細胞表面プロテオームのラベルフリー定量のための「Cell Surface Capture」ワークフロー

Summary

ここでは、さまざまな細胞タイプの細胞表面プロテオームの特性評価のためのプロテオミクスワークフローについて説明します。このワークフローには、細胞表面タンパク質の濃縮、その後のサンプル調製、LC-MS/MSプラットフォームを使用した分析、および専用ソフトウェアによるデータ解析が含まれます。

Abstract

過去10年間で、質量分析ベースのプロテオミクスは、幅広いアプリケーションにわたる生物学的システムの詳細な特性評価を可能にしました。ヒト疾患における細胞表面プロテオーム(「サテローム」)は、原形質膜タンパク質がほとんどの臨床的に承認された治療薬の主要な標的であり、疾患細胞と健康な組織を診断的に区別するための重要な特徴であるため、非常に興味深いものです。しかし、細胞の膜タンパク質と表面タンパク質の焦点を絞った特性評価は、主に細胞溶解物の複雑さにより、依然として困難であり、これは他の高存在量タンパク質によって目的のタンパク質をマスクします。この技術的な障壁を克服し、質量分析プロテオミクスを使用してさまざまな細胞タイプの細胞表面プロテオームを正確に定義するには、質量分析計で分析する前に、細胞表面タンパク質の細胞溶解物を濃縮する必要があります。この論文では、がん細胞由来の細胞表面タンパク質の標識、細胞溶解物からのこれらのタンパク質の濃縮、およびその後の質量分析のためのサンプル調製の詳細なワークフローを示しています。

Introduction

タンパク質は、細胞機能の大部分が実行される基本的な単位として機能します。関連するタンパク質の構造と機能を特徴づけることは、生物学的プロセスを理解するために不可欠なステップです。過去10年間で、質量分析技術、分析ソフトウェア、データベースの進歩により、プロテオーム全体のスケールでのタンパク質の正確な検出と測定が可能になりました¹。質量分析ベースのプロテオミクスは、生化学的経路の基礎科学解析から、トランスレーショナル環境での新規薬物標的の同定、臨床における疾患の診断とモニタリングまで、さまざまなアプリケーションで利用できます²。新規創薬標的のスクリーニングでは、細胞表面プロテオームの特性評価が特に重要であり、現在承認されているヒト薬剤の65%以上が細胞表面タンパク質^{3を標的としています}。がん免疫療法の分野も、がん特異的な細胞表面抗原に完全に依存して、腫瘍細胞を標的とし、特異的に排除します⁴。したがって、質量分析ベースのプロテオミクスは、治療介入に向けた新しい細胞表面タンパク質を特定するための有望なツールとして役立ちます。

しかし、従来のプロテオミクス法を利用して腫瘍細胞の新規細胞表面タンパク質標的を調査する際には、いくつかの制限があります。主な懸念事項は、表面タンパク質が細胞内の全タンパク質分子のごく一部を占めていることです。したがって、これらのタンパク質のフラグメントは、全細胞ライセートの質量分析を行う際に、細胞内タンパク質^5の大量にマスクされます。この制限により、従来のプロテオミクスワークフローで細胞表面プロテオームを正確に特性評価することは困難です。この課題に対処するには、質量分析計で分析する前に、全細胞ライセートから細胞表面タンパク質を濃縮する方法を開発する必要があります。そのような方法の1つは、無傷の細胞内のグリコシル化細胞表面タンパク質の酸化およびビオチン標識、およびその後、ニュートラアビジンプルダウンによるライセートからのこれらのビオチン化タンパク質の濃縮を含む、このプロセスは「細胞表面捕捉」^{6と呼ばれています}。哺乳類の細胞表面タンパク質の~85%がグリコシル化されていると考えられているため⁷、これは全細胞ライセートから細胞表面プロテオームを濃縮する効果的な方法として機能します。この論文では、培養細胞から始まり、細胞表面ビオチンの標識、およびその後の質量分析分析のためのサンプル調製(図1)の完全なワークフローについて説明します。この方法では、数回の繰り返しにわたって、特定のサンプルの細胞表面プロテオームをしっかりとカバーできます。この方法を利用して腫瘍細胞と健常細胞の両方の細胞表面プロテオームを特徴付けることで、新しい細胞表面抗原の発見を促進し、潜在的な免疫療法ターゲットを特定できます⁸。

Protocol

注:この細胞表面プロテオーム実験には、AMO1形質細胞腫細胞を使用しました。同じプロトコルは、さまざまな浮遊細胞株や接着細胞株⁹、さまざまな種類の一次サンプル^{10など、他の細胞タイプにも使用できます}。ただし、細胞数(実験の出発物質)は、通常、同等のプロテオームカバレッジに最適化する必要があります。材料・備品については、資料表をご覧ください。バッファーと試薬溶液、およびそれらの組成に関する詳細については、表1を参照してください。

1. ビオチンによる細胞表面標識

1. 培養細胞をカウントし、遠心分離(500 × g、24°Cで5分)により、約3.5×10個の⁷つの生細胞をペレット化します
   注:AMO1形質細胞腫細胞は、収穫前に3日ごとに新鮮な培地で継代しました。
2. 上清を吸引し、1 mLの冷(4°C)ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)(カルシウム、マグネシウムなし)を加え、ピペッティングで静かに上下させて、ペレットを再懸濁します。
3. 細胞を再度ペレット化し(ステップ1.1と同様)、洗浄ステップ(ステップ1.2)をもう一度繰り返します(合計2回の洗浄)。
4. 2回目の洗浄後、細胞をペレット化し(ステップ1.1と同様)、ピペッティングで静かにピペッティングして990 μLの冷D-PBSに再懸濁します。
5. 160 mMメタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO₄)の原液をあらかじめ調製してください。50 μLアリコートに分割し、-20°Cで最大6か月間保存します。ステップ1.4で10 μLの160 mMメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を細胞懸濁液に加え、十分に混合し、エンドツーエンドローターで4°Cで20分間インキュベー
トします。
6. インキュベーションが完了したら、細胞をペレット化し(ステップ1.1と同様)、上清をデカントし、1 mLの冷D-PBSに再懸濁します。この洗浄手順を2回繰り返します(合計3回の洗浄)。3回目の洗浄後、細胞を989μLのD-PBSに再懸濁します。
7. 事前に100 mMバイオシチンヒドラジドの原液を調製してください。50 μLアリコートに分割し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。ステップ1.6で1 μLのアニリンと10 μLの100 mMバイオシチンヒドラジドを細胞懸濁液に加え、十分に混合し、エンドツーエンドローターで4°Cで60分間インキュベートします。
8. インキュベーションが完了したら、細胞をペレット化し(ステップ1.1と同様)、上清をデカントし、1 mLの冷D-PBSに再懸濁します。この洗浄手順を2回繰り返します(合計3回の洗浄)。
9. 3回目の洗浄後、ピペットで上清を慎重に吸引し、チューブを液体N₂に入れて細胞ペレットを急速凍結します。凍結したペレットを-80°Cに置き、溶解とプルダウンの準備ができるまで
置きます。

2. 細胞溶解とビオチンプルダウン

1. 凍結した細胞ペレットを氷の上で解凍します。
2. ペレットに500 μLの2倍溶解バッファーを加え、十分に混合し、ボルテックス30 s.
   注:ペレットを完全に溶解するには、激しいピペッティングとボルテックスが必要になる場合があります。一部の不溶性の破片(すなわち、DNA)は、その後の超音波処理ステップで除去されるため、許容されます。
3. 細胞溶解物を氷上で超音波処理します(3回のバースト、各20秒、60%デューティサイクル)。
4. ライセートを遠心分離して、残っている破片をペレット状にします(4°Cで17,200 × gで10分間)。
5. ライセートを遠心分離している間に、100 μLのニュートラアビジンアガロース樹脂ビーズをろ過カラムに加えます。カラムをバキュームマニホールドに取り付け、やさしいバキュームを塗布し、3 mLのウォッシュバッファー1をビーズに流してビーズを洗浄します。
6. バキュームマニホールドからろ過カラムを取り外し、底部にキャップをして、清澄化した細胞ライセートをビーズでカラムに加えます。カラムの上部にキャップをし、ライセートをビーズとエンドツーエンドのローターで4°C.
   で120分間インキュベートします。 注:カラムの上部にキャップをするときは、下部キャップを所定の位置にしっかりと保持してください。そうしないと、キャップが外れてインキュベーション中に細胞溶解液が漏れる可能性があります。
7. 洗浄バッファー 1、2、3 (サンプルあたり各洗浄バッファー約 5 mL、表 1 を参照) を調製し、42 °C のウォーターバスに入れます
8. ライセートのインキュベーションが終了したら、ろ過カラムを真空マニホールドに戻し、穏やかな真空を適用し、5 mLの洗浄バッファー1をビーズに流してビーズを洗浄します
   注:5 mLを超える洗浄バッファーを洗浄に使用できます。余分な洗浄により、ビーズへのバックグラウンドの非特異的結合が減少する可能性があります。
9. 5 mLの洗浄バッファー2で洗浄ステップを繰り返します。
10. 5 mLの洗浄バッファー3で洗浄ステップを繰り返します。
11. 最終的な洗浄バッファーがビーズ全体に流れたら、カラムをマニホールドから取り外します。ビーズに100 μLの「Lyse」溶液を加え、ピペット付きの1.7 mLの低タンパク質結合性微量遠心チューブに移します。チューブを短時間回転させてビーズを沈殿させ、沈殿したビーズを乱さずに溶液を50μL取り出します
    注:このステップおよび後続のすべてのステップの試薬は、市販のプロテオミクスサンプル調製キットを使用します。このキットは、最適化され、簡素化されたサンプル調製ワークフローを提供します。ただし、これらのステップは、Verma et al.^{9で説明されている従来のプロテオミクスワークフローを使用して、キットとは無関係に実行することもできます}。ビーズがカラムの側面または底部に付着したままの場合は、チューブに移されたビーズが沈殿するのを待ち、チューブ内の追加の「Lyse」溶液を使用して残りのビーズを移します。
12. チューブを65°Cのヒートブロック/シェーカーに置き、1,000rpmで10分間振とうします
    注:このステップは、消化前のシステイン残基の還元とアルキル化に必要です。

3. タンパク質の消化

1. 乾燥したトリプシン(キット内の「Digest」チューブ、-20°Cで保存)を210μLの「再懸濁」溶液を加えて再懸濁します。溶液を数回上下にピペッティングして、乾燥したトリプシンがすべて再懸濁されていることを確認します。
2. インキュベーションが完了したら、再懸濁したトリプシン溶液50 μLをビーズに加えます。チューブを37°Cでインキュベートし、500rpmで少なくとも90分間振とうしてタンパク質を消化します。
3. 消化が完了したら、ビーズを含む溶液をスピンカラムに移し、1.7 mLの低タンパク質結合性微量遠心チューブにカラムを挿入します。チューブ(500 × g、室温[RT]で5分間)を回転させ、ビーズから消化したペプチド溶液を分離します
   注:この段階では、ビーズがペプチド溶液から分離されたら、ビーズに対してPNGase処理を行い、ストレプトアビジンビーズからビオチン化ペプチドフラグメントを溶出させることができます。このペプチドサンプルは、ビーズトリプシン処理による一次サンプルと分析および比較できる別の二次ペプチドサンプルとして、ワークフローの残りの部分に持ち込むことができます。PNGaseアプローチは、MS検出可能な側鎖修飾^{12に基づく捕捉されたN-グリコシル化アスパラギンに対する追加の特異性を考えると、オンビーズトリプシン化を補完するデータを提供する可能性があります}。ただし、このシーケンシャル溶出アプローチの欠点は、サンプル分析ごとに質量分析計の装置時間が2倍になることです。
4. 「Stop」溶液100μLを加えて消化反応を停止し、ペプチド溶液を酸性化します。

4. ペプチド脱塩

1. チューブアダプターを使用して、1.7 mLの低タンパク質結合性微量遠心チューブに脱塩カラムを配置します。酸性化ペプチド溶液全体をカラムに加えます。カラム(3,800 × gで3分間)を回転させ、溶液がカラム内を流れるようにします。これで、ペプチドがカラムに結合しました。フロースルーを破棄します。
2. 200 μL の「Wash 1」溶液をカラムに加え、遠心分離します (3,800 × g で 3 分間、RT)。フロースルーを破棄します。
3. 200 μLの「Wash 2」溶液をカラムに加え、遠心(3,800 × gで3分間、RT)。フロースルーを破棄します。
4. カラムを新しい標識1.7 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。100 μLの溶出液をカラムに加え、遠心(3,800 × gで3分間、RT)します。さらに100 μLの溶出液をカラムに加え、遠心(3,800 g、3分間、RT)します(3,800 × g、RT)。これで、ペプチドがカラムからチューブに溶出されます。
5. ペプチド溶液を真空遠心分離機に入れ、一晩乾燥させます。乾燥させたペプチドを定量する準備ができるまで-80°Cに置き、質量分析計で分析します。

5. ペプチドの再懸濁と定量

1. 乾燥させたペプチドを20 μLの溶媒A(0.1%ギ酸、2%アセトニトリル)に再懸濁します。
2. 再懸濁したペプチド(17,200 × gで10分間)を遠心分離し、不溶性の破片をペレット化します。
3. 比色ペプチド定量アッセイ用のペプチド標準液を調製します。
   1. 1,000 mg/mLペプチドストック溶液5 μLを96ウェルプレートの1ウェルに入れます。
   2. 1,000 mg/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625 mg/mL の各標準試料を 5 μL ずつ、プレート内で脱イオン水(DI)水で 7 段階の段階希釈を行います。ブランクの8番目のウェルに5μLのDI水を入れます。
4. 4 μL の DI 水を 96 ウェルプレートの 3 つの別々のウェルに入れます。再懸濁したペプチド溶液1 μLを各ウェルに加え、総容量5 μL.
   注:定量のためにペプチド溶液をピペッティングするときは、沈殿した破片が邪魔されないように、溶液の上部から慎重にピペッティングしてください。
5. 必要な作業試薬の量を計算します(ウェルあたり45μLが必要)。比色アッセイ用試薬の必要量を調製します。作業試薬をボルテックスして、成分の適切な混合を確保します。
6. 45 μLの作業試薬を標準ウェルとサンプルウェルのそれぞれに加えます
   注:標準を複製し、マルチチャンネルピペットを使用して、試薬がウェルに追加されるタイミングの違いを最小限に抑えるようにします。
7. プレートをアルミホイルで覆い、37°Cで15分間インキュベートします。
8. 自動プレートリーダーでプレートを分析します。標準サンプルに記録された吸光度値を使用して、線形標準曲線を生成します。標準曲線とR²値の式を決定します。R² 値が妥当な値(≥0.95)である場合は、標準曲線を使用して再懸濁ペプチドの濃度を決定し、比色分析プレートの 5 倍希釈を考慮します。

6. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)による消化ペプチドの解析

1. 溶媒Aを添加してペプチドサンプルの濃度を0.2 μg/μLに調整し、10 μLを0.6 mLの低タンパク質結合チューブに移します。
2. チューブをLCオートサンプラーに入れます。
3. 図 2 および図 3 および<図 3 に従って、LC および MS/MS パラメータを設定します>。
4. 5 μL (1 μg) のペプチドサンプルを LC-MS/MS セットアップに注入して分析します><。 注:ここに示されているLC-MS/MS設定は、図の代表的なものにすぎません。LCおよびMS装置の可用性に応じて、LCグラジエントおよびMS/MSパラメータの設定を変更して、深いプロテオームカバレッジを得ることができます。この論文では、MaxQuant https://www.maxquant.org/ を使用してMSデータ解析を行い、Perseus https://maxquant.net/perseus/ を使用して二次データ解析を行い、https://reactome.org/ を使用してパスウェイ解析を行いました。

Results

この実験では、無傷の細胞のN-グリコシル化膜タンパク質をビオチンで標識し、全細胞溶解物からこれらの標識タンパク質をニュートラアビジンプルダウンで濃縮することにより、腫瘍細胞株の細胞表面プロテオームを特徴付けました(図1)。さらに、LC-MS/MS を用いたプロテオーム解析を行い、濃縮された細胞表面タンパク質の特性評価を行いました。全細胞プロテオーム解析とは異なり、ここでは細胞表面タンパク質のみを特徴付けることが目的でした。したがって、3.5 × 10⁷ AMO-1形質細胞腫細胞のサンプルインプットから始めました。比色ペプチド定量アッセイに基づいて、~630 ng/μLの最終ペプチド濃度が得られ、総収率は~12.6 μg(20 μL中)でした(図2A)。次に、1 μg のペプチドサンプルを LC-MS/MS システムに注入し、注入を 3 回繰り返してテクニカルレプリケートを行いました。使用した LC パラメータと MS パラメータは、以前の実験 (

Discussion

質量分析ベースのプロテオミクスは、これまで不可能だった規模で何千もの未知のタンパク質の偏りのない特性評価を可能にした強力なツールです。このアプローチにより、特定のサンプルに存在するさまざまなタンパク質を特徴付けることにより、タンパク質を同定および定量するだけでなく、細胞や組織の構造能力とシグナル伝達能力に関するさまざまな洞察を収集することができます。質量分析により、サンプル中の全体的なタンパク質プロファイリングを超えて、これらのタンパク質のさまざまな翻訳後修飾(PTM)を特徴付けることができ、DNAまたはRNAレベル¹での分析では利用できないシグナル伝達経路とタンパク質ダイナミクスの段階をさらに深く垣間見ることができます。新しいがん治療薬の開発に向けて、質量分析ベースのプロテオミクスにより、悪性腫瘍細胞と健康な組織のタンパク質プロファイルを比較し、潜在的な創薬可能な標的を特定することができます。

急速に成長しているがん免疫療法の分野は、悪性細胞の表面に発現する抗原に依存して腫瘍を特定し、選択的に破壊します。新しいがん免疫療法の開発は...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kits
96X iSTサンプル調製キット	PreOmics	P.O.00027	プロテオミクスサンプル調製キット。還元、アルキル化、消化用の試薬が含まれています。また、脱塩カラムと試薬も含まれます。
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo	23275	ペプチド定量キット。ペプチド標準品および作業試薬の成分が含まれています。
試薬
アセトニトリル	フィ	ッシャーA955-1
炭酸アンモニウム	ポアシグマ	09830-1KG
バイオシチンヒドラジド	ビオチウム	90060D-PBS
(カルシウムおよびマグネシウム塩なし)	UCSF細胞培養施設	CCFAL003-225B01
ギ酸	ハネウェル社	94318
HALT プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 シングルユースカクテル	サーモ	1861280
大容量ニュートラアビジン アガロース樹脂	サーモ	29204
リン酸緩衝生理食塩水	UCSF 細胞培養施設	CCFAL001-22J01
RIPA 溶解バッファー、10x	ミリポアシグマ	20-188
塩化ナトリウム	フィッシャー	BP358-212
メタ過ヨウ酸ナトリウム	アルファ エーザー	13798
トリパン ブルーステイン (0.4%)	Gibco	15250-061
超高純度 0.5 M EDTA、pH 8.0	Invitrogen	15575-038
尿素 (プロテオミクスグレード)	VWR	M123-1KG
強力>機器
TC20 自動セルカウンター	バイオ・ラッド	1450102
PrismR 微量遠心分離機	Labnet International	C2500-R-230V
超音波処理機	VWR	Branson Sonifier 240
真空マニホールド	Promega	Promega Vac-Man
Shaking Heatblock	Eppendorf	Eppendorf Thermomixer C
エンドツーエンドローテーター	Labnet	リボルバー アジャスタブルローテーター
LC	Thermo	Ultimate 3000 HPLC and UHPLC
Q Exactive Plus ハイブリッド四重極 Orbitrap 質量分析計	Thermo	IQLAAEGAAPFALGMBDK
マイクロプレートリーダー	Biotek	Biotek Synergy 2
真空濃縮器	Labconco	7810010
Supplies
1.5 mL Protein LoBind Tubes	Eppendorf	22431081
1.7 mL Microcentrifuge Tubes
Filtration Columns	Bio-Rad	7326008
Spin	Columns Thermo	69725