシリンナトリウム塩	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra、細胞培養に適しています
BglII 制限酵素	New England BioLabs	R0144S	2,000 units/mL
細胞培養フラスコ	コーニング	CLS430168	表面積 25 cm2、カントネック、キャップ(プラグシール)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	定休日
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	粉末、BioReagent、細胞培養に適した、昆虫細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、≥99.5%
ウシ胎児血清	Sigma-Aldrich	F7524
ゲルローディングバッファー	Sigma-Aldrich	G2526	移動速度はゲル組成によって異なります。ロードする前に、サンプルで1:3〜1:6に希釈します。
Gene Pulser Xcell エレクトロポレーションシステム	バイオ・ラッド	1652660	このシステムは、本体、2つのアクセサリーモジュール、キャパシタンスエクステンダー(CEモジュール)、パルスコントローラー(PCモジュール)、およびShockPodキュベットチャンバーで構成されています。
Gene Pulser/MicroPulser エレクトロポレーションキュベット	Bio-Rad	1652086	Pkg of 50, 0.2 cm–ギャップ滅菌エレクトロポレーションキュベット、Gene PulserおよびMicroPulserシステムで使用するため、哺乳類およびその他の真核細胞
Gentamicin溶液	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg / mL 脱イオン水、液体、0.1 μmろ過、BioReagent、細胞培養に適した
GoTaqロングPCRマスターミックス	Promega	M4021
HEPES溶液	Sigma-Aldrich	H0887	1 M、pH 7.0-7.6、滅菌ろ過、BioReagent、細胞培養に適しています
倒立顕微鏡	リンパス	IXplore Standard
KpnI-HF制限酵素	イングランドバイオラボR3142S		4,000単位 20,000単位/mL
LBブロス(寒天入り	Sigma-Aldrich	L3147	参照の栄養豊富な微生物増殖粉末培地(寒天培地入り、レギュラー 大腸菌 文化。
LBブロス	Sigma-Aldrich	L2542	液体微生物増殖培地
Mini-Sub Cell GT 水平電気泳動システム	Bio-Rad	1640300	ミニ水平電気泳動システム、8 ウェルおよび 15 ウェルコーム、7 cm x 10 cm UV透明トレイを含む
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	50 塩基配列
pLEXSYcon2.1 発現キット	イエナBioscience	EGE-1310sat	統合的構成発現ベクターpLEXSY-sat2.1が含まれています。ヌルセオトリシン(NTC、clonNAT)によるトランスフェクタントの抗生物質選択。診断用PCRおよびシーケンシング用のすべてのプライマーが含まれています。
塩化カリウム	ミリポア	529552	分子生物学グレード - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Up to 15 μ3 mL培養物からのトランスフェクション対応プラスミドのg。
シュナイダー&プライム;昆虫培地	Sigma-Aldrich	S0146	当研究室でリーシュマニアの培養に使用している培地です。
SOCミディア	Sigma-Aldrich	S1797
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S3014	分子生物学、DNase、RNase、およびプロテアーゼ用、検出なし、≥99% (滴定)
リン酸ナトリウム二塩基性	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent、細胞培養、昆虫細胞培養、&;99.0%, Freeflowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme	New England BioLabs	R0604S	2,000 units. 10,000 units/mL
シリンジフィルター	Corning	CLS431212	regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm、細孔径0.2 μm
T100 サーマルサイクラー	バイオ・ラッド	1861096	サーマルサイクラーシステムには、96 ウェルサーマルサイクラー、電源コード、チューブサポートリングが含まれています
T4 DNA リガーゼ	プロメガ	M1801	つの DNA ストランドを結合
トリス-ホウ酸-EDTA バッファー	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent、電気泳動に適しています、10× 濃縮
ウィザードゲノム DNA精製キット	Promega	A1120
Wizard SV ゲルおよびPCRクリーンアップシステム	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL.F'エピソーム上のカナマイシン耐性遺伝子を特徴とし、クロラムフェニコール耐性ベクターの非常に要求の厳しいクローニングを実現します。効率:> 5 x 10 9トランスフォーマー/マイクロ;g pUC18 DNA。