ここでは、pLEXSYシステムを用いてeGFPの遺伝子を安定な統合導入遺伝子として発現するL. パナメンシス 株および L.ドノバニ 株を作製するために用いられる方法論について述べる。トランスフェクトされた寄生虫を限界希釈によってクローニングし、両方の種で最も高い蛍光強度を有するクローンを、薬物スクリーニングアッセイでさらに使用するために選択しました。
方法論記事
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ここでは、pLEXSYシステムを用いてeGFPの遺伝子を安定な統合導入遺伝子として発現するL. パナメンシス 株および L.ドノバニ 株を作製するために用いられる方法論について述べる。トランスフェクトされた寄生虫を限界希釈によってクローニングし、両方の種で最も高い蛍光強度を有するクローンを、薬物スクリーニングアッセイでさらに使用するために選択しました。
リーシュマニア属の原虫寄生虫は、世界中の何百万人もの人々に影響を与えるさまざまな臨床症状を伴う疾患であるリーシュマニア症を引き起こします。L.ドノバニに感染すると、致命的な内臓疾患を引き起こす可能性があります。パナマ、コロンビア、コスタリカでは、L. panamensisが皮膚および粘膜皮膚リーシュマニア症の報告された症例のほとんどに関与しています。これまでに利用可能な方法論で多数の薬物候補を研究することは、細胞内形態の寄生虫に対する化合物の活性を評価するため、またはin vivoアッセイを実行するために非常に面倒であることを考えると、非常に困難です。この研究では、18S rRNA(ssu)をコードする遺伝子座に組み込まれた増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)をコードする遺伝子の構成的発現を伴うL.パナメンシス株およびL.ドノバニ株の生成について説明します。eGFPをコードする遺伝子を市販のベクターから取得し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅して濃縮し、BglIIおよびKpnI酵素の制限部位を追加しました。eGFPアンプリコンをアガロースゲル精製により単離し、酵素BglIIおよびKpnIで消化し、同じ酵素セットで以前に消化したリーシュマニア発現ベクターpLEXSY-sat2.1にライゲーションしました。クローニングした遺伝子を有する発現ベクターを大腸菌内で増殖させ、精製し、インサートの存在をコロニーPCRにより検証した。精製したプラスミドを直鎖化し、L. donovaniおよびL. panamensis寄生虫のトランスフェクションに使用した。遺伝子の組み込み性はPCRによって検証された。eGFP遺伝子の発現をフローサイトメトリーにより評価した。蛍光寄生虫を限界希釈によってクローニングし、蛍光強度が最も高いクローンをフローサイトメトリーを用いて選択した。
リーシュマニア属の原虫寄生虫は、広範囲の臨床症状を伴う疾患であるリーシュマニア症を引き起こす。この病気は98カ国で流行しており、年間発生率は0.9〜160万例と推定されています1。人間に病原性のあるリーシュマニア種は、2つの亜属、すなわちLに分けられます。(リーシュマニア)とL。(ヴィアンニア)。Lに属するいくつかの種による感染。L. donovaniやL. ininftumなどの(リーシュマニア)亜属は、内臓リーシュマニア症(VL)を引き起こす可能性があり、治療せずに放置すると致命的です2。Lに属する種。(Viannia)亜属は、中南米、特にパナマ、コロンビア、コスタリカの皮膚リーシュマニア症(CL)および粘膜皮膚リーシュマニア症(MCL)のほとんどの症例に関連しており、L.パナメンシスがこれらの臨床症状の主な病因物質です3,4。
五価アンチモン、ミルテフォシン、アムホテリシンBなどの薬剤を含む既存の抗リーシュマニア化学療法は、毒性が高く、高価です。さらに、ここ数十年間の薬剤耐性の増加は、世界中の患者の効果的な治療を妨げる要因に追加されています5。リーシュマニア属の種間、特に新世界と旧世界の種の間で、薬物感受性に関して実質的な違いが示されています6,7。これらの理由から、種固有のアプローチに特に注意を払いながら、新しい抗リーシュマニア薬の同定と開発に努力する必要があります。従来の方法論で医薬品候補の大規模なライブラリを研究することは、これらの方法論が細胞内アマスティゴテスに対する化合物の活性を評価するため、またはin vivo実験を実行するために非常に面倒であることを考えると、非常に困難です8。したがって、レポーター遺伝子の実装やハイコンテント表現型スクリーニングアッセイの開発など、これらの欠点を軽減する新しい技術を開発する必要がありました9。
レポーター遺伝子の使用は、ハイスループットおよびin vivoアッセイの開発を容易にするため、薬物スクリーニングプロセスの効率を高める可能性を示しています。いくつかのレポーター遺伝子を発現する組換えリーシュマニア寄生虫は、さまざまな研究グループによって生成されています。β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子は、エピソーマルベクターを用いていくつかのリーシュマニア種に導入されており、寄生虫の細胞外および細胞内形態での薬物スクリーニングには限られた有用性が示されています10,11,12,13,14,15.これらのアプローチには、エピソーム構築物の排除を避けるために培養中に強い選択圧が必要であること、およびレポーター遺伝子の活性を明らかにするための追加の試薬の使用が必要であるという制限があります。逆に、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびその変異体である増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)は、その柔軟性および感度、ならびにフローサイトメトリーまたは蛍光測定を用いたスクリーニングプロセスを自動化する可能性のために、in vitro薬物スクリーニングアッセイのための多数のトランスジェニックリーシュマニア株の生成に使用されてきた15、 16、17、18、19。有望な結果にもかかわらず、これらのトランスジェニック株の培養物は、GFP遺伝子のコピー数がすべての寄生虫で同じではなかったため、蛍光レベルが非常に不均一でした。さらに、蛍光を維持するには、GFP遺伝子がエピソーム構築物に導入されたため、培養中の寄生虫に対して一定の選択圧が必要でした。
前述の理由から、多くの努力が安定した組換え株を生産するための新しい方法論の開発に焦点を合わせてきました。これらの努力は、リボソーム遺伝子のより高い転写率を利用して、リボソーム遺伝子座へのレポーター遺伝子の統合に大きく依存してきました20。β-ガラクトシダーゼ21、IFP 1.4、iRFP22、tdTomato23をコードする遺伝子を組み込んだL. infantumおよびL. amazonensis株を作製し、薬物スクリーニングアッセイにおける有用性を評価しています。さまざまなグループが、相同組換えを介してそのコード遺伝子を18SリボソームRNA遺伝子座(ssu遺伝子座)に組み込むことにより、GFPを構成的に発現するL.ドノバニ株を開発しました24,25;それらは、細胞内アマスティゴテスを含むトランスフェクトされた集団において安定した均一なGFP発現を示し24,25、そしてそれらは薬物スクリーニングアッセイ24,25,26において首尾よく実施された。Bolhassaniら27は、組み込み導入遺伝子としてGFPを発現するL.メジャーおよびL.インファンタムの株を開発しました。彼らは、もともとL.タレントラエを宿主として使用するシステムにおけるタンパク質のトランスジェニック発現のために設計された組み込みベクターpLEXSYを使用しました28。pLEXSY-GFPベクターは、GFP24、25、27、29、30を構成的に発現する異なるリーシュマニア株の生成に非常に効率的であることが示されています。これらの寄生生物において、蛍光は均質であり、細胞内形態で維持され、感染したマウスの足蹠病変において検出することができる27。
本研究では、pLEXSYシステムを用いて、eGFPをコードする遺伝子を統合導入遺伝子として発現するL. パナメンシス 株および L.ドノバニ 株を作製するために使用される方法論について説明します。このプロセスで生成された菌株は、天然および合成起源の分子の潜在的な抗リーシュマニア活性を評価する薬物スクリーニングアッセイを実行するために私たちの研究室で使用されます。
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サンプルを無菌状態に保つために、寄生虫培養を含むすべてのステップは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)フード内で、または地域の健康と安全の規制に従って実行する必要があります。このプロトコルの概要を 図1に示します。

図1:pLEXSY-2.1ベクターファミリーを用いてeGFP発現L.パナメンシスおよびL.ドノバニ寄生虫を生成するためのプロトコルの要約スキーム。この記事で説明されている6つの主要なセクションすべてがここに描かれています。1)pLEXSY-2.1ベクターへのeGFP遺伝子の増幅と挿入:標的遺伝子を増幅し、酵素KpnIおよびBglIIの認識部位を追加し、eGFPアンプリコンとpLEXSYプラスミドの両方を両方の酵素で順次消化し、その後T4リガーゼとライゲーションします。2)pLEXSY発現プラスミドの直鎖化:pLEXSY+eGFPコンストラクトをSwaIで消化して、7〜8 kbpの発現カセットの直鎖化および精製を行います。3)トランスフェクションおよび4)ポリクローナル選択:リーシュマニア前鞭毛虫は、エレクトロポレーションによって発現カセットでトランスフェクトされ、組換え寄生虫の抗生物質選択のために培養に戻されます。寄生虫の蛍光はフローサイトメトリーで確認されます。5)ゲノム組込みの確認および6)限界希釈によるクローニング:pLEXSY-eGFP発現カセットの組込みは、発現カセットにハイブリダイズするフォワードプライマーおよび発現カセットに存在しない染色体配列にハイブリダイズするリバースプライマーを用いて、診断PCRによって確認される。トランスフェクトされた培養物は、限界希釈によるクローニングによって蛍光寄生虫を濃縮することができ、平均蛍光強度が最も高いクローンをさらなる用途のために選択することができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. pLEXSY-2.1ベクターへのeGFP遺伝子の増幅と挿入
2. pLEXSY発現プラスミドの線状化
3. エレクトロポレーションによるL. パナメンシス および L.ドノバニ のトランスフェクション
注: リーシュマニア 文化は、他の場所34に記載されているように行われます。本実施例では、 L. panamensis および L. donovani promastigotesをSchneider昆虫培地で培養し、20%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)および50 μg/mLゲンタマイシンを添加し、26°Cでインキュベートした。
4. 培養におけるポリクローナル選択
5. ゲノム統合の確認
注:pLEXSY-eGFP発現カセットの集積は、発現カセットにハイブリダイズするフォワードプライマー(使用するpLEXSY-2.1ベクターによって異なります)および発現カセットに存在しない染色体 ssu隣接配列にハイブリダイズするリバースプライマーF3002(5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3')を用いた診断PCRによって確認できます。本実施例では、F2999フォワードプライマー(5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3')をpLEXSY-sat2.1発現カセット内でハイブリダイズそのまま使用する。診断用PCRのための統合発現カセットおよびプライマーアニーリング部位の概略図を 図2に示す。

図2:統合式カセットの概略図。Chr−S(灰色)とラベル付けされたボックスは、発現カセットが組み込まれている18S rRNA遺伝子座(ssu)の隣接する染色体配列を表す。統合発現カセットは、ssu遺伝子座への相同組換えのための5'および3'配列(青)、タンパク質産生増強のための追加のリーシュマニアリボソームプロモーター(赤)、eGFP遺伝子(緑)、選択マーカー遺伝子(黄色)、および3つの非翻訳領域(薄い灰色)で構成されています)、すなわちutr1、2、および3は、リーシュマニア寄生虫におけるeGFPおよび選択マーカーの最適化された発現のための転写後mRNAプロセシングのためのスプライシングシグナルを提供します。コロニーPCRによるインサートの存在の検証(ステップ1.2.5)に使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーのアニーリング部位は、それぞれcpcr-fwd(EGFP1プライマー)およびcpcr-rev(A264プライマー)とラベル付けされた黒い矢印でマークされており、859 bpの産物を区切っています。診断用PCRによるゲノム組込みの検証(ステップ5)に使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーのアニーリングサイトは、それぞれsat-fwd(F2999プライマー)およびssu-rev(F3002プライマー)とラベル付けされた黒い矢印でマークされており、2,271 bpの産物を区切っています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
6. 限界希釈によるクローニング(オプション)
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pLEXSY-eGFPコンストラクトを構築し、コンピテント大腸 菌 細胞を形質転換した後、eGFPインサートを備えたコンストラクトを含むコロニーは、セクション1.2で説明されているコロニーPCRを実行した後、約859 bpの産物を生成します(図3A)。 SwaIを用いた陽性コロニーからの精製プラスミドの全消化は、ゲル電気泳動において2つの特徴的な断片、 すなわち大腸菌における複製および選択に必要なすべての要素を含むPLEXSYベクターの部分である2.9 kbp断片、およびトランスフェクションに使用される直鎖化発現カセットを表す7〜8 kpb断片を与えるべきである(図3B)。
トランスフェクション後、ポリクローナル選択はほぼ定性的に行われます。抗生物質による選択中の寄生虫培養の状態は顕微鏡で監視され、寄生虫の形態と運動性に特別な注意が払われます。トランスフェクトされた寄生虫の培養物の回収に成功した後、eGFPを効...
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様々なレポーター遺伝子の長所と短所は、いくつかの原虫寄生虫で研究されています。その中で、GFPとeGFPは本質的に蛍光であり、定量とイメージングが容易です。これらのタンパク質の蛍光活性は、蛍光顕微鏡、蛍光測定、またはフローサイトメトリーを用いた最小限の操作で検出できます。GFP発現Lを生成するための研究はほとんど行われていない。(Viannia)株は、旧世界リーシュマニア種15、16、18、24におけるレポーター遺伝子としてのGFPおよびその誘導体の堅牢性が実証されているにもかかわらず。Varela et al.37は、エピソーム導入遺伝子としてGFPを発現するL.パナメンシス株を開発した。軸状前鞭毛虫と細胞内無鞭毛虫の両方のフローサイトメトリー分析は、薬物スクリー...
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著者は開示するものは何もありません。
この作業は、パナマ州の国立科学技術(SENACYT)(助成金番号NI-177-2016)およびパナマ州の国立調査事務局(SNI)(助成金番号SNI-169-2018、SNI-008-2022、およびSNI-060-2022)によって資金提供されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 96ウェルマイクロプレート | コーニング | CLS3340 | 平底透明、黒色ポリスチレン、滅菌、蓋 |
| アガロース | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| アンピシリンナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra、細胞培養に適しています |
| BglII 制限酵素 | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units/mL |
| 細胞培養フラスコ | コーニング | CLS430168 | 表面積 25 cm2、カントネック、キャップ(プラグシール) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | 定休日 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 粉末、BioReagent、細胞培養に適した、昆虫細胞培養に適した、植物細胞培養に適した、≥99.5% |
| ウシ胎児血清 | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| ゲルローディングバッファー | Sigma-Aldrich | G2526 | 移動速度はゲル組成によって異なります。ロードする前に、サンプルで1:3〜1:6に希釈します。 |
| Gene Pulser Xcell エレクトロポレーションシステム | バイオ・ラッド | 1652660 | このシステムは、本体、2つのアクセサリーモジュール、キャパシタンスエクステンダー(CEモジュール)、パルスコントローラー(PCモジュール)、およびShockPodキュベットチャンバーで構成されています。 |
| Gene Pulser/MicroPulser エレクトロポレーションキュベット | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–ギャップ滅菌エレクトロポレーションキュベット、Gene PulserおよびMicroPulserシステムで使用するため、哺乳類およびその他の真核細胞 |
| Gentamicin溶液 | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg / mL 脱イオン水、液体、0.1 μmろ過、BioReagent、細胞培養に適した |
| GoTaqロングPCRマスターミックス | Promega | M4021 | |
| HEPES溶液 | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M、pH 7.0-7.6、滅菌ろ過、BioReagent、細胞培養に適しています |
| 倒立顕微鏡 | リンパス | IXplore Standard | |
| KpnI-HF制限酵素 | イングランドバイオラボR3142S | 4,000単位 20,000単位/mL | |
| LBブロス(寒天入り | Sigma-Aldrich | L3147 | 参照の栄養豊富な微生物増殖粉末培地(寒天培地入り、レギュラー 大腸菌 文化。 |
| LBブロス | Sigma-Aldrich | L2542 | 液体微生物増殖培地 |
| Mini-Sub Cell GT 水平電気泳動システム | Bio-Rad | 1640300 | ミニ水平電気泳動システム、8 ウェルおよび 15 ウェルコーム、7 cm x 10 cm UV透明トレイを含む |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | 50 塩基配列 |
| pLEXSYcon2.1 発現キット | イエナBioscience | EGE-1310sat | 統合的構成発現ベクターpLEXSY-sat2.1が含まれています。ヌルセオトリシン(NTC、clonNAT)によるトランスフェクタントの抗生物質選択。診断用PCRおよびシーケンシング用のすべてのプライマーが含まれています。 |
| 塩化カリウム | ミリポア | 529552 | 分子生物学グレード - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μ3 mL培養物からのトランスフェクション対応プラスミドのg。 |
| シュナイダー&プライム;昆虫培地 | Sigma-Aldrich | S0146 | 当研究室でリーシュマニアの培養に使用している培地です。 |
| SOCミディア | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| 塩化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S3014 | 分子生物学、DNase、RNase、およびプロテアーゼ用、検出なし、≥99% (滴定) |
| リン酸ナトリウム二塩基性 | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent、細胞培養、昆虫細胞培養、&;99.0%, Freeflowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| シリンジフィルター | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm、細孔径0.2 μm |
| T100 サーマルサイクラー | バイオ・ラッド | 1861096 | サーマルサイクラーシステムには、96 ウェルサーマルサイクラー、電源コード、チューブサポートリングが含まれています |
| T4 DNA リガーゼ | プロメガ | M1801 | つの DNA ストランドを結合 |
| トリス-ホウ酸-EDTA バッファー | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent、電気泳動に適しています、10× 濃縮 |
| ウィザードゲノム DNA精製キット | Promega | A1120 | |
| Wizard SV ゲルおよびPCRクリーンアップシステム | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL.F'エピソーム上のカナマイシン耐性遺伝子を特徴とし、クロラムフェニコール耐性ベクターの非常に要求の厳しいクローニングを実現します。効率:> 5 x 10 9トランスフォーマー/マイクロ;g pUC18 DNA。 |
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