方法論記事

eGFPの構成的発現を有する リーシュマニア 種株の開発

DOI：

10.3791/64939

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2023年4月21日

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1Centro de Biología Celular y Molecular de Enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 2Departamento de Medios y Creativo, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 3Sistema Nacional de Investigación-Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SNI-SENACYT)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここでは、pLEXSYシステムを用いてeGFPの遺伝子を安定な統合導入遺伝子として発現するL. パナメンシス 株および L.ドノバニ 株を作製するために用いられる方法論について述べる。トランスフェクトされた寄生虫を限界希釈によってクローニングし、両方の種で最も高い蛍光強度を有するクローンを、薬物スクリーニングアッセイでさらに使用するために選択しました。

要約

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リーシュマニア属の原虫寄生虫は、世界中の何百万人もの人々に影響を与えるさまざまな臨床症状を伴う疾患であるリーシュマニア症を引き起こします。L.ドノバニに感染すると、致命的な内臓疾患を引き起こす可能性があります。パナマ、コロンビア、コスタリカでは、L. panamensisが皮膚および粘膜皮膚リーシュマニア症の報告された症例のほとんどに関与しています。これまでに利用可能な方法論で多数の薬物候補を研究することは、細胞内形態の寄生虫に対する化合物の活性を評価するため、またはin vivoアッセイを実行するために非常に面倒であることを考えると、非常に困難です。この研究では、18S rRNA(ssu)をコードする遺伝子座に組み込まれた増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)をコードする遺伝子の構成的発現を伴うL.パナメンシス株およびL.ドノバニ株の生成について説明します。eGFPをコードする遺伝子を市販のベクターから取得し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅して濃縮し、BglIIおよびKpnI酵素の制限部位を追加しました。eGFPアンプリコンをアガロースゲル精製により単離し、酵素BglIIおよびKpnIで消化し、同じ酵素セットで以前に消化したリーシュマニア発現ベクターpLEXSY-sat2.1にライゲーションしました。クローニングした遺伝子を有する発現ベクターを大腸菌内で増殖させ、精製し、インサートの存在をコロニーPCRにより検証した。精製したプラスミドを直鎖化し、L. donovaniおよびL. panamensis寄生虫のトランスフェクションに使用した。遺伝子の組み込み性はPCRによって検証された。eGFP遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより評価した。蛍光寄生虫を限界希釈によってクローニングし、蛍光強度が最も高いクローンをフローサイトメトリーを用いて選択した。

概要

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リーシュマニア属の原虫寄生虫は、広範囲の臨床症状を伴う疾患であるリーシュマニア症を引き起こす。この病気は98カ国で流行しており、年間発生率は0.9〜160万例と推定されています1。人間に病原性のあるリーシュマニア種は、2つの亜属、すなわちLに分けられます。(リーシュマニア)とL。(ヴィアンニア)。Lに属するいくつかの種による感染。L. donovaniやL. ininftumなどの(リーシュマニア)亜属は、内臓リーシュマニア症(VL)を引き起こす可能性があり、治療せずに放置すると致命的です2。Lに属する種。(Viannia)亜属は、中南米、特にパナマ、コロンビア、コスタリカの皮膚リーシュマニア症(CL)および粘膜皮膚リーシュマニア症(MCL)のほとんどの症例に関連しており、L.パナメンシスがこれらの臨床症状の主な病因物質です3,4。

五価アンチモン、ミルテフォシン、アムホテリシンBなどの薬剤を含む既存の抗リーシュマニア化学療法は、毒性が....

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プロトコル

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サンプルを無菌状態に保つために、寄生虫培養を含むすべてのステップは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)フード内で、または地域の健康と安全の規制に従って実行する必要があります。このプロトコルの概要を 図1に示します。

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図1:pLEXSY-2.1ベクターファミリーを用いてeGFP発現L.パナメンシスおよびL.ドノバニ寄生虫を生成するためのプロトコルの要約スキーム。この記事で説明されている6つの主要なセクションすべてがここに描かれています。1)pLEXSY-2.1ベクターへのeGFP遺伝子の増幅と挿入:標的遺伝子を増幅し、酵素KpnIおよびBglIIの認識部位を追加し、eGFPアンプリコンとpLEXSYプラスミドの両方を両方の酵素で順次消化し、その後T4リガーゼとライゲーションします。2)pLEXSY発現プラスミドの直鎖化:pLEXSY....

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結果

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pLEXSY-eGFPコンストラクトを構築し、コンピテント大腸 菌 細胞を形質転換した後、eGFPインサートを備えたコンストラクトを含むコロニーは、セクション1.2で説明されているコロニーPCRを実行した後、約859 bpの産物を生成します(図3A)。 SwaIを用いた陽性コロニーからの精製プラスミドの全消化は、ゲル電気泳動において2つの特徴的な断片、 すなわち大腸菌における複製および選択に必要なすべての要素を含むPLEXSYベクターの部分である2.9 kbp断片、およびトランスフェクションに使用される直鎖化発現カセットを表す7〜8 kpb断片を与えるべきである(図3B)。

トランスフェクション後、ポリクローナル選択はほぼ定性的に行われます。抗生物質による選択中の寄生虫培養の状態は顕微鏡で監視され、寄生虫の形態と運動性に特別な注意が払われます。トランスフェクトされた寄生虫の培養物の回収に成功した後、eGFPを効.......

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ディスカッション

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様々なレポーター遺伝子の長所と短所は、いくつかの原虫寄生虫で研究されています。その中で、GFPとeGFPは本質的に蛍光であり、定量とイメージングが容易です。これらのタンパク質の蛍光活性は、蛍光顕微鏡、蛍光測定、またはフローサイトメトリーを用いた最小限の操作で検出できます。GFP発現Lを生成するための研究はほとんど行われていない。(Viannia)株は、旧世界リーシュマニア種15、16、18、24におけるレポーター遺伝子としてのGFPおよびその誘導体の堅牢性が実証されているにもかかわらず。Varela et al.37は、エピソーム導入遺伝子としてGFPを発現するL.パナメンシス株を開発した。軸状前鞭毛虫と細胞内無鞭毛虫の両方のフローサイトメトリー分析は、薬物スクリー.......

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開示事項

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著者は開示するものは何もありません。

謝辞

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この作業は、パナマ州の国立科学技術(SENACYT)(助成金番号NI-177-2016)およびパナマ州の国立調査事務局(SNI)(助成金番号SNI-169-2018、SNI-008-2022、およびSNI-060-2022)によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェルマイクロプレートコーニングCLS3340平底透明、黒色ポリスチレン、滅菌、蓋
アガロースSigma-AldrichA4718
アンピシリンナトリウム塩Sigma-AldrichA8351BioXtra、細胞培養に適しています
BglII 制限酵素New England BioLabsR0144S2,000 units/mL
細胞培養フラスココーニングCLS430168表面積 25 cm2、カントネック、キャップ(プラグシール)
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad17001401
CyFlow SpaceSysmex定休日
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021粉末、BioReagent、細胞培養に適した、昆虫細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、≥99.5%
ウシ胎児血清Sigma-AldrichF7524
ゲルローディングバッファーSigma-AldrichG2526 移動速度はゲル組成によって異なります。ロードする前に、サンプルで1:3〜1:6に希釈します。
Gene Pulser Xcell エレクトロポレーションシステムバイオ・ラッド1652660このシステムは、本体、2つのアクセサリーモジュール、キャパシタンスエクステンダー(CEモジュール)、パルスコントローラー(PCモジュール)、およびShockPodキュベットチャンバーで構成されています。
Gene Pulser/MicroPulser エレクトロポレーションキュベットBio-Rad1652086Pkg of 50, 0.2 cm–ギャップ滅菌エレクトロポレーションキュベット、Gene PulserおよびMicroPulserシステムで使用するため、哺乳類およびその他の真核細胞
Gentamicin溶液Sigma-AldrichG139750 mg / mL 脱イオン水、液体、0.1 μmろ過、BioReagent、細胞培養に適した
GoTaqロングPCRマスターミックスPromegaM4021
HEPES溶液Sigma-AldrichH08871 M、pH 7.0-7.6、滅菌ろ過、BioReagent、細胞培養に適しています
倒立顕微鏡リンパスIXplore Standard
KpnI-HF制限酵素イングランドバイオラボR3142S4,000単位 20,000単位/mL
LBブロス(寒天入りSigma-AldrichL3147参照の栄養豊富な微生物増殖粉末培地(寒天培地入り、レギュラー 大腸菌 文化。
LBブロス Sigma-AldrichL2542液体微生物増殖培地
Mini-Sub Cell GT 水平電気泳動システムBio-Rad1640300ミニ水平電気泳動システム、8 ウェルおよび 15 ウェルコーム、7 cm x 10 cm UV透明トレイを含む
pEGFP-N1-1xAddgene17228150 塩基配列
pLEXSYcon2.1 発現キットイエナBioscienceEGE-1310sat統合的構成発現ベクターpLEXSY-sat2.1が含まれています。ヌルセオトリシン(NTC、clonNAT)によるトランスフェクタントの抗生物質選択。診断用PCRおよびシーケンシング用のすべてのプライマーが含まれています。
塩化カリウムミリポア529552分子生物学グレード - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1222Up to 15 μ3 mL培養物からのトランスフェクション対応プラスミドのg。
シュナイダー&プライム;昆虫培地Sigma-AldrichS0146当研究室でリーシュマニアの培養に使用している培地です。
SOCミディアSigma-AldrichS1797
塩化ナトリウムSigma-AldrichS3014分子生物学、DNase、RNase、およびプロテアーゼ用、検出なし、≥99% (滴定)
リン酸ナトリウム二塩基性Sigma-AldrichRDD038BioReagent、細胞培養、昆虫細胞培養、&;99.0%, Freeflowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzymeNew England BioLabsR0604S2,000 units. 10,000 units/mL
シリンジフィルターCorningCLS431212regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm、細孔径0.2 μm
T100 サーマルサイクラーバイオ・ラッド1861096サーマルサイクラーシステムには、96 ウェルサーマルサイクラー、電源コード、チューブサポートリングが含まれています
T4 DNA リガーゼプロメガM1801つの DNA ストランドを結合
トリス-ホウ酸-EDTA バッファーSigma-AldrichT4415BioReagent、電気泳動に適しています、10× 濃縮
ウィザードゲノム DNA精製キットPromegaA1120
Wizard SV ゲルおよびPCRクリーンアップシステムPromegaA9285
XL10-Gold Ultracompetent CellsAgilent200317XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL.F'エピソーム上のカナマイシン耐性遺伝子を特徴とし、クロラムフェニコール耐性ベクターの非常に要求の厳しいクローニングを実現します。効率:> 5 x 10 9トランスフォーマー/マイクロ;g pUC18 DNA。
用 オニュー) 高ム 2 します

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671(2012).
  2. Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243(2020).
  3. Saldaña, A., et al.

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